1398酶米氏常数Km的测定
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
无色
1398酶
酪氨酸
蓝色
• 可通过分光光度法测定产物Tyr的含量，求出反应速 度v。
试剂和器材
试剂
三氯醋酸（TCA）
器材
试管27支，试管架
Na2CO3
2%酪蛋白溶液
5ml移液管
50ml和100ml容量瓶 研钵、恒温水浴 分光光度计
0.02M磷酸缓冲液(PH7.5)
福林试剂
实验方法
酶液的准备
称1398蛋白酶1g 倒入小烧杯中，加 入少量PBS缓冲液 和细沙
0.92 1 0.9 1 0.85 1 0.8 1
40 ℃ ，pH7.5，10min TCA 2ml 40 ℃ ，10min，过滤 滤液（ml） Na2CO3（ml） 福林试剂（ml） 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1
40 ℃ ，20min，显色
用研钵磨碎
定容至100ml
取1ml定容至50ml
过滤
40℃保温15分钟
0 酪蛋白浓度（mg/ml) 酪蛋白体积（ml） PBS（ml） 酶液 0 0 1 1
百度文库1 1.6
2 2
3 3
4 4
5 5 0.25 0.75 1
6 6 0.3 0.7 1
7 7 0.35 0.65 1
8 8 0.4 0.6 1
实验方法 0.08 0.1 0.15 0.2
双倒数作图法
这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：
测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。
1 Km 1 1 v Vm [ S ] Vm
以1/v对1/[S]作图，可得一条直线
1/v
1/Vm -1/Km 1/[S]
• 本实验测定1398酶催化底物酪蛋白水解的Km。 • 反应式：酪蛋白+PBS
Vm [ S ] v K m [S ]
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数
米氏常数Km
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数。对于 每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定 的Km值，因此可用于鉴别酶。 同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏 常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和 力的强弱。
OD650nm
数据处理
• 各管在分光光度计测定波长650nm的OD值 (OD650nm)。从对Tyr标准曲线上查出 OD650nm相当于产物对Tyr的含量(g数)
• 计算出各种底物浓度下的速度v，取倒数1/v填 入表内。 V=Tyr微克数X4/10 1/v=1X2.5/Tyr微克数
结果计算
• 以1/v对1/[S]作图，求出1398酶催化酪蛋白水解的米 氏常数Km。 单位：mol/L
1 2 0.5 3 4 5 0.2 6 0.167 7 0.143 8 0.125
1/[s] 1/v
0.625
0.333 0.25
值日生
1398酶米氏常数Km的测定
实验目的
掌握米氏常数Km和Vmax测定的基本原理； 学习米氏常数Km值测定的方法； 测出1398酶以酪蛋白为底物时的米氏常数 Km。
米氏常数Km
• 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有 很大的影响。
• 酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
• 推导出米氏方程为：
1398酶
酪氨酸
蓝色
• 可通过分光光度法测定产物Tyr的含量，求出反应速 度v。
试剂和器材
试剂
三氯醋酸（TCA）
器材
试管27支，试管架
Na2CO3
2%酪蛋白溶液
5ml移液管
50ml和100ml容量瓶 研钵、恒温水浴 分光光度计
0.02M磷酸缓冲液(PH7.5)
福林试剂
实验方法
酶液的准备
称1398蛋白酶1g 倒入小烧杯中，加 入少量PBS缓冲液 和细沙
0.92 1 0.9 1 0.85 1 0.8 1
40 ℃ ，pH7.5，10min TCA 2ml 40 ℃ ，10min，过滤 滤液（ml） Na2CO3（ml） 福林试剂（ml） 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1
40 ℃ ，20min，显色
用研钵磨碎
定容至100ml
取1ml定容至50ml
过滤
40℃保温15分钟
0 酪蛋白浓度（mg/ml) 酪蛋白体积（ml） PBS（ml） 酶液 0 0 1 1
百度文库1 1.6
2 2
3 3
4 4
5 5 0.25 0.75 1
6 6 0.3 0.7 1
7 7 0.35 0.65 1
8 8 0.4 0.6 1
实验方法 0.08 0.1 0.15 0.2
双倒数作图法
这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：
测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。
1 Km 1 1 v Vm [ S ] Vm
以1/v对1/[S]作图，可得一条直线
1/v
1/Vm -1/Km 1/[S]
• 本实验测定1398酶催化底物酪蛋白水解的Km。 • 反应式：酪蛋白+PBS
Vm [ S ] v K m [S ]
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数
米氏常数Km
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数。对于 每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定 的Km值，因此可用于鉴别酶。 同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏 常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和 力的强弱。
OD650nm
数据处理
• 各管在分光光度计测定波长650nm的OD值 (OD650nm)。从对Tyr标准曲线上查出 OD650nm相当于产物对Tyr的含量(g数)
• 计算出各种底物浓度下的速度v，取倒数1/v填 入表内。 V=Tyr微克数X4/10 1/v=1X2.5/Tyr微克数
结果计算
• 以1/v对1/[S]作图，求出1398酶催化酪蛋白水解的米 氏常数Km。 单位：mol/L
1 2 0.5 3 4 5 0.2 6 0.167 7 0.143 8 0.125
1/[s] 1/v
0.625
0.333 0.25
值日生
1398酶米氏常数Km的测定
实验目的
掌握米氏常数Km和Vmax测定的基本原理； 学习米氏常数Km值测定的方法； 测出1398酶以酪蛋白为底物时的米氏常数 Km。
米氏常数Km
• 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有 很大的影响。
• 酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
• 推导出米氏方程为：