细胞培养的基本方法-细胞分离技术
细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法可以包括以下步骤：
1. 细胞培养：将待实验的细胞株从冷冻保存中取出，放入无菌培养皿内，并加入适宜的培养基。
设置适当的培养条件，如温度、湿度和二氧化碳浓度等。
定期观察细胞生长情况并进行细胞的传代。
2. 细胞传代：当细胞培养达到一定密度时，将细胞通过酶消化方法从培养皿中取出，然后转移到新的培养皿中重新培养。
该方法可以获得更多的细胞数量，以维持细胞培养的供应。
3. 细胞分离：对于某些实验需要用到单独的细胞的情况，可以采用细胞分离的方法，如通过胰蛋白酶消化细胞外基质、抑制细胞黏附等，使细胞单个分散。
4. 细胞检测：使用显微镜观察细胞的形态变化，细胞生长情况和细胞颜色等。
也可以利用荧光显微镜观察细胞内的特定荧光标记物，如细胞核染色剂、蛋白质荧光探针等。
5. 细胞培养基交换：定期更换细胞培养基，以保持细胞的生长状态和代谢活性。
6. 细胞处理：根据实验需要，在培养皿中添加不同浓度或种类的化合物，如药物、抗生素等，对细胞进行处理。
7. 细胞采集：根据实验需求，利用细胞刮刀、吸球等方法将细胞从培养皿中收集起来。
8. 细胞冻存：将细胞保存在液氮中，以便长时间保存和后续使用。
9. 细胞裂解：对于某些实验需要提取细胞内的特定分子或蛋白质，可以使用细胞裂解液将细胞内组分释放出来。
10. 细胞计数：通过显微镜或细胞计数仪等方法，对细胞数量进行计数和测定。
请注意，具体细胞实验的操作方法可能因不同的实验目的和细胞类型而有所差异，上述仅为一般的基本操作方法。
在进行细胞实验时，应严格遵守相关实验室规范和安全操作指南。
动物细胞培养的方法
动物细胞培养的方法
动物细胞培养是一种在实验室中进行的细胞生物学技术，可以用来研究细胞的生长、分化、代谢以及毒性等方面。
一般来说，动物细胞培养需要以下步骤：
1. 选择细胞系：选择适合自己研究的细胞系，例如常用的HeLa 细胞、293细胞等。
2. 培养基配制：根据细胞系的需求配制适当的培养基，添加必要的营养物质和能量补给。
3. 细胞分离：用消化酶将组织细胞分离成单个细胞，避免细胞间黏连。
4. 细胞传代：当细胞密度达到一定量级后，需要将细胞传到新的培养皿中，以保证细胞的生长和繁殖。
5. 细胞存储：将细胞冷冻保存以备日后使用。
以上是动物细胞培养的基本步骤，当然在实际应用中还涉及到一些技术细节和技巧，需要不断摸索和实践。
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细胞工程学相关考试题及答案
细胞工程学名词解释及问答题一、名词解释1、细胞工程（cytotechnology或cell engineering）：它是以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状，生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。
或应用细胞生物学和分子生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。
通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。
2、看护培养（nursing culture）：用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂增殖的方法。
3、细胞杂交（cell hybridization）：指用人工方法把不同类型的两个或两个以上细胞合并成一个细胞的技术。
4、外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的植物组织、器官等材料。
5、人工种子：是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。
6、花药培养（anther culture）：将成熟或未成熟的花药从母体植株上取下，放在无菌的条件下，使其进一步生长、发育成单倍体细胞或植株的技术。
（指离体培养花粉和花药，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株，使之二倍化的细胞工程技术。
7、条件培养基(conditioned medium)：培养过程中，有些细胞可能会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞分泌物的培养液称为条件培养基。
8、植物脱毒：由人工用物理、化学和生物方法将植物体组织器官病原体消除，以使这些组织器官生成完整植株。
9、原代细胞系：指从机体中取出而直接培养的细胞，从一代到十代的细胞培养是原代培养，形成的整个系统叫原代细胞系。
10、体细胞杂交：指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。
组织细胞培养
组织细胞培养概述组织细胞培养一般泛指所有的体外培养，包括组织培养、细胞培养和器官培养。
其中，组织培养（Tissue Culture）指从活体内取出组织，模拟体内生理环境，在体外无菌、适当温度和一定培养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。
细胞培养（Cell Culture）则是指离散细胞的培养，这些细胞通过酶学的、机械的或化学方法从来源组织中获得，培养物是单个细胞或细胞群。
器官培养（Organ Culture）是指以器官的原基、器官的一部分或整个器官为培养物，应用与组织培养相似的条件，使培养物保持着体内组织部分或全部组织学特征，在体外生存、生长并保持一定的功能。
组织培养与细胞培养并无严格区别，组织培养可出现细胞单一化现象，即趋向变成单一类型细胞，最终也变成了细胞培养。
细胞在培养过程中的生命活动是互相依存的，呈现着一定的“组织”特性。
（一）体外培养方式的分类体外培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养，又称初代培养（Primary Culture），即对从生物体内取出的细胞、组织和器官进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，通常只能培养10-50代左右即退化死亡。
传代培养（Passage Culture），是指无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。
原代培养物经首次传代成功后即为细胞系（Cell Line）。
如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line），而已获无限繁殖能力能够持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。
由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞的亚系（Subline）。
（二）体外培养细胞的分型根据离体细胞在培养皿中生长时是否贴壁，可将体外培养细胞分为贴壁型和悬浮型两类。
1.贴壁型细胞：培养细胞需贴附在支持物上生长，大多数细胞属于此型，也称锚着依赖性细胞（anchorage-dependent cells）。
细胞培养技术中的细胞纯化和分离
细胞培养技术中的细胞纯化和分离随着生物技术和生物医学研究的不断发展，细胞培养技术也越来越成为一种重要的研究手段。
在进行细胞培养实验时，不仅需要在培养基中提供适宜的营养条件，还需要考虑如何保证细胞的纯度和分离。
因为如果细胞混合在一起，可能会对实验结果产生干扰，影响科学研究成果的准确性。
细胞纯化和分离技术的发展，为细胞培养实验提供了有力的支持。
一、细胞纯化技术所谓细胞纯化，即是指将同一类型的细胞从混合物中分离出来，获得纯种的细胞。
这种技术应用广泛，例如在干细胞研究中，需要将干细胞从其他细胞中纯化出来。
目前常用的细胞纯化技术主要有以下几种。
1.差速离心这种方法的原理是依靠细胞的不同沉降速度，在其它细胞和细胞碎片中分离出要纯化的细胞种类。
比如对于混合的细胞，进行差速离心后，重的细胞如肝细胞等就可以在离心管的底部沉淀下来；而轻的细胞比如造血干/祖细胞则可以在上层沉淀。
这种方法虽然方便快捷，但是由于离心速度的不同，有时会把不同的细胞类型离心到一个位置，分离效果并不理想。
2. 细胞排序技术细胞排序技术是一种可接受的方法。
这种方法利用一种叫做细胞分选仪（FACS）的设备来实现，FACS通过运用激光束可以捕捉到被染色的细胞，然后在细胞上打标签，这样细胞分选仪就能帮助实验人员将目标细胞分选出来。
不仅如此，FACS还可以根据设定的特定标记，为不同细胞类型分类和分选。
但是，这种方法价格昂贵，需要训练技能，限制了它的使用。
二、细胞分离技术与细胞纯化技术不同，细胞分离技术是将混合物中的不同细胞种类分离的过程。
这种技术在体外培养单一细胞的物种和组织研究中应用广泛。
1. 磁珠细胞分离技术这种技术广泛应用在制备纯化细胞的过程中。
基本原理是通过对细胞标记来实现磁性分离。
首先，将细胞和磁性珠以特定的方式结合在一起，对此进行特别处理，这样可以使细胞在磁场中受到磁力吸引。
然后，将细胞和磁珠贴附在磁性离心离心机上，以达到将细胞分离的目的。
植物细胞培养的基本过程和方法
植物细胞培养的基本过程和方法植物细胞培养是一种将植物细胞体外培养的技术，其主要目的是为了研究细胞的生理、生化过程以及植物的生长发育等方面的问题，也可以用于植物遗传改良、利用细胞培养生产植物品种等领域。
下面将对植物细胞培养的基本过程和方法进行详细介绍。
1.材料准备：选择合适的植物组织作为培养材料，如茎段、叶片、根尖等。
同时还需要准备一些基本的实验仪器和培养基成分。
2.细胞分离：将选取的植物组织进行表皮剥离、细胞壁酶解等操作，将细胞分离出来。
可以使用显微镜观察细胞的分离程度。
3.培养基配制：根据不同的培养目的和植物类型，调配适合的培养基。
培养基通常包括无机盐、有机物、维生素、激素等成分，用于提供细胞生长所需的养分。
4.细胞培养：将分离得到的细胞悬浮在培养基中，将其培养在恒温恒湿的培养箱中。
培养箱中的温度和光照条件可以根据植物的特性进行调节。
5.观察和保存：定期观察细胞的生长情况，包括细胞的形态、分裂情况等。
同时可以进行细胞生长速率、物质代谢等方面的研究。
对于需要保存的细胞，可以使用液氮冷冻或低温贮藏的方法保存。
1.组织培养：将植物组织培养在含有适当激素的培养基上，促使其分化和增殖。
常用的组织培养方法包括愈伤组织培养、种子发芽培养、胚培养等。
2.悬浮细胞培养：将植物细胞分散在培养基中形成悬浮细胞。
可以利用悬浮细胞进行物质代谢、遗传变异等研究。
3.离体培养：将完整的植物器官（如茎尖、叶片等）切分成适当大小的组织块，培养在含有激素的培养基上，使其分化为根、茎、叶等组织。
4.离体器官培养：将完整的植物器官（如拟南芥的花蕾、水稻的胚等）取出，培养在含有细胞分裂素和植物生长素的培养基中，经过适当的处理后，可以使其分化为新的植株。
5.基因转化：将外源基因导入植物细胞中，使其产生新的表型特征。
常用的基因转化方法包括农杆菌介导的转化、基因枪轰击法等。
总之，植物细胞培养是一种重要的实验手段和研究方法，通过培养和处理植物细胞，可以为植物生物学和生物技术研究提供重要的理论基础和实验依据。
细胞分离方法与原理
细胞分离方法与原理细胞是构成生命的基本单位，其分离对于生物学研究、医学诊断和治疗等领域具有重要意义。
细胞分离技术是指将混合的细胞种群分离出特定类型的细胞或富含某种细胞的组织。
本文将围绕细胞分离的方法和原理展开讨论。
一、细胞分离的方法1. 机械法机械法是最早被使用的细胞分离方法之一，其原理是利用细胞的大小、形状、密度、粘附性等特性，通过物理力学的方法将不同种类的细胞分离出来。
机械法包括过滤、沉淀、离心、切碎、切割等方法。
其中，过滤法是最常用的方法，通过不同孔径的滤网筛选出目标细胞，常用的滤网孔径为0.22μm、0.45μm和0.8μm等。
2. 化学法化学法是利用化学试剂对细胞进行分离的方法。
化学试剂可以改变细胞的表面电荷、粘附性、抗体性等特性，使其与其他细胞或细胞外物质分离。
化学法包括胶体金法、磁珠法、离子交换法、免疫磁珠法等。
其中，免疫磁珠法是一种广泛应用的方法，可以利用特异性抗体对细胞进行分离，具有高效、高选择性和易操作等优点。
3. 生物学方法生物学方法是利用生物学特性对细胞进行分离的方法。
生物学方法包括细胞培养、细胞染色、细胞分选等。
其中，细胞培养是最常用的生物学方法之一，可以将细胞在培养基中生长和繁殖，使其数量达到分离的要求。
细胞染色是利用染色剂对细胞进行染色，从而得到不同形态和结构的细胞，有助于细胞的鉴定和分离。
细胞分选是利用细胞的生物学特性，如大小、形状、表面特性等，对细胞进行分离，常用的方法包括流式细胞术、激光捕获微操作等。
二、细胞分离的原理1. 物理原理细胞分离的物理原理主要包括大小、形状、密度、粘附性等特性。
不同种类的细胞具有不同的大小和形状，通过物理力学的方法可以将其分离出来。
例如，利用过滤法可以分离出大小不同的细胞；利用沉淀法可以分离出具有不同密度的细胞；利用粘附性可以分离出具有不同粘附能力的细胞。
2. 化学原理细胞分离的化学原理主要包括化学试剂对细胞表面电荷、粘附性、抗体性等特性的改变。
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
二 细胞计数 1 血球计数板计数 2 自动细胞计数器计数 3 结晶紫染色细胞核计数法 4 MTT染色计数法
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
包埋法 缺点：扩散限制，并非所有的细胞处于最佳
基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚 物网络内部。 一般适用于非贴壁依赖性细胞的固定。 常用的载体：琼脂糖；海藻酸钙凝胶
动物细胞培养基本方法
已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫 疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红 细胞生成素、单克隆抗体等产品。
动物细胞培养基本方法
依细胞种类：原代培养、传代培养 依培养基：液体培养、固体培养 依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、搅拌
培养、微载体培养、中空纤维培养、固定 床或流化床培养。 生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁悬浮培养。
用灌流培养，细胞密度低。
动物细胞培养基本方法
2、贴壁培养
必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培 养方法。 适用细胞类型：贴壁依赖型细胞，兼性贴壁 细胞。 基质要求：具有净阳电荷和高度表面活性。 对微载体而言还要求具有一定电荷密度。
动物细胞培养基本方法
优点：
a容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表面， 可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养 液。 b容易采用灌流培养，从而达到提高细胞密度 的目的，因细胞被固定，不需过滤系统。 c当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效 的表达一种产品。
动物细胞培养基本方法
一、动物细胞大规模培养的方法
1、悬浮培养（suspension culture） 让细胞自由的悬浮于培养基内进行生长繁殖。 适用细胞类型：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂
043动物细胞工程-第四章第三节 细胞的基本培养技术
4．重新加入TdR培养基(浓度同上)进行第2次阻断，作用16 h。
5．再弃掉TdR培养基，Hanks液洗2—3次后换上普通培养基。第2次 TdR释放0 h时取样则细胞处于G1/S期交界处；如2-7 h取样则为不同 阶段的S期细胞。 注意：具体TdR作用和释放的时间应参考每一种待 同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值，也可根据经验确定。
有的只有永生性和无异体接种致癌性，有些则相反（恶性）。
第四节 细胞系和细胞株的建立 一、细胞系和细胞株的种类 1．初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内 取出的细胞、组织和器官进行的第一次的 培养物。
2．细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞 系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系(finite cell line)；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞 系或无限细胞系(infinite cell line)。
位是否准确、组织是否保持活性、材料处理是否恰当，直接
1.鸡胚组织的取材：用于病毒与疫苗的研究
受精鲜蛋--孵化箱37℃孵育9-12d--从气室处
破壳--挑取鸡胚--按需取材。
2.鼠胚组织的取材：常用材料，易于培养。
杀死小鼠---75%酒精溶液整体消毒2--3s---固
定---剪开皮肤解剖取材。
2.取鼠胚：常用 材料，易于培养。
一次进行传代之前的时期，一个特征性的必然 的生长阶段。
完成了从体内环境到体外环境的过渡和适
应过程，恢复了分裂增殖与生长发育 的能力
取材——分离细胞——接种
一、原代培养
优点：组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很 大变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生 长特性，很适合作药物测试、细胞分化等实验研究。 （一）．组织取材 决定实验的成败。 取材是原代培养的最初环节，取材的部
动植物细胞培养的基本原理和操作技巧
动植物细胞培养的基本原理和操作技巧细胞培养是生物学中十分重要的实验技术，可用于各种细胞学、遗传学或生化学的研究。
其中，动植物细胞培养是两大主要领域之一。
本文将对这两种培养细胞类型的基本原理和操作技巧进行介绍。
一、动物细胞培养动物细胞培养是利用无菌条件下的细胞生长基质，通过检测和调整培养环境中的养分浓度、温度、pH值、气体成分等因素，使细胞在体外无限制增殖和分化的技术。
因此，准确掌握动物细胞的培养技术是进行多种细胞学研究的重要基础。
（一）培养基的配制动物细胞培养的基础是培养基的配制。
一般而言，动物细胞培养基可以分为无血清和含血清的培养基两类。
其中，含血清的培养基可以促进细胞生长，因此被广泛使用。
不过，含有血清组分的培养基不仅具有生物反应性，而且批次差异较大，因此需要进行良好的质量控制。
（二）细胞的分离和培养常常采用酶溶解技术将组织中的细胞分离出来，并将其移至培养基中。
其中，组织的分离能力受细胞的外表形态、黏附性等表现的影响。
一般情况下，将由細胞附着在培养基上的组织片漂浮在果葡糖溶液中，比起用酶方案更有效。
在进行培养的过程中，要注意培养基的更换和细胞生长的密度，避免过度生长导致的细胞死亡。
（三）细胞的冻存和解冻细胞的冻存和解冻是进行细胞培养的必须环节。
动物细胞在液氮中冰冻保存时，为保证细胞的完整性及生物活性，需进行冻存液的配置，加数种抗氧化物可提高细胞的存活率。
而在解冻后，应注意细胞的复苏需要时间，因此在解冻后加多种生长因子能够大大提高细胞复苏的效率。
二、植物细胞培养植物细胞培养是将植物细胞通过无性繁殖技术分离、培养在含有营养和生长因子的培养基上，使其在人工环境下继续生长和分化的技术。
其应用范围较广，不仅可用于植物的育种、遗传改良及叶绿素合成的研究，同时还被广泛用于研究植物药物、糖果等领域。
（一）培养基的配制植物细胞培养基在元素组成上与动物细胞培养基有所不同，其中可以添加植物生长素、糖、氨基酸和维生素等物质。
细胞培养技术的基本原理
细胞培养技术的基本原理随着现代科技的飞速发展，细胞培养技术被广泛应用于生物医学领域，成为了研究和治疗疾病的重要工具。
细胞培养技术是一种将单一细胞或者细胞群体在体外维持生长、增殖和分化的技术，被广泛应用于细胞生物学、分子生物学、生物医学研究等领域。
本文将从基本原理出发，探讨细胞培养技术的原理和方法。
细胞培养技术主要包括细胞分离、细胞培养和细胞鉴定三个阶段。
在细胞分离阶段，需要将组织或细胞从生物体中分离出来，通常使用消化酶等化学方法或机械方法进行分离。
分离之后的细胞需要在适当的培养基和生长条件下进行培养和增殖，以达到所需的数量和状态。
最后，在细胞鉴定阶段，需要对细胞进行形态学和生理学特征的检测，以确定其种类、纯度和质量。
细胞培养的基本原理是通过提供适当的培养基和生长条件，使细胞在体外呈现与体内相似的生长状态和生物学行为。
培养基是细胞培养的重要基础，由无菌的营养成分组成，包括必需氨基酸、糖类、胺基酸、维生素、微量元素等，以及适当的缓冲剂和生长调节剂。
在培养基的选择上，需要根据细胞类型和应用需求进行适当的调整和组合，以满足不同细胞的生长要求。
细胞的生长条件主要包括温度、CO2浓度、湿度和氧气含量等方面。
通常情况下，细胞需要在体温下培养，即37℃左右，CO2浓度为5%，湿度为90%，氧气含量取决于细胞类型和应用需求。
此外，还需提供适当的重力、振荡等机械刺激，以及不受污染的无菌环境，保证培养的细胞能够得到充分的营养和生长环境。
细胞培养的成功与否，还需要考虑到一系列细胞因素和培养因素。
细胞因素包括细胞的种类、种群密度、存活率、代数和分化状态等，而培养因素则包括培养基配方、培养时间、培养温度、气体含量和过量滋养物质等。
在每一次细胞培养的过程中，都需要仔细调节和控制各种因素，以确保培养的细胞状态和质量。
总之，细胞培养技术是一种重要的生物医学技术，具有广泛的应用前景。
细胞培养的基本原理包括培养基、生长条件和细胞因素等方面，需要在各方面进行细致的控制和调节，以确保细胞的生长和增殖。
实验室细胞培养的一般步骤
实验室细胞培养的一般步骤细胞培养是一项重要的实验室技术，广泛应用于生命科学研究以及医药产业中。
下面将为您介绍一般的细胞培养步骤，希望能为您提供一些指导意义。
第一步：制备培养基细胞培养的第一步是制备适合细胞生长的培养基。
培养基通常包括营养物质、氨基酸、维生素、生长因子等，可以为细胞提供足够的养分和环境条件。
根据不同的细胞类型和实验目的，制备不同种类和浓度的培养基。
第二步：分离细胞在细胞培养之前，需要将细胞从组织、器官或已有培养物中分离出来。
通常采用酶消化、机械剪切或离心等方法来分离细胞。
分离后，细胞可以在培养基中生长和繁殖。
第三步：细胞接种将分离出的细胞接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中。
接种密度要适当，不宜过稀或过密。
同时，需要将培养基中的氧气和二氧化碳平衡，通常使用CO2培养箱来提供适宜的气体环境。
第四步：细胞培养经过接种后，细胞开始在培养基中生长和分裂。
在培养过程中，需要控制细胞的温度、湿度和pH值，保持适宜的生长条件。
此外，定期更换新鲜的培养基可以提供足够的营养物质，维持细胞的正常生长。
第五步：细胞检测和观察细胞培养的过程中，需要定期对细胞进行检测和观察。
包括细胞数量的计数、形态的观察和生长曲线的绘制等。
通过这些检测和观察，可以了解细胞的健康状态、增殖速率以及其他相关参数。
第六步：细胞应用或冻存根据研究或实验的需要，可以选择将细胞用于进一步的实验、传代培养或冻存保存。
冻存细胞需要使用适当的冻存液，将细胞缓慢冷冻并存放在液氮罐中，以便长期保存。
细胞培养是一项需要耐心和细心的工作，每一步都需要严格控制条件和遵循操作规范。
只有如此，才能获得可靠的实验结果和高质量的细胞培养。
希望本文能为您提供参考，更好地开展细胞培养工作。
细胞培养的方法及注意事项
细胞培养的方法与注意事项细胞培养是将动物某一器官、组织如肝脏、肺、肾脏等取出，将其分散成单个细胞，在人工条件下，使之存活、生长和增殖的技术。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养：第一次培养，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，不更换培养物的生长器皿的培养过程。
传代培养：在培养过程中培养物分裂生长，长满培养空间，细胞之间相互接触而发生接触抑制，生长速度减慢甚至停止。
在这种情况下，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿中，再进行培养一、原代培养的方法：1、取材对于水产动物，取材的方法为：无脊椎动物取材用消毒海水或淡水暂养24小时；用酒精棉消毒体表；解剖需培养的组织和器官，放到消毒液中处理一段时间；取出，用灭菌BSS清洗3次鱼的取材用酒精棉消毒体表；打开腹腔（注意不能碰破肠道）；体表组织，处理方法同无脊椎动物。
原代培养过程技术路线图：①准备工作：实验台面用紫外灯照、70%酒精棉球擦；所用各种器械、培养液无菌；操作者用新洁尔灭和酒精擦手，穿衣、戴帽、口罩；实验动物体表用酒精消毒或放入无菌海水中。
②取材：在无菌条件下取出需要培养的器官或组织；如果是有菌的器官或组织需进行灭菌处理；取材要准确③培养材料的制备：欲培养的器官或组织洗去血污，剔掉多余成分。
剪成1mm3大小，用于外置块培养。
用胰蛋白酶消化，终止消化后，机械法吹打组织块，筛网过滤，过滤液离心1000rpm,10min，用培养液悬浮细胞，计数细胞密度，用于细胞培养。
④接种：外植块：用吸管将小的组织块均等地在培养瓶底排列好；反过培养瓶加入培养基，或5-6h后再加培养基；放入CO2培养箱培养；2-3d更换培养液或颜色变黄时更换；记录、每2-3d观察。
结果：1-3d，细胞从外植块中迁移出来分离细胞：将已分散的细胞悬液加到培养瓶或培养板中，并加少量培养液,细胞浓度为105-106个/ml。
不能少于5000个。
24h后加足培养液（防漂浮）。
细胞分离培养实验报告
一、实验目的1. 熟悉细胞分离培养的基本原理和操作步骤。
2. 掌握原代细胞和传代细胞培养的方法。
3. 学会细胞传代过程中细胞计数、细胞纯度鉴定和细胞活力检测。
二、实验原理细胞分离培养是指将生物体内的细胞取出，在体外模拟生物体内的生理条件，使其在人工培养条件下生长、繁殖和传代的过程。
细胞分离培养技术是细胞生物学研究的重要手段，广泛应用于生物工程、医学、生物学等领域。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 组织：小鼠结肠3. 试剂：胰蛋白酶、胶原酶、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、培养瓶、移液器、细胞计数板、显微镜等。
四、实验方法1. 细胞分离（1）取小鼠结肠组织，置于含胰蛋白酶和胶原酶的消化液中，37℃水浴消化30分钟。
（2）消化完成后，用吸管吹打组织块，使细胞充分分散。
（3）将细胞悬液过滤，去除组织碎片。
2. 细胞培养（1）将过滤后的细胞悬液接种于培养瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。
（2）每隔24小时更换一次培养基。
3. 细胞传代（1）待细胞长满瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞。
（2）收集细胞悬液，计数，调整细胞浓度。
（3）将细胞悬液接种于新的培养瓶中，放入培养箱中培养。
4. 细胞计数（1）取适量细胞悬液，加入细胞计数板。
（2）在显微镜下观察细胞计数。
5. 细胞纯度鉴定（1）取适量细胞悬液，进行细胞形态学观察。
（2）取适量细胞悬液，进行细胞免疫荧光染色。
6. 细胞活力检测（1）取适量细胞悬液，进行MTT法检测细胞活力。
（2）取适量细胞悬液，进行台盼蓝染色，检测细胞死亡率。
五、实验结果1. 细胞分离：消化后的细胞呈圆形或椭圆形，细胞浓度约为1×10^6个/mL。
2. 细胞培养：细胞在培养瓶中生长良好，呈单层贴壁生长。
3. 细胞传代：细胞传代过程中，细胞生长速度逐渐加快，细胞活力逐渐提高。
4. 细胞计数：细胞计数结果为1×10^5个/mL。
5. 细胞纯度鉴定：细胞形态学观察和免疫荧光染色结果显示，细胞为小鼠结肠细胞。
细胞培养的基本方法-V1
细胞培养的基本方法-V1
细胞培养是一种常见的实验技术，用于对细胞进行研究和应用。
细胞在培养的过程中需要提供适当的营养和环境条件。
下面将介绍细胞培养的基本方法。
一、准备培养皿和培养基
在细胞培养实验中，培养皿和培养基的选择非常重要。
培养皿可以选择培养板、培养瓶等不同类型的培养容器。
培养基是指包含细胞所需的营养成分和生长因子的液体。
根据不同的细胞类型，需要选择适当的培养基。
二、细胞的维护和传代
在进行细胞培养之前，需要对细胞进行维护和传代。
维护细胞需要提供适当的培养基和环境条件。
传代细胞需要进行细胞的剥离和重新种植。
细胞传代过多会导致细胞老化和变异，因此需要定期进行细胞株的新建。
三、细胞的分离和分化
细胞培养实验需要分离和分化细胞。
分离细胞可以通过消化酶和机械分离的方法。
分化细胞可以通过特定的培养基和生长因子的添加来实现。
四、细胞凋亡和衰竭
在细胞培养实验中，常常会出现细胞凋亡和衰竭的现象。
细胞凋亡是
指细胞自身程序性死亡。
细胞衰竭是指细胞逐渐停止生长并死亡的过程。
这些现象可能导致实验结果的不准确，因此需要注意细胞的状态和处理方法。
五、细胞的检测和观察
在进行细胞培养实验时，需要对细胞的状态进行检测和观察。
可以通过显微镜观察细胞的形态和数量，或者通过生化实验检测细胞的代谢和功能。
细胞培养实验是一项复杂的技术，需要按照规范操作和注意细节。
以上介绍的基本方法仅供参考，实验者在进行实验时应根据实际情况进行具体操作。
第四章 动物细胞培养的基本技术和方法
境
二、细胞传代方法
1.贴壁细胞的消化法传代：
（1）吸弃或者倒掉瓶内陈旧的培养液
（2）于培养瓶内加入适量消化液 （3）消化2-5min，在显微镜下观察细胞状态，发现细胞质回缩，细胞间隙 增大后，应即刻停止消化 （4）吸除或者倒掉消化液 （5）吸管吸取新鲜培养液，按照顺序吹打瓶壁细胞，注意动作要轻柔 （6）计数后，按要求的接种量接种在新的培养基内
结果分析：
（1）作图法 （2）公式法
三、细胞培养的污染检测及排除
培养细胞的污染包括：微生物、化学物质、细胞交叉
1.微生物污染
污染途径：空气、器材、操作、血清、组织样本 污染对细胞的影响：抑制细胞生长，产生有毒物质，促使细胞死亡 微生物污染的检测与排除： （1）真菌污染 培养液中有白色或者浅黄色的漂浮物，细胞间有丝状菌丝体，可以采用霉菌素或者酮康唑对细 胞进行处理 （2）细菌污染 培养液短期颜色变黄、变浑浊，使用5-10倍抗生素剂量冲击法 （3）支原体感染 相差显微镜检测；荧光染色法；电镜检查；DNA分子杂交检查
2.悬浮细胞的传代方法：
（1）直接传代法 （2）离心传代法
三、细胞系的维持
细胞系的维持是通过换液、传代、再换液、再传代和细胞冻存实现的 注意事项： （1）做好细胞系的档案记录工作
（2）遵从细胞生长规律
（3）防止细胞间的交叉污冻存、复苏和运输技术
一、细胞的冻存
第四节 动物细胞传代培养技术
一、原代培养的首次传代
传代：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程 首次传代注意事项： （1）待细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面后再传代 （2）传代时候不同细胞需要消化的时间不同，要根据需要具体观察，
及时进行处理
（3）首次传代时，细胞接数量要多一些，促使细胞尽快适应生长环
分离培养的操作方法
分离培养的操作方法分离培养是一种常用的细胞培养方法，它可以将不同种类的细胞分离开来单独培养，以便进行研究。
下面将介绍分离培养的操作方法。
1. 准备工具和培养基进行分离培养需要准备一些基本的工具和培养基，包括组织培养皿、吸管、离心管、离心机、细胞培养基、酶消化液等。
在使用之前，需要先对工具和培养基进行消毒处理。
2. 组织处理将待分离的组织取出，去除表面的血管和结缔组织等杂质，然后用刀片将组织切成小块。
将组织块放入含有酶消化液的培养基中，用吸管将培养基慢慢吸入离心管中，避免气泡的产生。
然后将离心管放入37℃的恒温培养箱中，进行酶消化。
3. 离心分离经过酶消化后，组织块会被分解成单个细胞。
将离心管放入离心机中，进行离心分离。
离心的速度和时间需要根据实验要求来确定。
离心后，可分离出不同密度的细胞。
4. 细胞培养将分离出的单个细胞放入培养皿中，加入适量的细胞培养基，放入恒温培养箱中进行培养。
培养的条件需要根据细胞的特性来确定，包括温度、CO2浓度、培养时间等。
需要注意的是，不同种类的细胞对培养条件的要求有所不同。
5. 细胞观察在培养的过程中，需要对细胞进行观察和记录。
可以使用显微镜观察细胞的形态和数量，也可以通过细胞培养基的颜色变化来判断细胞的生长情况。
如果需要进行细胞传代，可以根据实验要求进行操作。
分离培养是一种基础的细胞培养方法，可以用于分离不同种类的细胞，以便进行研究。
在进行分离培养的过程中，需要注意工具和培养基的消毒处理，以及不同细胞对培养条件的要求。
通过分离培养，可以更好地了解细胞的特性和功能，为细胞生物学研究提供基础支持。
细胞培养与细胞系的建立
细胞培养与细胞系的建立细胞培养是生命科学研究中必不可少的技术手段之一，它可以通过控制和维持细胞外环境，使细胞在体外生长和繁殖。
由于细胞培养技术可以在较短时间内得到大量的同种细胞，使得生物学和医学等领域的实验变得更加容易和方便。
而细胞系则是指由同一种细胞建立起来的一个细胞群体，是细胞生物学、分子生物学、药理学等领域里必不可少的研究对象。
一、细胞培养骨干技术1. 细胞培养的基本条件：细胞种类、培养基、培养条件（温度、CO2浓度、湿度、通气等）2. 细胞划分：原代细胞、细胞系、细胞株3. 细胞分离方法：酶消化、机械分离、胶质滤纸过滤、胶层分离、绒毛分离等4. 细胞凋亡与细胞健康状况监测：细胞膜容器渗透检测、Trypan蓝染色法、荧光染色等二、细胞系建立的过程1. 细胞培养条件的筛选：种类、培养基和培养条件2. 结合基因检测识别细胞：统一接种方法、培养期间生长速度的观察3. 细胞系的测定：细胞形态、DNA指纹技术、生物学/化学标记技术以及微镜下的观察三、细胞系的应用1. 细胞系的作用和意义：为生命科学研究提供常见、熟悉和稳定的实验平台2. 细胞系在生物学、分子科学、临床医学、肿瘤学、流行病学和毒理学等领域的应用3. 建立细胞系的意义：有效解决生命科学研究的问题，为人类健康提供保障细胞培养和细胞系建立是细胞生物学及其它相关工作的基础。
虽然细胞培养技术在不同领域的使用有着不同的需求和要求，但这种技术对生命科学的推进和人类健康的提高产生了极深的影响。
我们相信，随着科研工作的不断深化和发展，细胞培养和细胞系建立的技术也会不断地得到完善和发展，为人类的身体健康作出更大的贡献。
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细胞培养的基本方法-细胞分离技术细胞分离技术一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。
细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。
下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。
1. 胰蛋白酶（Trypsin）•在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。
让组织碎片沉淀，去除上清液。
重复清洗2到3次。
•将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。
加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。
•在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
•移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
•在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。
如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
•通过无菌不锈钢丝网（100〜200mm过滤，分散所有剩余组织。
计数和接种细胞，进行培养。
2. 胶原酶（Collagenase）•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片几次。
•加入胶原酶（50〜200单位/ml，溶解在HBSS中）。
•在37C孵育4到18小时。
加入3mM CaCI2增加解离效率。
•通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。
如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。
•通过离心在HBSS中清洗悬液几次。
•再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
3. Dis pase•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。
•加入Dispase （0.6〜2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液）•在37C孵育20分钟到几个小时。
•通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。
如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase。
•通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。
•再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
二、从原培养容器中分离细胞：以下是从基层迅速分离细胞，且保持细胞完整性的一般步骤。
这一步骤并不意味着对于所有细胞系的广泛应用，每一种系统最佳条件和施用浓度应该根据经验加以确定。
•再次培养时检测细胞的活性。
•细胞的活率应该超过90%•对于无血清培养基，降低胰蛋白酶使用量。
1. 移弃使用过的细胞培养基。
2. 使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA （ethylene diamine tetraacetic acid ，乙二胺四乙酸•）清洗细胞（看表确定正确的清洗溶液）。
在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液，通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层，然后去除清洗液。
3.以2〜3ml/25cm2的量，加选择的分离液（见表）到培养瓶对着细胞的一面。
确保分离液覆盖细胞层。
在37C孵育培养瓶，轻轻摇动培养瓶。
通常，在5到15分钟内，细胞就会脱落。
细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。
仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。
对难于从培养瓶基层分离的细胞系，可以轻轻敲打，以加速分离过程。
4. 当细胞完全分离时，垂直放置培养瓶，让细胞流到培养瓶的底部。
在培养瓶中加入完全培养基，通过移液管在单层细胞表面反复吹打来分散细胞。
计数并再次培养细胞。
5. 对于无血清培养基，加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
通常使用 1 : 1（V : v）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制剂到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性。
第三节细胞的冻存与复苏为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异，有时因寄赠、交换和购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，最佳的策略是进行低温保存。
这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。
现简要介绍深低温保存法（—70C196C）的特点。
细胞深低温保存的基本原理是：在一70C以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
细胞低温保存的关键，在于通过0~20C阶段的处理过程。
在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。
一、细胞的冻存：为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。
冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。
有几种普通培养基用来冻存细胞。
对于包含有血清的培养基，成分可能如下: ♦包含10%甘油的完全培养基，♦包含10%二甲基亚砜（DMSO的完全培养基，♦50%细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基，或♦50% 细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚砜的新鲜培养基。
对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是：♦50%细胞条件无血清培养基和50%包含有7.5 %二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基，或♦包含有7.5 %二甲基亚砜和10%细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。
1. 悬浮细胞200〜400g离心5分钟沉淀细•计数将要冻存的活细胞。
细胞应该处于对数生长期。
以大约胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
•以1X 107到5X 107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5 X 107到1X 107在无血清培养基中，再次悬浮细胞。
•分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4C冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。
•细胞以1 C /分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70C到-90C的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。
2. 贴壁细胞•使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。
•在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。
•以大约200g离心5分钟沉淀细胞。
使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
•以5X 106到1X 106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。
•分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入4C冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。
•细胞以1 C /分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70C到-90C的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。
二、冻存细胞的复苏：冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。
冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。
若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。
1. 直接铺板方法•取出贮存细胞，37 C水浴中快速融化。
•直接用完全生长培养基铺板细胞。
1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。
进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3X 105活细胞/ml。
•培养细胞12到24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。
2. 离心方法•取出贮存细胞，37 C水浴中快速融化。
•把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。
•以大约80X g离心2到3分钟。
•弃去上清。
•在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。
•细胞铺板，细胞接种应该至少为3X 105活细胞/ml。
三、细胞的分化、衰老与死亡1细胞的分化：一个成年人全身细胞总数约1012个，可以区分为200多种不同类型的细胞: 形态结构，代谢，行为，功能等各不相同。
追根溯源，这么多种细胞均来自一个受精卵细胞。
所以，通常把发育过程中，细胞后代在形态、结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化。
细胞分化发生在胚胎阶段，也发生在胎儿出生以后，乃至成人阶段。
例如，人体血细胞的产生和分化，这个过程在人的一生中一直持续着。
由旺盛生长不断分裂的细胞，转入分化，通常从细胞周期中G1期开始时一个确定的点G0点“逃逸”出细胞周期。
旺盛生长分裂的细胞和各种分化了的细胞，它们的基因表达和代谢活动各不相同。
2. 细胞的衰老：体外细胞培养实验证明:成纤维细胞：来自胎儿传代50次后衰老死亡，来自成人传代20次后衰老死亡(与具体年龄有关)；来自小鼠传代14--28次后衰老死亡,来自乌龟传代90--125次后衰老死亡。
细胞衰老过程中会发生一系列的变化，包括：蛋白质合成速度降低，已有蛋白质结构变化，特异蛋白质成份出现；同时，细胞核，线粒体，膜系统、骨架系统等都有结构、功能的改变。
细胞衰老原因，尚无定论，出现过好几种理论与假说，其中得到较广泛认可的是“自由基损伤假说”。
3. 细胞凋亡：细胞的死亡是个体存活的正常现象，常见的细胞死亡形式有3种：坏死、凋亡和细胞毒性。
多细胞生物的生命活动中，因为环境因素的突然变化或病原物的入侵，导致一部分细胞死去，称为细胞的病理死亡，或细胞坏死。
坏死是细胞暴露于严重的物理或化学刺激时导致的细胞死亡；细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于其它两种细胞死亡机理，如杀伤T细胞的细胞毒性作用。
还有一种情况，一部分细胞的死亡是生物个体正常生命活动(代谢、生长、发育、分化)的一个必要部分；似乎带有“牺牲局部，保全整体”的意味。
这种情况下的细胞死亡，明显地受遗传控制，称为细胞凋亡。
凋亡(Apoptosis )则是程序性的、正常的细胞死亡，是机体清除无用的或者不想要的细胞的手段。
它与细胞坏死是两个截然不同的过程，无论从形态学、生物学还是生化的特征来说，都有明显的区别。
细胞凋亡现象普遍存在于生物界。
细胞凋亡与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用，在多细胞动物的发育、形态建成与维持中扮演至关重要的角色。
作为细胞的一种基本生命现象，凋亡失控的结果将是可怕的：凋亡不足时，易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡过量则可能产生获得性免疫缺陷综合征(HIV)、重症肝炎与退行性神经疾病，如老年性痴呆症( Alzheimer's disease )、帕金森氏症(Parkinson's disease )。
因此研究细胞凋亡及其机理具有重要的理论和实践意义。
细胞凋亡与坏死的区别坏死形态学特征-膜完整性丧失，胞浆和线粒体膨胀，全细胞裂解生化特征-离子内环境失调，非能量依赖性的（被动过程，在4°C也可以发生），随机消化DNA（电泳显示为DNA弥散状态），P ostlytic DNA 断裂生理学特征-影响群组细胞由非生理学因素引起（如补体攻击、代谢中毒、缺氧等）噬细胞吞噬，,被巨周围有明显的炎症反应凋亡形态学特征-胞膜出芽，但保持完整，染色体聚集在核膜周边，胞浆收缩、细胞核凝集，最后细胞分裂为凋亡小体，Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加生化特征--ATP依赖性的（主动过程，在4°C不能发生），以核小体为单位剪切DNA（电泳显示为DNA ladder ），Prelytic DNA 断裂，线粒体释放多种因子至胞浆中（细胞色素AIF），Caspases级联活化，膜对称性改变（PS外翻）生理学特征--只影响单个细胞，由生理学刺激诱导（如生长因子缺乏、激素环境改变等）被临近细胞和巨噬细胞吞噬无炎症反应。