食品微生物检验(大肠杆菌全部)
食品微生物大肠杆菌检测国标
食品微生物大肠杆菌检测国标随着社会的发展，食品安全问题日益显示出重要的意义，大肠杆菌（E. coli）作为一种重要的食品微生物，其安全检测成为必要的步骤，为此，中国国家标准化管理委员会发布了《食品微生物大肠杆菌检测国标》。
本文旨在详细介绍《食品微生物大肠杆菌检测国标》的内容、结构及相关要求，以及国标实施过程中可能出现的问题。
一、《食品微生物大肠杆菌检测国标》概述《食品微生物大肠杆菌检测国标》（以下简称国标）由中国国家标准化管理委员会发布，通过对食品中大肠杆菌的检测，以确保食品的安全性及质量，是质量检测部门必不可少的一项依据。
为此，国标总体上分为五大部分：第一部分为总则，主要是介绍国标的目的、适用范围、以及国标的定义、术语。
第二部分为检测要求，主要是介绍样品的采集、检测条件、数据处理和记录要求。
第三部分为检测方法，主要是介绍试剂配制、检测步骤、鉴定等方法。
第四部分为检测质量，主要是详细介绍如何确保检测的可靠性和准确性，以及如何尽可能提高测试的结果准确度。
第五部分为测试结果，主要是介绍检测结果的评价及判断、以及记录要求。
二、《食品微生物大肠杆菌检测国标》实施过程及可能出现的问题1.国标实施过程：（1）检测准备：根据国标的规定，检测前需要准备所需的检测材料，具体包括检测样品、检测设备、试剂、试管培养液等。
（2）检测：根据国标对检测方法的具体要求，进行检测，具体即包括样品采集、样品处理、检测步骤、结果评价及判断等。
（3）检测结果记录：根据国标的规定，将测试结果记录在检测报告中，并用图表形式呈现。
2.可能出现的问题：（1）检测材料及设备购置问题：根据检测所需要的检测材料及设备的特性，购置的设备必须能够满足检测需要，并且要保证质量及性能。
（2）检测过程问题：要按照国标规定的检测方法，确保在检测过程中的准确性，避免因为操作不当而导致数据不准确。
（3）检测结果问题：检测结果必须正确，并且要严格按照国标规定，将结果以图表或者表格形式记录。
食品中菌落总数和大肠菌群的检测
最高稀释度平均菌落数 X 最高稀释倍数
4、 < 30
最低稀释菌度平均落数 X 最低稀释倍数
5、 > 300 或 < 30
取最接近的 X 稀释倍数
6、 无法计数
报告无法计数
26
稀释度选择及细菌总数报告方法（表7）
平均 菌落
稀释
稀释液及菌落数
数 倍数 10-1
例次
10-2 10-3
细菌总数
(个/g或个/ml)
注意：是并不是所有食品都规定细菌指标，如酸乳、酸泡 菜等。
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• 因此，菌落总数的测定对评价食品的新鲜 度和卫生质量有着一定的卫生指标的作用， 但本能单凭此一项指标来判定食品的卫生 质量，还必须配合大肠菌群和致病菌等检 验，才能作出比较全面、准确的评价。
11
一、菌落总数测定法
菌落总数（ aerobic plate count）
2.若有两个连续稀释度在适宜计数范围内（30～300个菌落）时， 按如下公式计算：
•
N= ∑C/(n1 +0.1n2)d
• 式中：
• N — 样品中菌落数；
• ∑C — 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
• n1 — 第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； • n2 — 适宜范围菌落数的第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； • பைடு நூலகம் — 稀释因子（第一稀释度）；
6
• 另一种是将食品经过适当处理（溶解和稀 释）后，在显微镜下对细菌细胞数进行直 接计数，这样计数的结果，既包括活菌， 也包括尚未被分解的死菌体，因此称为细 菌总数。
• 目前我国食品卫生标准中规定的细菌总 数实际上是指菌落总数。即指的是在平板 计数培养基上长出的菌落数。
食品微生物大肠杆菌检测国标
食品微生物大肠杆菌检测国标现在，食品安全是世界范围内关注的一个重要话题，涉及消费者健康与生命安全。
食品中微生物的检测是食品安全的重要组成部分，而大肠杆菌检测又被认为是最重要的微生物检测内容之一。
为了保障食品的安全性，我国通过《食品微生物大肠杆菌检测国标》（GB/T 4789.2-2014），从而确定大肠杆菌检测的依据和质量控制标准。
《食品微生物大肠杆菌检测国标》（GB/T 4789.2-2014）定义了食品及其原料的大肠杆菌检测技术要求和检测评估原则，以及对大肠杆菌检测结果的评价标准。
该标准规定所有食品及其原料中的大肠杆菌总数最多不超过100CFU/g。
根据技术要求，检测食品及其原料时，采用培养法，将样品称量置于培养基中，在28℃定温培养槽中培养7天，期间对样品进行定时检测，计算培养基中大肠杆菌的数量，检测结果按照CFU/g计算结果的大小来判断样品检测结束时间。
GB/T 4789.2-2014标准明确指出，大肠杆菌检测应确定检测方法、检测参数和溶液浓度。
根据不同食品品种，可采用不同的检测方法，常用的有零时约束法、Somogyi-Nelson法或二氧化碳呼叫法等。
这些检测方法的检测参数有时间、温度、pH值等。
同时，检测时的溶液浓度要求也不尽相同，例如，不同样品的检测溶液浓度可以在0.1%1.0%间进行调节。
为了保证检测结果的准确性，《食品微生物大肠杆菌检测国标》（GB/T 4789.2-2014）对与检测有关的设备、设施、仪器、培养基等规定了明确的质量控制要求。
例如，检测人员必须持有合法有效的资质证书，仪器、设备、设施必须经过校准，培养基必须经过特定的有效程序，以确保检测准确无误。
《食品微生物大肠杆菌检测国标》（GB/T 4789.2-2014）的实施，能够有效检测食品及其原料中大肠杆菌的数量，从而确保其安全性。
此外，根据该标准，食品检测机构可以为消费者提供准确的检测结果，更有利于消费者的健康与安全。
大肠杆菌检测
大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料1.1 温箱：36±1℃。
1.2 冰箱:0～4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3.1 检样稀释3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
MPN法测定食品中大肠杆菌群数
知识点：MPN法测定大肠杆菌群数情境：微生物检测技术任务：MPN法测定大肠杆菌群数课程：食品微生物技术MPN 法测定大肠菌群原理一、大肠菌群什么叫大肠菌群大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48h内发酵乳糖并产酸产气。
二、MPNMPN❞食品中大肠菌群数是以每100 mL（g）检样内大肠菌群最近似数（The most probable number，简称MPN）表示。
❞据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均应以每mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。
三、MPN法测定原理MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。
待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
大肠菌群测定步骤1.液体样品稀释以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
2.梯度稀释❞用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取（1:10）样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，作成1:100的样品匀液。
❞根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次，换用1支1 mL灭菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
五、初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。
食品有害微生物检测与控制(10-大肠杆菌)
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大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系
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大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域 的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是 具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些 细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为 可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏
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食品中大肠杆菌的检验
大肠菌群计数检验流程
MPN法
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LST不产气（-） 小导管里无气泡
菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌是人和温血动物肠道内普 遍存在的细菌，是粪便中的主要菌 种。一般生活在人大肠中并不致病， 但它侵入人体一些部位时，可引起 感染 。
总大肠菌群系指一 群在37℃培养24小 时能发酵乳酸、产 酸产气、需氧和兼 性厌氧的革兰氏阴 性无芽胞杆菌。
EIEC
ETEC
EHEC
产气克雷白氏菌
培养基中的指示剂反应，产生蓝色沉淀环绕在 大肠杆菌菌落周围。表面覆盖的胶膜，可截留 发酵乳糖的大肠菌群产生的气体。培养结束后 计数蓝点带气泡的菌落即为大肠杆菌数，红点 带气泡和蓝点带气泡的菌落之和为大肠菌群数。
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在SS培养基上:大肠杆菌一般不能生长，少数生 长的菌落也因发酵乳糖而呈红色；
7-3第七章食品微生物检验-大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌计数
（一）大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌
1、大肠菌群
在一定培养条件下(一般是37℃24小时)能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌 氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。（GB4789.3—2010）
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与 粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌， 这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这 群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、枸橼酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌 和阴沟肠杆菌等。
2、粪大肠菌群
• 根据生长温度的差异，将能在37C生长的称为总 大肠菌群，而在44.5C仍能生长的大肠菌群称为 耐热大肠菌群(thermo-tolerant coliform group) 或 粪大肠菌群（faecal coliform Fc），在人和动物 粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。 因此，粪大肠菌群对粪便污染的指示作用更为直 接和贴切，主要就是大肠艾希氏菌，但也包括克 雷伯氏菌属，正是由于包括了克雷伯氏菌属，使 其与粪便污染的相关性受到了影响。
3)大肠艾希氏菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示 着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近 年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠艾希氏菌检测作为微生物污 染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
4)大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌这三个指标在实际工作中都在应用，但 用途有所不同，一般认为大肠菌群是水源的卫生指标和食品加工卫生状况 的通用指标，粪大肠菌群主要用于贝类和贝类养殖用水的卫生指标，大肠 杆菌用于指示食品受到近期粪便污染或不卫生加工。作为粪便污染的指示 菌，大肠埃希菌检出的意义最大，其次是耐热大肠菌群，总大肠菌群的检 出意义略差一些。
大肠杆菌检验方法
大肠杆菌检验方法
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种革兰氏阴性的厌氧菌，常常被用作指示性微生物来评估食品和水源的卫生质量。
以下是常见的大肠杆菌检验方法：
1. 培养基方法：将样品接种在包含大肠杆菌生长所需营养物质的培养基上，如大肠杆菌选择性琼脂培养基(MacConkey琼脂培养基)和EC培养基等。
大肠杆菌能够利用琼脂中的乳糖发酵产生酸，导致培养基呈现红色或粉红色。
此外，EC 培养基还包含了可以检测大肠杆菌β-葡萄糖苷酶的亚甲基红试剂，如果大肠杆菌存在，则培养基呈现金属光泽。
2. 确认方法：对落有培养基上的鲜艳深色菌落进行进一步确认。
典型的确认方法包括革兰染色、目测观察形态特征、氧化发酵试验和测试产气杆菌酶试验。
3. PCR检测方法：利用聚合酶链反应(PCR)技术，从样品中扩增大肠杆菌特异性基因片段（如16S rRNA基因），然后通过凝胶电泳检测扩增产物。
4. 快速方法：如免疫层析试纸法和光学组织测定法。
免疫层析试纸法利用抗大肠杆菌抗体与大肠杆菌特异性抗原结合生成可视化结果。
光学组织测定法利用大肠杆菌的β-葡萄糖苷酶水解比色底物产生颜色变化。
这些方法都可用于检测大肠杆菌在食品和水源中的存在及其数量。
在进行检验时，应严格遵守相关的操作规程和实验室操作规范，以确保结果的准确性和可靠性。
食品微生物检验(大肠杆菌全部)
第三章大肠菌群测定一、大肠菌群检验( 一) 检验方法( 二) 培养基( 三 ) 检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。
过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。
1974 年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976 年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。
为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法( 包括快速检验方法) 及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。
在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983 ～1985 年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
有些科学工作者又用靛基质、甲基红、 V～ P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和 44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。
一、大肠茵群检验( 一) 检验方法1．乳糖发酵试验。
以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在 l m J 以上者，用双料乳糖胆盐发酵管， lm1 及 1mI 以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。
食品大肠杆菌检测方法国家标准
食品大肠杆菌检测方法国家标准食品安全一直是人们关注的热点问题，而大肠杆菌是食品中常见的一种致病菌，其存在可能会对人体健康造成严重威胁。
因此，食品大肠杆菌检测方法的国家标准制定显得尤为重要。
国家标准对食品大肠杆菌检测方法的制定，旨在规范食品生产企业的生产行为，保障消费者的饮食安全。
首先，国家标准明确了大肠杆菌检测的样品采集方法，要求对不同种类的食品进行不同的样品采集方式，以确保检测结果的准确性。
其次，国家标准规定了大肠杆菌检测的实验室条件和设备要求，包括实验室的环境要求、设备的精度和准确度等，以保证检测的科学性和可靠性。
此外，国家标准还对大肠杆菌检测的方法和步骤进行了详细的规定，确保了检测过程的严谨性和规范性。
最后，国家标准还对检测结果的判定和报告进行了规定，要求对检测结果进行科学分析，并及时向相关部门和消费者报告检测结果，以便采取相应的措施。
在实际操作中，食品生产企业应严格按照国家标准的要求进行大肠杆菌检测。
首先，要做好样品采集工作，保证样品的代表性和完整性。
其次，要确保实验室的环境和设备符合国家标准的要求，以保证检测结果的准确性和可靠性。
同时，操作人员要严格按照标准的方法和步骤进行检测，确保检测过程的规范性和严谨性。
最后，对检测结果进行科学分析，及时向相关部门和消费者报告检测结果，以便采取相应的措施，保障食品安全。
总之，食品大肠杆菌检测方法国家标准的制定和执行，对于保障食品安全、维护消费者权益具有重要意义。
食品生产企业应严格按照国家标准的要求进行大肠杆菌检测，确保食品安全。
同时，相关部门也应加强对食品大肠杆菌检测的监督和管理，保障国家标准的执行效果，为人民群众提供安全放心的食品。
食品中大肠菌的检验
通过大肠传播疾病的途径：
主要是病原微生物随粪便排出后污染 了饮水，食品等经口传染的食物。
污染病原微生物的食品的危害：
1引起食物中毒 2传播人畜共患性疾病或者其他疾病
从食品中直接检查病原微生物困 难的原因：
第一，肠道病原微生物的种类很多， 要逐个检查并非易事，难以经常进行。 第二，污染的病原微生物数目较少， 不易检查出来。 第三，随病原菌同时污染的非病原菌 所占比例比病原菌大得多，在培养时 又比病原菌繁殖快，从而阻碍了病原 菌的生长。 第四，检验时需较复杂的设备和条件， 一般实验室难以进行这类检验工作。
3分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上划线分离， 置（36+1）摄氏度恒温箱内，培养18至24后取出，观察菌落 形态，做革兰氏染色。 4证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌落1至2个进行染色。镜检为 革兰氏阴性无芽孢杆菌时，挑取该菌落的另一部分，接种乳 糖复发酵管，置（36+1）摄氏度恒温箱内，培养（24+2)h， 观察产气情况。凡乳糖管产酸产气，证实有大肠菌群存在， 即为大肠菌群阳性。 5结果
（3）另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，做10倍递增稀释液， 如此每递增稀释1次即换用1支10ml吸管。
2乳糖发酵试验
选择3个稀释度，每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵管。接种量在 1ml以上者用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及以下者用单料乳糖胆 盐发酵管，置（36+1)摄氏度恒温箱内，培养（24+2）h，如所 有发酵管都不产气则可报告为大肠菌群阴性，如有产气则继续进 行。
Ps:正常人类粪便便以典型大肠
杆菌为主，而腹泻患者粪便则大 肠菌群其他型别有明显的增加 测定大肠菌群所用培养基和检验常 用器材：
单料乳糖胆盐，伊红美蓝琼脂，肉汤，磷酸盐缓冲溶 液，生理盐水，革兰氏染色液，恒温培养箱，恒温水 浴锅，天平，显微镜，均质器或乳钵，温度计，灭菌 平皿，试管，广口瓶或三角瓶，吸管，载玻片，接种 针，玻璃珠，酒精灯，试管架。
食品中大肠杆菌的检验方法
从 样 品 中 快 速 分 离 出 来 。 与 快 速 检 验 方 如 法 相 结 合 ，可数 倍 提 高 效 率 并 节 省 大 量 时 间。 ｉｈ 、 ｂ ｏ ￣ Ｃｈ ｐ ｎ Ｗｒｇ ｔ Ｃｕ ｂ ｎ Ｈ ａ ｍａ 用免疫 磁珠 分离法对 食品标本 大肠杆菌进行 检测 ， 达
到 很 好 检 验 效 果 ， ＰＣＲ符 合率 高 。 与 （） ２ 生化 反应 大 肠 杆 菌０ｌ ７： 卫生 威 Ｈ７ ５ 胁 人 类 健 康 ，目 前 许 多 国 家 使 用 ０ ｌ 和 ７ ５ Ｈ７ 异 性抗 体 与 极 少 数细 菌 具 有 不 同程 度 特
技 术 运 用 特 定 荧 光 标 记 特 异抗 体 ， 滤 后 过 菌细咆 与荧光标记 特异抗体 作用 ， 只对 被 检菌被染色， 对于 本 底 杂菌 不 染 色 ， 服 因 克 其 他 杂 质 被 染 色而 导 致 问 题 。 此技 术 由于
无 需 培 养 或分 离 过 程 因此 检 测 非 常 快 速 。 （ ） 合 酶 链 反 应 技 术 。 去 大 肠 杆 菌 ５聚 过 肠 毒 素 检 测 多 采 用 乳 鼠 灌 经成 为世界 性 问题 ， 国情况也 不容 乐观。 我 本文 分析 几种有效检 验 大肠杆 菌方法 为大肠杆 菌检 验奉献徽
薄 力量。 关 键 词 ： 肠 杆 菌 检 验 方 法 食 品 检 验 微 生 物 大
中图 分类号 ： ２ ４ ＴＳ ７． ０
文献 标 识码 ： Ａ
文章编号 ： ７ —０ ｘ（ ０ ） （） ０ １ １ Ｉ ４ ８ ２ １ ｌ ｃ－ ３ —０ ６ ９ ０ ０ ２
果 更 加 准 确 ， 此 在 大 肠 杆 菌 检 测 中 抗 体 因 定位荧 光技术实用性更 好。 实验主 要步骤 是对 样品进 行过滤 ， 用
食品中大肠菌群的测定附mpn检索表)
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述(一)大肠菌群的定义及范围根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。
表5-4 大肠菌群生化特性分类表注：+，表示阳性；—，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。
由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。
(二)大肠菌群的测定意义1、粪便污染的指标细菌早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。
一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。
据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。
若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。
根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。
所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。
当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。
2．粪便污染指标菌的选择作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。
①存在于肠道内持有的细菌，才能显示出指标的特异性。
大肠杆菌的微生物学检查
从饮水中分离大肠杆菌①制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1：10稀释。
③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。
用平板划线分离法进行分离。
④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时。
培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。
⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）。
大肠杆菌的微生物学检查细菌的分离鉴定肠道外感染取中段尿、血液、脓液、脑脊液等，腹泻者取粪便。
粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基。
血液需先经肉汤增菌，再转种血琼脂平板。
其他标本可同时接种血琼脂平板和肠道杆菌选择性培养基。
37℃孵育18～24小时后，观察菌落并涂片染色镜检。
采用一系列生化反应进行鉴定。
肠致病性大肠杆菌须先作血清学定型试验。
必要时检定肠霉毒素。
泌尿系统除确定大肠杆菌外，还应计数，每毫升尿含菌量≥100，000时，才有诊断价值。
卫生细菌学检查大肠杆菌不断随粪便排出体外，污染周围环境和水源、食品等。
取样检查时，样品中大肠杆菌越多，表示样品被粪便污染越严重，也表明样品中存在肠道致病菌的可能性越大。
故应对饮水、食品、饮料进行卫生细菌学检查。
细菌总数：检测每毫升或每克样品中所含细菌数，采用倾注培养计算。
我国规定的卫生标准是每毫升饮水中细菌总数不得超过100个。
大肠菌数指数：指每立升中大肠菌群数，采用乳糖发酵法检测。
我国的卫生标准是每1000ml饮水中不得超过3个大肠菌群；瓶装汽水、果汁等每100ml大肠菌群不得超过5个。
实验二大肠菌群（M.R.N.）检验1 目的了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义学习并掌握大肠菌群的检验方法2 原理大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
实验二 食品中大肠菌群的检验
阳性管 10ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1ml 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 0.1ml 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 3 6 9 3 6 9 12 6 9 12 16 9 13 16 19 4 7 11 15 7 11 15 19 MPN 10ml 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 阳性管 1ml 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 0.1ml 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 11 15 20 24 16 20 24 29 9 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 MPN 10ml 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 阳性管 1ml 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0.1ml 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 1100+ MPN
食品中大肠菌群的测定(共59张PPT)可编辑全文
应增加或减少。
➢酱油〔GB/T2717-2003〕
➢细菌菌落总数： ≤30000cfu/ml
➢大肠菌群：
≤30MPN/100ml
➢肠道致病菌： 不得检出
➢全脂奶粉、脱脂奶粉〔GB5410-1999〕
➢ 二级
特级
一级
➢细菌菌落总数：≤20000 ≤30000 ≤50000
➢〔cfu/ml〕
➢大肠菌群 ≤90
2、 初发酵试验
➢ 每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液 〔液体样品可以选择原液〕，每个稀释度接种3 管月 桂基硫酸盐胰蛋白胨〔LST〕肉汤，每管接种1mL〔如 接种量超过1mL，那么用双料LST肉汤〕, 36℃±1℃ 培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产 气那么继续培养至48h±2h 。
➢ 〔2〕 液体样品
➢ 以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌锥形瓶〔瓶内预置适当数量的无菌 玻璃珠〕中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。
➢ 〔3〕 样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要 时分别用1mol/L 氢氧化钠〔NaOH 〕或1 mol/L 盐 酸〔HCI 〕调节。
➢ 2 、别离培养 将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂
〔EMB琼脂〕平板上划线别离。然后置 36±1℃温箱内，培养18～24小时后取出， 观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实 试验。
➢可疑菌落特点： ➢具有金属光泽的深紫黑色菌落； ➢不带或略带金属光泽的菌落； ➢中心色较深的淡紫黑色菌落。
➢3 、证实试验 在上述平板上挑取可疑大肠菌落1～2
➢
3、接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆
盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆
食品中细菌总数及大肠菌群值的检测
菌落总数测定——卫生学意义
• 判定食品被细菌污染的 程度及卫生质量。
菌落总数测定流程(倾注平板法)
检样1mL+9ml稀释液（磷酸盐缓冲液） 适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行） 每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）
35 ℃ ，48 ± 2h
检测程序
初步发酵试验（产酸产气否？） 平板分离（伊红美蓝鉴别培养基） 革兰氏染色（是否G-无芽孢杆菌？） 复发酵试验（可疑菌落是否产气菌？）
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
• 伊红和美蓝可抑制G+生长； • 不发酵乳糖的细菌菌落无色
透明；
菌名
大肠埃希氏菌
• 能发酵乳糖，产酸力弱，菌 肺炎克雷伯氏菌
卫生学意义
• 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪 便污染指标。
• 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病 菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。 大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康 危害性的大小。
• 大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预 示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指 示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测 作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
一、目的要求
1.了解食品卫生微生物学的重要性及其原理 2.学会食品中细菌菌落总数的测定方法和平
板活菌计数法 3.学会食品中大肠菌群数的测定方法
二、基本原理
1、食品卫生微生物学指标包括细菌菌落总数、大肠 菌群数和致病菌数量。前两者在日常检测中是必检项 目。
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第三章大肠菌群测定一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基(三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国外广泛应用于食品卫生工作中。
该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。
过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。
1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。
为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。
在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。
一、大肠茵群检验(一)检验方法1．乳糖发酵试验。
以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。
每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。
2．分离培养。
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。
3．证实试验。
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时5．检验程序。
见图3-1类的酶，随细菌种类不同而异，可以此来鉴别细菌。
乳糖是双糖，细菌分解双糖的酶大多是胞外酶。
乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可直接被细菌利用，而半乳糖则需在细胞转化为葡萄糖后再被利用。
糖发酵试验主要是测定细菌分解糖类以后所产生的酸，以培基pH 降低(指示剂变色)作为观察结果的指标。
图3-I 大肠菌群检验程序(=)培养基1．乳糖胆盐发酵培基 成分：蛋白胨猪胆盐(或牛，羊胆盐) 乳糖 ．、0．04％溴甲酚紫水溶液 蒸馏水 ’ pH7．4制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中， 并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。
20g 5g ‘ 1 Og25m 1 1 000m1 校正pH ，加入指示剂，分装每管l 0ml ，附注：双料乳糖胆盐发酵培基除蒸馏水外，其他成分加倍。
用途：乳糖发酵试验用。
原理：细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖 接种乳糖发酵管，置36±1℃ 温箱培养24±2小时，观察产气情况。
凡乳糖管产气，革 兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
4．报告。
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN 检索表，报告每l 00ml(g)大 肠菌群的最可能数。
大肠杆菌等细菌在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成CO2和H2，在培基中产生大量气体，进入倒管中，以便观察。
注：常用于供发酵试验的各种糖类、醇类和糖苷类(见表3-1)·2．伊红美蓝琼脂培基成分：蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 17g2％伊红Y溶液 20ml0．65％美蓝溶液 10ml蒸馏水 1000mlpH7.1制法：将蛋l白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶，高压灭菌121℃15分钟备用。
临用时加入乳糖，并加热溶化琼脂，冷至50一55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
原理：大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时还可产生金属光泽。
黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者比倒有关。
不发酵乳糖的细菌(如沙门氏菌、志贺氏菌)则为无色菌落。
3．乳糖发酵培基成分：蛋白胨 20g乳糖 10gO．04％溴甲酚紫水溶液 25ml蒸馏水 1000mlpH7．4制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30ml、10ml 或3ml，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。
附注：’(1)双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
(2)30ml和10ml乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用．3ml乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。
4．蛋白胨水成分：蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g氯化钠 5g蒸馏水 1 000ml pH7．4表3-1 供发酵试验用的糖类、醇类和糖苷类（一）供发酵试验用的各种糖类(二)供发酵试验的各种醇类和糖苷类制法：按上述成分配制，分装小试管，高压灭菌12l℃15分钟．附注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸。
每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
（玫瑰吲哚) 图3-2靛基质的产生及呈色的机理图原理：细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质，与对二甲氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲跺而呈红色(见图3-2)。
(三)检验时应注意事项1．检验步序。
大肠菌群的检验步序采用三步法(乳糖发酵试验、分离培养和证实试验)。
第一步乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，经过平板分离和证实试验后，有时可能成为阴性。
大量检验数据表明，食品肠菌群检验步序的符合率，初发酵与证实试验相差较大，不同食品三步序的符合情况也不一致(见表3-2)，所以在大肠菌群检验步序方面，应结合食品类别、污染情况以及样品中菌相的差异分别予以考虑。
在食品检验上，除个别情况外，一般来说，如果平板上有较多典型大肠菌群菌落，革兰氏染色为阴性杆菌，即可做出判定。
如平板上典型菌落甚少或均不够典型，则应多挑菌落做证实试验，以免出现假阴性。
只做一步初发酵，对 表3-2检验步序与检出率的关系种 样品名称 检出阳性率（B/A ）*100%（C/B ）*100% 类 初发酵 (A) 平板分离 (B) 复发酵 (C)（C/A ）*100% 食’ 品羊肉 熟肉 灌肠 生牛奶甜炼乳 奶粉 醋 酱油 冰棍．雪糕．冰砖汽水 炊具(碗)483 298 540 450 163 77 118 3l3 743 12 109483 218 540 439 140 74 41 265 493 12 109483 215 539 439 100 74 38 258 460 12 109 lOO 73.2 100 97.16 85.9 96.1 34.7 84.7 66.4 100 100100 72.1 99.8 97.6 61.3 96.1 32.2 82.4 61.9 100 100100 98.899.8 100 71.4 100 92.7 97.4 93.3 lOO 100合计 3306 2814 2727 85 82．5 96.9某些食品来说，误差是比较大的。
这样做，会有相当部分的合格样品被作为不合格样品处理．应予注意。
2．抑菌剂。
大肠菌群检验中经常使用的抑菌剂有胆盐．洗衣粉、十二烷基硫酸钠．煌绿、龙胆紫，孔雀绿等。
抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。
有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有差误，即可对抑菌作用产生影响；有的抑菌剂当牌号、规格改变时，也可影响抑菌效果，而需重新测定抑菌的有效剂量。
这些情况均给抑菌剂的使用带来不利条件．我们曾对胆盐等三种抑菌剂进行大肠菌群检验效果的观察(见表3—3)。
目前我国在食注:(一)表示不加抑菌剂：( )数字系％．品大肠菌群检验方面采用胆盐作为抑菌剂，猪、牛、羊三种胆盐对大肠菌群的检验效果，经实验观察无何明显差异，可相互替代。
但其他胆盐的检验效果则不一致(见表3—4)，故不宜相互替代。
目前由于胆盐不易购买，有的实验室以3号胆盐、混合胆盐、去氧胆酸钠或兔胆盐等代替猪胆盐加入培基中，这会影响大肠菌群酶检验结果，应予注意。
在胆盐用量上，实验表明1％、O.5％和0.25%三个剂量无何差异。
所以目前乳糖发酵管采用的胆盐剂量(0．5％)是适宜的，在称量时稍有差误，亦不致影响大肠菌群的检出。
注：分母表示接种株教，分予表示产气株数．3．挑选菌落。
大肠菌群是一群肠道杆菌的总称，大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠杆菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。
所以在实际工作中。
表3—6 茵落形态与检出率的关系注：（）数字系%为了提高大肠菌群的检出率，应当熟习大肠菌群的菌落色泽和形态。
在检验方法中我们选用伊红美蓝平板为分离培基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽，检出率最高；红色、粉色菌落检出率较低。
菌落形态的其他方面(如菌落大小、光滑与粗糙、边缘完整情况、隆起情况、湿润与干燥等)虽亦应注意，但不如色泽方面更为重要(见表3—5、3—6)。
另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，在实际工作中，由于工作量较大，通常只挑取一个菌落，但影响大肠菌群检出率的因素较多，如食品种类、菌落色泽和形态、细菌种类等，所以只挑一个菌落，由于机率问题，很难避免假阴性的出现，尤其当菌落呈不典型时(见表3一7)。
所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。
4．产气量。
在糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管存有极微小韵气泡(有时比小米粒还小)，类似这样的情况能否算作产气阳性呢?这是许多食品检验工作者经常遇到的问题。
大肠菌群协作组在这方面进行了实验观察。
结果表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生小于米粒的气泡。
一般来说，产气量与大肠浦群检出率呈正相关，但随样品种类而有不同，有小于米粒的气泡，亦可有阳性检出。
另外，对未产气的乳糖发醇管是否均应作阴性处理，根据大量工作实践来看，对这种情譬况应予慎重考虑。
在日常工作中，经常可以遇到在初发酵时产酸无气，但复发酵却证实为大肠菌群阳性。
有时倒管虽无气体，但在液面及管壁却可以看到缓缓上浮的小气泡。
所以对未产气的乳糖发酵管如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步观察．这种情况的阳性检出率可达半数以上(见表3—8)。