高密度发酵

贫氧条件下对氧的利用率。
3 构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主 菌 对于以可溶性或分泌形式表达的目 标蛋白而言，随着发酵后期各种蛋白水 解酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解 酶的作用而被降解。
第八节 基因工程药物的分离纯化
基因工程药物的分离、纯化非 常重要。表达的产物都是多肽或蛋 白质 。它的制得具有以下特点：
一、影响高密度发酵的因素
培养基；溶氧； pH；温度；代谢副产物
1 培养基:高密度发酵对基质中营养源的种类 和含量比要求较高，如碳源和氮源的比例偏 小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰 老自溶；比例偏大，则菌体繁殖数量少，细 胞代谢不平衡，不利于产物积累。
葡萄糖是高密度发酵中常用的碳源，
但浓度过高，会产生乙酸，因此要保证较 低的葡萄糖浓度。 氮源、微量元素和无机盐对细菌的生 长繁殖和外源蛋白的表达也有很大影响。
胞外产物
浓缩
初步分离
高度纯化
制 剂 产 品
基因工程药物分离纯化的一般流程
分离纯化的技术要求： ①技术条件温和能保持产物生物活性。 ②选择性好，能从复杂的混合物中有效 的将目的产物分离，达到较高的纯化倍 数。
③收率要高。 ④两个技术间能直接衔接，不需 要对物料加以处理。 ⑤纯化过程要快，满足高生产率 的要求。
产物的特性在分离纯化中的作用
产 物 特 性 等电点 作 用
决定离子交换种类及条件
相对分子量
疏水性 生物特异性 溶解性 稳定性
选择不同孔径的介质
与疏水、反相介质结合的程度 决定亲和配基 决定分离体系及蛋白浓度 决定工艺采用温度及流程时间
分离纯化的方法依赖色谱分离方法
1、离子交换层析 离子交换层析的基本原理是通过带 电的溶质分子与离子交换剂中可交换的 离子进行交换，从而达到分离的目的。 它具有分辨率高容量大操作容易， 该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的 重要方法。
配基：在亲和层析中起可逆性结合的 特异性物质。 载体：与配基结合的支撑物。 亲和层析大体可分三步： ①配基固定化 ②吸附目的物 ③样品解吸
4、凝胶过滤
凝胶过滤是以具有大小一定的多孔 性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔 内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进 入孔内，快速移动，利用这种移动差别 可使大分子与小分子分开。
在一定范围内，通气量越大，溶氧浓 度越高。 若气流速度过大，会使发酵液产生大 量泡沫，使罐的有效利用率降低。
3 pH
大肠杆菌利用葡萄糖产酸产气， 特别是大量的乙酸和二氧化碳，使pH 降低，必须调节pH在适宜的范围。
4 温度 培养温度在适宜的范围，对于温 控诱导表达的基因工程菌来说，诱导 时机和持续时间对于重组蛋白的产量 由很大影响。
5 代谢副产物 乙酸 二氧化碳
葡萄糖的浓度超过某一阈值，会产生乙酸， 或者比生长速率过高，供氧不足，也会产生乙 酸。为降低培养基中代谢副产物的积累，可采 用流加补料的措施，或保持适当的比生长速率， 或在培养基中添加某些氨基酸。
二 、实现高密度发酵的方法
1 发酵条件的改进
①培养基的选择：采用甘油作为碳源
第九节 高密度发酵
高密度发酵：指培养液中工程菌的菌体浓 度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达 200gDCW/L。
高密度发酵可以提高发酵罐内的菌体密 度，提高产物的细胞水平量，相应的减少了生 物反应器的体积，提高单位体积设备生产能力， 降低生物量的分离费用，缩短生产周期，从而 达到降低生产成本，提高生产效率。
切断细胞代谢网络上产生乙酸的生物合成
途径，构建出产乙酸能力低的工程化宿主
菌，是从根本上解决问题的途径之一。
①阻断乙酸产生的主要途径：基因敲除 或突变产生乙酸代谢突变菌株。 ②对碳代谢流进行分流：丙酮酸代谢有 选择的向乙醇的方向进行。
③限制进入糖酵解途径的碳代谢流：大 肠杆菌对葡萄糖的摄取是在磷酸转移酶 系统的作用下通过基团转位的方式进行 的，通过基因敲除法限制葡萄糖的摄取 速率。 ④引入血红蛋白基因：提高大肠杆菌在
2 溶氧浓度
随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增 加，溶氧浓度随之下降，细胞的生长减慢。 特别是高密度发酵的后期，由于菌体密度的 扩增，耗氧量极大，发酵罐各项物理参数均 不能满足对氧的供给，导致菌体生长极为缓 慢，外源蛋白的表达量也较差。
在发酵过程中保证适宜的溶氧浓度， 必须确定发酵罐的通气量和搅拌速度。
2、疏水层析 疏水层析是利用蛋白质表面的疏 水区域与固定相上疏水性基团相互作用 力的差异，对蛋白质组分进行分离的层 析方法。 蛋白质与疏水性介质的作用力小， 分离过程中活性不易丧失。
3、亲和层析
亲和层析是利用固定化配基与目
的蛋白质之间特异的生物亲和力进行 吸附，如抗体与抗原、受体与激素、 酶与底物之间的作用。
超声破碎法：利用超声波来处理细胞 悬浮液，在超声波作用下，液体发生 空化作用，空穴的形成、增大和闭合 产生极大的冲击波和剪切力，使细胞 破碎。
可处理少量样品，产生热量大，敏感物 质易失活。
2、化学破碎法
渗透冲击：先将细胞置于高渗透压介质， 达成平衡后，突然稀释介质，在渗透 压的冲击下，使细胞壁和膜膨涨破裂。
①表达产物在初始料中含量较低； ②初始物料组成复杂，含有大量细胞及代谢产 物、残留培养基等。 ③表达产物稳定性差，易失活变性；
④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；
⑤对其质量要求纯度高、无菌、无热原。
一、建立分离纯化工艺的根据
⒈含目的产物的初始物料的特点
①菌种的类型及其代谢特性。②原材料培 养基的来源及其质量。③生产工艺及条件。 ⒉物料中杂质的种类和性质。 ⒊目的产物特性。 ⒋产品质量的要求。
二、分离纯化的基本过程
由于基因工程药物是从转化细胞、而不是
从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也
要高于传统产品。
基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5
个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初
步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工
发酵液
细胞分离
胞内产物
细胞破碎 固液分离 包含体 变性 复性 细胞碎片分离
主要应用两个方面：
①脱盐和更换缓冲液 ②蛋白质分子的分级分离。 在产品的形成阶段前用于除去产物的 多聚体及降解产物。
基因工程药物生产中常用的分离纯化方法
方 法 目 的
离心/过滤 阴离子交换层析 40nm微孔滤膜过滤 阳离子交换层析 超 滤
去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质 去除杂质蛋白、脂质、DNA、病毒 进一步去除病毒 去除牛血清蛋白或转铁蛋白等 去除沉淀物及病毒 去除残余的杂蛋白 与多聚体分离 除 菌
三、细胞的破碎方法
物理法：匀浆法；珠磨法和超声法 化学法：渗透冲击，增溶法 生物法：酶溶法
1、物理破碎法
匀浆法：利用高压迫使细胞悬浮液通过 针形阀后，因高速撞击和突然减压而使 细胞破裂的方法。
可以大规模应用，不适用于易造成堵塞 的团状或丝状真菌。
高速磨珠法：将细胞悬浮液与研磨剂一 起快速搅拌或研磨，利用玻璃珠间以 及玻璃珠与细胞间的相互剪切、碰撞 促进细胞壁破裂而释放出内含物。 产生大量的热，必须采取冷却措施。
价格ห้องสมุดไป่ตู้，回收利用困难，仅在实验室用。
四、固液分离
1、离心沉淀 2、膜过滤：微滤；超滤；反渗透 3、双水相萃取：两种水溶性高聚物或一 种高聚物与无机盐在水溶液中混合而 成。两相均含较多的水。
五、重组蛋白质的分离纯化
目的产物含有大量杂质必须进行分 离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其 分子的理化性质和生物学特性来决定。
②建立流加式培养：营养过高抑制细胞生长，高 密度发酵是以低于抑制阈的浓度开始的，营养 物是在需维持高生长速率是才添加的。
③提高供氧能力：通入空气与氧混合气体；增加 压力；发酵液中添加过氧化氢。
2 构建出乙酸化能力低的工程化宿主菌 通过发酵条件的改进可以减少乙酸 的产生，但是难以做到精细的调控，通过
疏水层析 凝胶过滤 0.22μm微孔滤膜过滤
六、非蛋白质杂质的去除
DNA、热原质和病毒的纯化方法：
1、 DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈阴离 子，可用阴离子交换剂吸附除去,目的 蛋白的pI应该在6.0以上。亲和层析和 疏水层析也有效。
2、热原质的去除：热原质是肠杆菌科产 生的细菌内毒素（脂多糖），去除困难。 分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用 超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴 离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可 用疏水层析法。 3、病毒的去除：层析或过滤可将病毒去 除。
适用于细胞壁较脆弱的，经过酶处理的 细胞壁。
增溶法：利用表面活性剂等化学试剂的增溶 作用，增加细胞壁和膜的通透性使细胞破 碎的方法。
表面活性剂：SDS；TritonX-100 有机溶剂：乙醇；异丙醇，尿素 缺点：添加新的化学试剂，造成新的污染。
3、生物破碎法
酶溶法：利用生物酶消化溶解细胞壁和细 胞膜的方法。 细胞壁溶解酶是几种酶的复合物，必须根 据待处理细胞的结构和化学组成来选择 适当的酶，并确定相应的使用次序。