叶绿素的提取分离定量以及理化性质的探究

叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定

生命科学学院09级生物学基地班王栋

一、实验目的

1、掌握提取和分离叶绿体色素的方法

2、掌握测定叶绿体色素含量的方法

3、熟悉叶绿体色素的理化性质及吸光特性

4、了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相关性

二、实验原理

1、叶绿体色素是绿色植物将光能转化为化学能的重要物质，一般包括叶绿素和类胡萝卜素，而前者包括叶绿素a和叶绿素b，后者包括β—胡萝卜素和叶黄素。叶绿体中的色素具有吸光的性质，可用分光光度计在某一特定波长下测定色素溶液光密度，并由此计算出各个色素的含量。叶绿体色素主要吸收高波长的红橙光和低波长的蓝紫光。

2、叶绿体色素不溶于水，但能溶于有机溶剂，利用不同种类色素脂溶性不同的特点，可以用乙醇或丙酮提取色素，用不同的有机溶剂萃取或用色谱法进行分离。

3、利用四种叶绿体色素极性和分子量的差异，以四氯化碳为展开剂可以将四种色素彼此分离。

4、利用以下公式可以计算各种叶绿体色素的含量：

①Chla（μg /ml）=12.7 OD663－2.69OD645

Chlb（μg /ml）=22.9 OD645－4.68 OD663

ChlT（μg /ml）=Chla + Chlb

CX·C=（1000OD470－3.27 Chla－104Chlb）/229

式中Chla、Chlb：叶绿素A、B的浓度；CX·C：类胡萝卜素的总浓度；OD663、OD645和OD470：叶绿体色素提取液在波长663nM、645nM和470nM下的消光度。

②0.1ml提取液中ChlX含量（μg ）=ChlX（μg /ml）×0.1ml×稀释倍数（30）

③ChlX含量（μg /g）=0.1ml提取液中ChlX含量（μg ）×100÷样品鲜重

5、叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，且叶绿素中的镁不稳定，易被其他元素替代。

三、实验材料、药品和用具

新鲜菠菜叶片、玉米叶片；

丙酮、四氯甲烷、浓盐酸、30%KOH-甲醇溶液、醋酸铜晶体、乙醚、蒸馏水

剪刀、研钵、分光光度计、滤纸、分析天平、试管若干、烧杯若干、量筒、移液管、胶头滴管

四、实验操作

1、提取叶绿素

2.0g和玉米叶片0.2g，如下操作：

剪碎材料加入5ml3研磨、匀浆

10ml 过滤丙酮搅拌

2、吸光值测定与定量

分别取0.1ml两种色素提取液，用80%丙酮稀释到3ml，测定菠菜叶片色素提取液400—700nm范围内的吸光值（以10nm为间隔），测定玉米叶片色素提取液645nm处和663nm处的吸光值。根据公式计算叶绿素的含量。

3、叶绿素的分离

A、取圆形定性滤纸一张，用毛细管吸取叶绿体色素提取滴在圆形滤纸中心（20次左右），使色素扩散的宽度限制在0.5 cm以内，保证叶绿素扩展速度均匀。在圆形滤纸中心戳一圆形小孔（直径约3mm），将做好的纸捻一端插入圆形滤纸的小孔中，另一端与滤纸刚刚平齐（勿突出）。在培养皿中加入适量的四氯化碳，把带有纸捻的圆形滤纸平放在培养皿上，使纸捻下端浸入展开剂中。迅速盖好培养皿。展开剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。

B、取长形滤纸一条，也点样后层析分离。将长形滤纸放入盛有四氯化碳大试管中，进行层析后获得线形不同色素条带，分别剪下后溶于80%丙酮，测定400—700nm吸收光谱。

4、叶绿体色素理化性质探究

A、荧光现象：取叶绿体色素提取液少许与试管中，分别用反射光（俯视试管）和透射光（面朝光源举起试管）照射，观察现象。

B、光的破坏作用：取叶绿体色素提取液少许，稀释2—5倍后分装于两个试管，分别置于黑暗中和强光下（光照培养箱中），2—3小时后观察试管中颜色的变化。

C、铜代反应：取上述色素提取液少许于试管中，一滴一滴加6N的浓盐酸，直至溶液颜色出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液，则又产生较深的绿色。此即形成了铜代叶绿素。

D、皂化反应：取叶绿体色素提取液2 mL于大试管中，加入4mL乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢加人3mL蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻，溶液即分为两层，色素已全部转入上层乙醚中。用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中，再用蒸馏水冲洗1-2次。在色素-乙醚溶液中加入足量30％KOH－甲醇溶液，充分摇匀，再加入蒸馏水约3-5 mL，摇匀静置。可以看到溶液逐渐分为两层上层是黄色素，下层是绿色素。

五、数据记录

1、菠菜叶片质量：2.0078g；玉米叶片质量：0.2016g

2、吸光值测定：

波

长/nm

吸收光谱

菠菜玉米叶绿素a 叶绿素b 叶黄素胡萝卜素

400 0.294 0.169 0.041 0.096 0.156 410 0.362 0.214 0.057 0.105 0.16 420 0.4 0.218 0.069 0.117 0.165 430 0.478 0.262 0.097 0.104 0.143 440 0.462 0.189 0.105 0.125 0.151 450 0.348 0.055 0.11 0.11 0.159 460 0.333 0.027 0.153 0.072 0.122 470 0.311 0.024 0.113 0.103 0.123 480 0.216 0.014 0.042 0.011 0.125

490 0.107 0.004 0.008 0.019 0.072 500 0.046 0.002 0 -0.004 0.019 510 0.022 0 -0.004 -0.011 -0.009 520 0.015 0.003 -0.003 -0.023 -0.029 530 0.015 0.004 -0.003 -0.018 -0.025 540 0.016 0.005 -0.003 -0.019 -0.027 550 0.016 0.005 -0.002 -0.022 -0.031 560 0.018 0.007 0 -0.016 -0.024 570 0.026 0.014 0 -0.016 -0.024 580 0.035 0.022 0.005 -0.015 -0.024 590 0.036 0.019 0.005 -0.015 -0.021 600 0.039 0.021 0.005 -0.014 -0.021 610 0.051 0.035 0.006 -0.013 -0.02 620 0.055 0.039 0.004 -0.012 -0.019 630 0.05 0.03 0.007 -0.01 -0.015 640 0.07 0.028 0.029 -0.009 -0.008 645 0.097 0.047 0.041 0.041 -0.008 -0.007 650 0.127 0.073 0.042 -0.007 -0.007 660 0.229 0.194 0.032 -0.001 0.003 663 0.246 0.089 0.215 0.028 0 0.004 670 0.185 0.166 0.013 -0.001 -0.004 680 0.043 0.038 -0.004 -0.01 -0.017 690 0.005 0.002 -0.009 -0.012 -0.02 700 0 -0.002 -0.008 -0.013 -0.021

六、实验结果

1、吸光值测定与定量：