染色体步移技术

螺旋讲堂2010年第4期总第23期染色体步移内容概览：一、染色体步移技术概述二、常见的染色体步移技术介绍1、结合基因组文库的染色体步移技术1）物理剪切法构建亚克隆文库2）限制性内切酶法构建亚克隆文库2、基于PCR 技术的染色体步移技术1）连接成环PCR 2）外源接头介导PCR（1）连接载体的PCR（2）连接单链接头的PCR（3）连接双链接头PCR3）半随机引物PCR 策略（1）新Alu-PCR（2）DW-ACP TM PCR（3）热不对称交错PCR （TAIL-PCR ）三、染色体步移技术之TAIL-PCR1、TAIL-PCR 的原理2、TAIL-PCR 的优点以及技术难点3、TAIL-PCR的操作流程4、TAIL-PCR 中的注意事项5、常见问题分析生物人的网上家园plum螺旋网HelixNet 染色体步移技术是一种常用的克隆已知片段旁侧序列的技术。

本文中主要总结了近年来染色体步移技术的发展情况，介绍了结合基因组文库的染色体步移技术和基于PCR 的染色体步移技术，并且比较了他们之间的优缺点，最后着重与大家一起讨论一下TAIL-PCR 的相关内容，希望能对大家有所帮助。

一、染色体步移技术概述染色体步移(Chromosome walking)又称为基因组步移（Genome walking）是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法。

对于已经完成基因组测序的模式生物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等)，可直接从数据库中轻松的找到已知序列的侧翼序列。

但是目前为止，自然界中大多数生物基因组DNA序列仍未知，要想知道一个已知区域两侧的DNA序列，染色体步移无疑是一种非常有效的方法。

因此，染色体步移技术在现代分子生物学研究中较为重要，本文主要就染色体步移的相关方法，不同方法之间的比较，着重以TAIL-PCR的原理，实验操作及注意事项等进行讨论。

染色体步移技术的主要应用可归结为以下5个方面：（1）鉴定T—DNA或转座子的插入位点，鉴定转基因技术所导致的外源基因的插入位点；（2）根据基因的已知片段、EST或插入的转座子序列克隆目的基因，分离基因的启动子及调控元件；（3）用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接；（4）构建图位克隆中的重叠群；（5）转化标记辅助育种中的STS或SCAR标记等。

二、常见的染色体步移技术介绍目前，分离侧翼序列的染色体步移方法主要有两种，一是结合基因组文库为主要手段的染色体步移技术，构建基因组文库进行染色体步移尽管步骤比较繁琐，但是适于长距离步移，可以获得代表某一特定染色体的较长连续区段的重叠基因组克隆群。

随着亚克隆文库条件构建条件的优化及测序技术的进步，这种方法也将更加快捷，准确。

另一个是基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术。

基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术步移距离相对较短，但是操作比较简单，尤其适合于已知一段核苷酸序列的情况下进行的染色体步移。

在此基础上人们相继发明了十几种侧翼序列克隆的方法，依据其技术原理，可以将这些方法分为3类：连接成环PCR、外源接头介导PCR和半随机引物PCR。

1、结合基因组文库的染色体步移技术基因组文库是指生物体全部DNA，经过合适的核酸内切酶消化或机械切割以后，克隆到适当的载体分子中，构成重组体分子群体，然后转化给诸如大肠杆菌这样的寄主菌株进行复制繁殖，如此构建的理论上含有生物体整个基因组全部遗传信息的克隆集合体，称作基因组文库，它是进行基因组学研究的重要技术平台，在基因组物理图谱的构建以及基因的图位克隆中发挥了重要作用。

基因组文库的种类主要有入噬菌体文库、酵母人工染色体文库(yeast artificial chromosome，YAC)、P1噬菌体文库和细菌人工染色体文库(bacterial artificial chromosome，BAC)等。

其中，BAC文库因其插入片段大、嵌合率低、遗传稳定性好、易于操作等优点而备受青睐，近年来，小麦、棉花、水稻等越来越多的物种构建了BAC文库。

在基因克隆中，该方法用于鉴定一系列彼此重叠的DNA限制片段，分离序列及表达产物未知的基因，特别是发育相关的基因。

利用基因组文库克隆目的基因，首先要有一个根据目的基因建立起来的遗传分离群体，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，然后用遗传作图将目的基因定位在染色体的特定位置，找到与目的基因紧密连锁的分子标记。

构建含有插人大片段DNA的基因组文库(BAC或YAC)，以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库，鉴定出分子标记所在的大片段克隆，再以该克隆为染色体步移的起点，用外侧克隆末端作为探针筛选基因组文库，分离新的重叠克隆用获得的阳性克隆，多次重复上述步骤，逐渐逼近目的基因，构建目的基因区域的重叠群。

随后通过亚克隆文库获得含有目的基因的小片段克隆，最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。

目前构建亚克隆文库比较常用的DNA片段化方法主要有两种：物理剪切法和限制性内切酶法。

1）物理剪切法构建亚克隆文库将大片段的BAC DNA通过物理方法变成目标大小的小片段，可以用超声波处理，也可以用DNA片段剪切仪。

传统的超声波处理方法具有操作简单，快速的优点，但是不同的超声波具有不同的性能，需要摸索最佳的处理条件才能达到理想的效果。

然而利用DNA片段剪切仪，通过调节剪切头中注射器上下移动的速度来控制目标片段剪切的程度，具有目标片段集中、方便、稳定性高的优点。

物理剪切法构建大片段DNA 亚克隆文库，优点是对于具有复杂二级结构的大片段BAC DNA可以通过构建高覆盖率的亚克隆文库获得完整的核苷酸序列，缺点是需要提取高质量BAC DNA、步骤繁琐，剪切后的限制性片段与载体连接一般要求过夜，所需时间较长，且技术要求高，成本较高。

2）限制性内切酶法构建亚克隆文库末端半补齐(partial-filling)原是为某些不相容的酶切末端能彼此连接而设计的一项技术。

Zabarosky等首先将其应用于以噬菌体为载体的基因文库构建中，以后逐渐有人将这一技术应用于以质粒为载体的基因文库构建中，使文库转化子中重组子的比例由单酶切连接的10％提高到70％以上，极大减小了文库筛选的工作量。

首先利用限制性内切酶Sau3AI对制备的2709染色体DNA做部分酶切，回收2～9kb的片段，并用dATP、dGTP由大片段酶将末端5'-GATC-3'补上两个碱基，但仍留有两个碱基的5突出末端(5'-GA-3')，文库载体pUC18则用SalI酶切后用dCTP、dTTP由大片段酶做末端半补齐，相连接后转化宿主菌(见图1)，共获得3×10个转化子，插入片段大小分布在2～7kh之间，重组子高达70％以上，并且从所构建的文库中成功筛选到2709碱性蛋白酶的编码基因。

在亚克隆文库的构建方面引入末端半补齐技术，彻底消除了载体自环化的可能性，只有在相应的外源片段插入后，才能形成环化产物，因此极大提高了连接产物中重组质粒的比例，使组成基因文库的总转化子数目大大减少，减轻文库筛选的工作量；而且经末端半补齐的插入片段其自身末端也失去了彼此问退火的能力，因而消除了插入片段自身相互连接的可能性，保证了基因文库中克隆基因的真实性。

同传统碱性磷酸酯酶法相比较，采用半补齐技术处理的连接产物为完整的共价闭环质粒，不象碱性磷酸酯酶法那样留有缺口，因而半补齐法的连接产物转化率不受影响；而且在技术操作上半补齐法并不比碱性磷酸酯酶法复杂。

当然，通过末端半补齐得到的连接产物，其连接处的酶切位点一般均被破坏，但是这一缺点对于构建基因文库并不构成特别的影响。

2、基于PCR技术的染色体步移技术PCR技术自发明以来，发展突飞猛进，Ochman等在此基础上发明了反向PCR，并首次应用于基因组染色体步移。

自此以后的20年中，先后有十几种扩增未知序列的染色体步移方法的报道。

这些方法都有独特的技术特点以及特定的应用环境，但根据其技术原理，这些方法体现了3种主要的策略：连接成环PCR 策略，外源接头介导PCR策略和半随即引物PCR策略。

1）连接成环PCR反向PCR(Inverse—PCR，I-PCR)是连接成环PCR策略最为典型的代表，是Triglia等在常规PCR基础上提出的扩增位于靶DNA区段两侧未知序列的一种PCR方法，此法选择的引物虽与已知DNA序列互补，但是引物延伸的方向与常规PCR相反(图2)。

反向PCR成功与否的关键在于限制性片段分子内成环的效率，选择一个已知序列中没有的限制性内切酶对DNA进行酶切，用连接酶将限制性片段自身环化做模板，根据已知序列末端设计反向引物进行PCR，即可获得两侧未知核苷酸序列。

反向PCR成败的影响因素主要有两个方面：(1)分子间连接形成大量的线状串联体会导致非特异扩增；(2)酶切片段过长将导致扩增效率下降，因此优化连接反应体系尤为重要。

以反向PCR为代表的连接成环PCR策略是历史上第一次利用PCR技术进行染色体步移。

尽管I-PCR应用不多，但它却是利用PCR进行染色体步移的一块基石，从此以后各种新方法大量涌现。

图2反向PCR原理示意图2）外源接头介导PCR外源接头介导PCR是在包含待分离侧翼序列区域的限制性片段外侧连接载体或接头，和原片段一起构成一个序列“已知一未知一已知”的结构，根据两侧的已知序列设计引物，就可以扩增得到中间未知的序列。

接头可以是双链也可以是单链，根据所连接的载体或接头的不同，实验程序也存在较大差异。

（1）连接载体的PCR连接载体的PCR是利用已知基因组DNA序列设计的特异引物和载体通用引物进行扩增获得目的片段的一项PCR技术。

Shyamala等利用单特异引物PCR(single specific primer PCR，SSP-PCR)以小鼠伤寒杆菌组氨酸转运操纵子为起点成功的进行了连续步移。

以MI3mpI8RFDNA为载体，用PstI和AraI酶切基因组DNA，PstI和XmaI酶切载体DNA，然后连接酶切后的基因组片段和载体片段作模板进行PCR扩增。

由于非特异片段没有特异引物结合位点，因此，连接了非特异片段的载体不能得到大量扩增，而使特异片段得到有效扩增。

SSP-PCR方法原理简单，实验设计简单，尤其适合于保存有cDNA或基因组文库的实验室，但是其操作较繁琐，特异性较低，产物仍需进行进一步的鉴定。

（2）连接单链接头的PCR锅柄PCR(pan handle PCR，P—PCR)是连接单链接头PCR的典型代表，因其以一个类似锅柄结构的DNA分子为模板而得名。

Jones等率先报道了这一分离侧翼序列的方法，其基本原理见图3。

P—PCR 中需要3个根据已知序列设计的引物，3个引物在已知序列内呈线性排列，其中第3个引物可以作为接头使用，与已知序列互补配对形成单链模板。