酵母转化

酵母细胞转化

1. 挑取INVScI单菌落于5 mL YPAD培养基的试管中，30℃振荡（约250 rpm)培养过夜，OD600为1-2，取2 mL转入30 mL YPAD的50 mL的三角瓶中，30℃振荡（约250 rpm）孵育直至OD600为0.6（注：高培养密度会导致转化率下降）。

2. 4℃下1500×g离心10 min收集细胞。

3. 用1×TE Buffer ( pH 7.4) 冲洗细胞一次。

4. 用含200 mMLiAc 10-15 mL 的1×TE Buffer 9（无菌）重悬细胞，室温下放置10分钟。

5. 2500g离心收集细胞弃上清。

6. 用含200 mMLiAc的0.5 mL 1×TE Buffer(无菌)重悬细胞，用于转化。

7. 每次转化用上述制备好的感受态细胞溶液100μL。

8. 在含有100μL感受态细胞的离心管中，加入1μg待转化质粒DNA和100μg变性鲑鱼精DNA(salmon sperm DNA)。

9. 加入700μL的1XLiAc/40% PEG-3350/1XTE，彻底混匀。

10. 30℃孵育溶液30 min。

11. 加入88μL的二甲基DMSO，混匀，42℃热激7 min。

12. 高速离心10s，收集细胞。

13. 1mM 1× TE重新悬浮，再次离心，去除上清。

14. 重新加入50-100μL1×TE，混匀，均匀涂抹在筛选平板上。

15. 30℃生长2-3d，观察结果。

解脂耶氏酵母转化过程

-80℃冰箱取出保存的polh菌株，在YPD平板上划线，28℃培养约24小时长出单菌落，挑单菌落到YPD液体培养基（500ml三角瓶，50ml培养基），摇瓶培养约16小时，此时OD600=0.8左右，取其中1ml转接到另一瓶YPD液体培养基中，摇瓶培养5小时左右OD600约0.8，准备做感受态，并转化。

1.离心收集菌体，用ph7.5的TE（改为10ml无菌水）重悬菌体，取1ml到EP管中，10000rpm离心1min，去上清；
2.加600μl 醋酸锂（0.1M pH 6.0）
3.在28℃水浴锅中保温1h；
4.3000rpm离心2min，弃上清；
5.加40μl醋酸锂轻轻悬浮细胞；（轻轻悬浮）
6.40μl的感受态细胞，加2μl ssDNA（重新处理）和3μl转化用的DNA；（轻轻混匀）
7.在28℃水浴锅中保温15min，然后加350μl PEG4000－醋酸锂溶液和16μl DTT;（轻轻混匀）
8. 在28℃水浴锅中保温1h,再加40μlDMSO,39℃热激10min；
加一步：4000rpm,5min离心收集菌体
9.加200μl醋酸锂重悬，再涂在5（2块平板）块选择平板上（120μl（100μl）/平板）
我每次平行做5管，共涂10块平板。

MD平板要倒稍微厚点儿，不要太薄;涂平板时，平板要干。

酵母转化(陈晗俊)..

酵母转化(一)原理：我们采用的是PEG/ LiAc法转化酵母。

PEG是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000 左右的PEG才会发挥最大的转化促进作用。

本文使用的PEG分子量为3350 ,实验结果表明促转化效果可以达到103～105cfu/μg 。

PEG在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。

PEG的浓度是务必适宜,这一点很重要。

LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA 。

鲑鱼精担体DNA 为短的线形单链DNA ,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA 酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA 中发挥协助作用。

在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA 打开,保证鲑鱼精担体DNA在转化实验体系中以单链形式存在(二)材料、仪器设备及试剂：1.SD 培养基：●YNB： 1.6 g/L●硫酸铵：5g/L●氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加●调节pH=5.8，121°灭菌15min2.YPDA培养基●胰蛋白胨20g/L●酵母浸膏10g/L●琼脂20g/L(固体)●腺嘌呤15ml 0.2% 腺嘌呤/ L●调节pH =7.5，121°灭菌15min3.0.9%NaCl（w/v）●NaCl: 0.9g●milipore水定容到100ml●灭菌121°，20min4.100%DMSO从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存5.10×TE（pH=7.5）：（0.1M Tris-HCl，10mM EDTA）●Tris-HCl 1.211g/100ml●EDTA 0.37g/100ml●调节pH=7.5, 121°，20min6.10×LiAc（pH=7.5）●1M LiAc 10.202g/100ml●用醋酸调节pH=7.5，121°灭菌20min7. 1.1×TE/LiAc●Tris-HCl 11ml 10×LiAc（pH=7.5）/100ml●EDTA 11ml 10×EDTA （pH=7.5）/100ml●调节pH=7.5, 121°，20min8.50% PEG3350：●PEG3350：50g●已灭菌的milipore水：定容到100m●（可用50°水浴助溶，PEG易吸水，不可灭菌）9.PEG/LiAc：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中终浓度10mlPEG3350 40% 8ml 50%PEG3350TE buffer 1×1ml 10×TELiAc 1×1ml 10×LiAc10.变性的鲑鱼精DNA(10mg/ml)ipore水，70%酒精棉球，50ml离心管4个，ep管一盒，15ml试管架，50ml试管架，ep管架(三)具体方法：◆A：酵母感受态制备1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30°培养3天左右。

试验总结的几种高效酿酒酵母转化方法

电转法设计方案一:感受态制备：1 .挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养过夜；2 .取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养约16-18h（OD:1.3-1.5）;3 .于4c离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；4 .加入1ml,pH7.5,10灯E缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml10*iAc,旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；5 .再加入0.4ml1mol/LDTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6 .于4c离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7 .2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8 .每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70C冰箱保存。

电转化：1 .向感受态细胞中加入约5〜10ug（体积小于10ul）的DNA,用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2 .擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV,25uF,200欧姆；3 .立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30c静置1h;4 .离心，弃上清，加入1mLYEPD后，于30C、200rpm培养2h;5 .离心得菌体后，吸除550ul上清液，然后按150ul版进行涂板。

说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。

设计方案二：感受态制备：1 .挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养过夜；2 .取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养约16-18h（OD:1.3-1.5）;3 .于4C,5000rpm,5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100mMLiAc,10mMDTT,0.6M山梨醇，10mMTris-HCl,pH7.5）,室温静置30min;4 .4C,5000rpm,5min离心收集菌体，用1.5mL1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；5 .每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70C冰箱保存。

酵母转化手册(译自Yeastmaker

clontechclontech提得3x1材料h的readyto供提供预先混习交流不做其transforma方法适用于所常规转化方的转化效率是稀有的相互个特殊又重酵母细胞105转化子uogomediap混合好的培养表1酵母转其他用途如ationsyst所有的酵母方法更为高效是必要的条互作用此方重要的步骤
质粒 DNA（浓度、纯度高）变性的**Yeastmaker 宿主 DNA (10 µg/µl)
Small‐Scale （1.5 ml tube） 100 ng 5 µl
Library‐Scale （15 ml tube） 5–15 µg* 20µl
（* For example, use 5 µg of bait + 10 µg of prey for yeast two‐hybrid library cotransformation. ）
50 µl 500 µl 30 min
600 µl 2.5 ml 45 min
6. 加入 DMSO，轻柔混匀
20 µl
160 µl
7. 在 42℃水浴锅中温浴
（注意：期间 Small‐Scale 每隔 5 min，Library‐Scale 每隔 10 min，轻轻倒混几次）
15 min
20 min
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
B．方法：转化酵母感受态细胞 1. 材料 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 酵母感受态细胞(Section 6.A) PEG/LiAc (Section 4) 0.9% (w/v) NaCl DMSO 2. 将下列组分加入到已经预冷的无菌离心管中，混合均匀。

酵母转化的原理

酵母转化的原理
酵母转化指的是酵母菌体内发生的一系列生化反应，将底物转化为产物的过程。

其原理是酵母菌体内的酶作用下，将底物分解为较小的分子或化合物，进而合成新的产物。

酵母转化的具体过程包括底物的吸附、底物与酵母酶的结合、催化反应、产物的释放等。

其中，底物吸附与酵母酶的结合是酵母转化的第一步，在这一步中，底物需要与酵母酶发生亲和作用，才能进一步发生催化反应。

催化反应是酵母转化的核心步骤，酵母酶将底物分解为较小的分子或化合物，从而形成新的产物。

催化反应的速度受到多种因素的影响，如底物浓度、酵母酶浓度、反应温度、反应pH等。

在酵母转化的过程中，产物的释放同样是十分关键的一步。

产物必须及时地从酵母菌体中释放出来，以避免在酵母菌体内积累过多的产物，影响酵母菌体的生长和发育。

总之，酵母转化是一种复杂的生化过程，是酵母菌体内多种酶协同作用的结果。

了解酵母转化的原理，对于优化酵母发酵、提高发酵产物的质量和产量等方面具有重要的作用。

- 1 -。

酵母电转化

在精编分子生物学实验指南上有一部分讲到了酿酒酵母，电转化具体过程如下：1）将转化用酵母菌株的单菌落接种于5ml YPD培养基中，30度过夜培养至饱和。

2）转化前一天晚上，在装有500ml YPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30度剧烈振摇，直到细胞密度达1*10的8次方（OD600约为1.3-1.5）。

3）于4度4000g离心收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。

为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。

如果不需要可接步骤64）加入10ml，pH7.5，10*TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml10*乙酸锂，旋转摇匀，于30度请请摇动45min5）加入2.5ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000-6000g于4度离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：第一次沉淀：250ml冰冷的水第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇最终的OD600应为约2007）电转化：在无菌冰冷的微量离心管中加入40ul 酵母菌细胞和小于等于100ng 待转化的DNA（体积小于5ul），混匀。

转移至冰冷的电转槽中，接下来按照你的电穿孔仪的说明操作就可以啦。

8）往电击槽中加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀9）直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30度培养3-6天，直到平板上出现菌落。

步骤7-8可能会因电转仪的不同而有所不同。

其实用乙酸锂法也很方便的。

在一本酵母操作的实验手册上还看到了一个lazy-bones的转化实验方法，按照它做下来也得到了菌落。

酵母感受态细胞的制备及酵母转化

a
小 1.5ml 0.1μg 0.1μg 0.1mg 0.1ml 0.6ml 70μl
大 50ml 20-100μg 10-50μg 2-0.5mg 20mg 8ml 60ml 7.0ml
5S(14krpm)
5min (1000×g) 1.0ml1 为自激活对照； pGADT7- T+pGBKT7-53 阳性对照；pGADT7-T+pGBKT7- lam 阴性对照。为了检测每一个质粒的转化效率， 100μl 水稀释 1μl 转化子，用铺于 SD-Leu 和 SD-Trp 平板上；为了检测共转化效率，按不同比例（1:1000，1:100，1:10）稀释转化子，取 100μl 涂于 SD-Leu-Trp 平板上；酵母培养基： YPD medium (1L) Dific peptone（可用 OXOID 公司的胰化蛋白胨）20g/L Yeast extract Agar（for plates only）加蒸馏水调 pH 6.5 高压灭菌，待冷却到 55℃左右，加 40％的葡萄糖 50ml 至终浓度 2％。 40％葡萄糖：40g 葡萄糖加 60ml 左右的蒸馏水溶解，然后定容至 100ml，过滤灭菌，4℃ 存放。注意，一定不能高压灭菌，因长时间高温会使葡萄糖变黑。 YPDA medium (1L) 在上面的 YPD 培养基中每升加 0.2% 的腺嘌呤半硫酸盐（adenine hemisulfate）15ml 至终浓度 0.003%，高压灭菌。 0.2% adenine he misulfate： 0.2g 加 100ml 蒸馏水溶解即可。注：如果需要在 YPD(YPDA) 中加抗生素如 kanamycin，在上面准备的培养基中加 50mg/ml 的 Km0.2-0.3ml 至终浓度 10-15mg/L SD medium (1L) 无氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids, YNB） Dific 琼脂 10×DO 蒸馏水浓度为 2％。注：如果使用固体 DO，1L 中加 0.64g。下面氨基酸成分是无缺陷 DO 中所需的所有氨基酸：

毕赤酵母转化相关整理

1.电转化相关事项①在电转完毕涂MD平板时，我是不加抗生素的，因为MD平板本身就有组氨酸营养缺陷的筛选标记，据说再加抗生素很容易压力过大，不长菌。

20度培养48-55h后，酵母长出来，挑单菌落，到YPD液体培养基（刚筛选时我一般只加0.5mg/ml的G418），菌长好后，提基因组，验证插入基因和拷贝数，拷贝数这时也可以通过添加不同浓度G418的平板来验证。

如果基因插入没问题，再培养诱导，测活。

②YPD可以直接灭菌，刚开始我葡萄糖单灭，后来发现酵母粉蛋白胨葡萄糖一起加也没问题。

③.温度方面，毕赤酵母最常用的是30度，只要不长时间超过32度就没有问题，诱导温度与表达的蛋白是否被降解有关，但通常30度。

④.生物素方面，只要用到酵母粉的培养基都可以不用。

⑤. MD是的氮源是无机氮，没有组氨酸，空的毕赤酵母不在它上面不会长，长的有99％都是重组菌⑥可以用G418 YPD平板筛选高考贝菌，一般情况下拷贝数高的表达量就高（但有些蛋白酶不一定表达量高就好），一般情况下MD平板上长出的菌可以直接用牙签挑到1.5mg/ml或2mg/ml G418的平板上，这个时候一般培养三天时间，长的大的菌落可能就没有几个了，这几个大的获得高表达的可能性是最大的。

⑦灭菌温度方面，只要有葡萄糖的都115度20分钟，没有的都可以121度20分钟。

⑧甲醇诱导方面，一天加一次终浓度1％的甲醇即可，前提条件是第一次一定要换掉培养基。

⑨蛋白降解方面，在发酵上一般通过调整pH,收获时间来解决，通过诱导温度是不理想的；从宿主上可以选用SMD1168，SMD1165,SMD1163,SMD1168用的最多，从分子上，可以突变掉目标蛋白的酶切位点。

可以通过不同的载体不同的线性化位点对已有的高表达酵母进行再转化，以获得更高表达的菌株；些方法也可以进行两种不同蛋白的共表达。

⑩电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。

重组法酵母转基因的原理与操作流程

重组法酵母转基因的原理与操作流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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3.1酵母热激转化A.准备工作：1.固态YPD培养基，液态YPD培养基，20%葡萄糖，筛选培养基，2.预冷无菌水，100mM LiAc，1M LiAc，鲑鱼精DNA，PEG33503.50ml圆底离心管，2ml预冷离心管，1.5ml预冷离心管B.酵母感受态的制备1.提前三天活化酵母菌株，用接种环沾菌液涂YPD平板，30℃培养2.转化前一天晚上，挑取单菌落于50ml YPD液体中，30℃下220rpm摇培12h（第二天早上OD达到1.0左右，浓度为5×107左右即可）3.吸5ml菌液于45ml YPD瓶中，30℃下220rpm摇培2~3h4.OD达到0.4至0.6之间即可，将菌液倒入50ml圆底离心管中，冰上冷却15min（遇冷大离心机，准备50ml圆底离心管，无菌预冷-20℃；LiAc，PEG3350(感受态制备中PEG 3350的作用, 起到乳化剂和缓冲剂的效果，PEG 3350以上的都可以，我一般用的PEG 8000效果更好)，DDW均提前4℃遇冷）5.4℃下2500rpm离心5min6.弃上清，加25ml预冷无菌水悬浮菌体。

4℃下2500rpm离心5min（取出鲑鱼精，DNA）7.弃上清，加1ml 100mM LiAc悬浮菌体，转移至2ml预冷离心管中8.4℃下以离心机最大转速离心15s9.吸出上清，加400ul 100mM LiAc，重新悬浮菌体C.转化10.取50ul至2ml 无菌预冷离心管中，微离15s，吸出上清11.PEG3350（50% W/V）240ul1 mol/L LiAc 36ul鲑鱼精DNA（20mg/ml） 25ul质粒DNA 0.7ug基因片段0.7~2ug12.剧烈震荡1min，完全混匀13.30℃，水浴30min14.42℃水浴培养40min（准备倒皿）15.7000rpm离心15s16.弃上清，加600ul DDW悬浮菌体17.吸200ul涂布于筛选平板，30℃培养2-4天D.所需试剂和培养基YPDYeast Extract 10gPeptone 20g + 2% DextroseAgar 20g定容至900mL，左右分开灭菌121℃灭菌20min再加入100mL经过灭菌的20% Dxtrose（10×）P.S. Dextrose、Yeast Extract、Peptone溶液混合后高温下可能发生化学反应，导致基本成分变化，故将二者分别灭菌后再混合Glucose (20%)称取20 g葡萄糖，用蒸馏水溶解定容至100 mL，过滤除菌备用。

酵母转化

（1）用于酵母转化的菌落，4℃保存，一般为新生长出来的菌落。

划YPDA 平板，28-30℃培养3-4 天。

挑取酵母直径3mm的菌落接种到5mL YPDA 液体培养基中，30℃培养8-12h。

（2）取5μL 菌液到新的50mL YPDA 培养液中，30℃，200rpm，培养16-20h。

（3）测OD 约在0.15-0.3 之间。

用80mL 无菌离心管以3000g 离心5min，弃上清，收集沉淀。

用100mL YPDA 培养液重悬菌体，30℃，200rpm，培养至OD 达到0.4-0.6，通常需要3～5h。

（4）用80mL 无菌离心管以3000g 离心5min，收集细胞。

（5）弃上清，把沉淀悬浮在30mL 无菌水中，同上，离心。

（6）重复步骤（5）一次。

（7）弃上清，把细胞悬浮在1mL 的100mmol/L 醋酸锂中，转移到一个无菌的1.5mL离心管中。

用1.5ml 1×TE/LiAc 重悬。

（8）高速离心15s，沉淀细胞，用微量移液器吸出上清。

（9）重新悬浮细胞到600μL 1×TE/LiAc 中，到此感受态细胞制备完成。

（10）将用于转化的双链载体DNA 样品煮沸5min，快速放入冰水中冷却。

（11）在1.5ml 离心管中加入2μL 10mg/ml 双链DNA，0.1μg 质粒（若共转AD 和BD质粒则总共0.1μg），混合均匀。

（12）加入100μL 上述感受态细胞轻轻混匀。

（13）向离心管中加入600μL 40% PEG/LiAc，完全混匀，30℃，30min。

每10min 混匀一次。

（14）加入70μL DMSO 至终浓度为10%，42℃，热激15min。

每5min 摇匀一次。

（15）高速离心15 秒，用微量移液器除去上清。

（16）向离心管中加入1ml YPDA 液体培养基，30℃，150rpm，90min。

（17）低速离心，用1ml 生理盐水重悬，取200μL 菌液涂对照培养基和选择平板。

几种酵母转化方法

几种酵母转化方法酵母转化原理：像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichiapastoris基因组的同源区域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子（Cregg et al., 1985; Cregg etal.,1989）.这样的整合方式显示极强的稳定性,即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件（插入）比双交换事件（置换）发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概率的多插入事件.电转化注意点：一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。

1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。

每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。

高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1mlsorbitol才可溶解为糊状。

正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。

可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。

3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。

用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。

整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。

山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。

三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。

酵母转化试剂盒使用说明书第二版

酵母转化试剂盒使用说明书（第二版）储存条件：Carrier DNA-20℃保存，其它组分可室温保存，有效期1年。

产品内容：Components SK2400-200PEG Solution50mlLiAc Solution50mlCarrier DNA2×1ml说明书1份酵母感受态细胞的制备：1.活化菌种。

-80℃保存的菌种在固体YPDA培养基（YPDA加20g Agar/L）上划线，在30℃培养2-4天。

2.挑取酵母单菌落在固体YPDA培养基上划3-5mm的短线，在30℃培养2-4天。

待酵母单菌落长至2mm长时，接种。

3.首先把酵母细胞接种到3ml液体YPDA培养基中，30℃过夜培养。

4.第二天转接到含有30ml液体YPDA培养基的三角瓶中继续培养，待OD600到0.4-0.5范围内。

收集细胞，1000g，离心5min,去上清。

5.沉淀用30-50ml的无菌的去离子水悬浮。

1000g，离心5min，去上清。

6.沉淀用合适体积的1/10浓度的LiAc悬浮（30ml的酵母菌最多用不超过1mL的1/10浓度的LiAc悬浮，通常100μl的酵母细胞用于转化一个质粒，即一个反应）。

1/10浓度的LiAc稀释方法：100μl LiAc Solution+900μl无菌水。

7.把酵母细胞的悬浮液分装到1.5ml的离心管中，每管分装100μl，用于转化一个质粒即一个反应。

1000g，离心5min，去上清。

制备好的感受态细胞备用。

酵母转化：1.配制预混液，每转化一个质粒即一个反应需要360μl的预混液。

PEG Solution240μlLiAc Solution36μlCarrier DNA10μl质粒（大约200ng/μl）5μl（根据质粒的浓度加入相应的体积）总体积360μl（不足体积用ddH2O补充）2.吸取360μl的预混液加入到感受态细胞中，用枪头反复吹吸沉淀，使离心管底的酵母细胞彻底地悬浮在含有PEG的预混液中。

酵母的转化和筛选

酵母的转化和筛选一、实验目的掌握醋酸锂/聚乙二醇法（LiAc/PEG）法转化酵母的原理；掌握酵母感受态细胞的制备过程；了解筛选标记在筛选酵母转化子中的作用方法。

二、实验原理转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA 而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。

这现象首先发现于细菌，也是细菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种，它不同于通过噬菌体感染传递遗传物质的转导以及通过细菌细胞的接触而转移DNA的细菌接合。

醋酸锂/聚乙二醇法（LiAc/PEG）法转化原理：锂离子可以中和DNA和细胞膜脂所携带的负电荷，同时黑可以在细胞膜上形成小的孔道，便于DNA 进入细胞。

PEG可以增加细胞的聚集，促进DNA分子粘附在细胞表面，增加转化效率。

三、主要实验材料、试剂和仪器实验材料：酵母AH109主要试剂：YPD培养基、YPAD(添加30 mg/L腺嘌呤半硫酸的YPD)、10X TE缓冲液、乙酸锂、50%（m/V）PEG4000、ssDNA主要仪器：摇床、水浴锅、离心机、培养箱四、实验步骤1. 在开始实验前2天，接种待转化的酵母菌株的单菌落于5 ml YPD培养基中，于30℃恒温摇床，培养过夜。

2. 转化的前一天晚上，往1 L 无菌烧瓶中加入300 ml YPAD培养基，然后接种适量的过夜培养液，再于30℃培养过夜，到细胞密度为1×10 7细胞/ml （OD 600≈0.3~0.5，依据菌株而定），为了获得2~3倍高的转化效率，用YPAD稀释培养液至细胞密度为2×10 6细胞/ml。

然后培养生长2~3代（2~4 h）。

3. 培养液在室温条件下，取1ml菌液到1.5ml无菌离心管中，4 000 g 离心5 min，弃上清。

细胞用1 ml 无菌超纯水重悬，再于室温下，5 000g 离心5 min，沉淀细胞。

4. 细胞用1.5 ml 锂盐溶液重悬，锂盐溶液按下列方法配制，现配现用。

酵母电转化——精选推荐

酵母电转化(2006)1)将划线培养的毕赤醉母GS115单菌落接种于3mLYPD培养基中，280度,250r/min 摇荡培养24-48h,2)取培养物100uL转接种于20mLYPD培养基中，28℃摇荡过夜，OD600=1. 3-1. 5，4'C 1500r/min离心5min收获细胞3)细胞依次用100mL, 50mL冰预冷水和20mL冰预冷的1moI/L山梨醇洗涤，4度,1500g离心5min,最后用0. 8mL冰预冷的lmol/L山梨醇悬浮菌体，置冰浴。

4)取Sa 1 I线性化的重组载体l0ul (l0ug)与80gL毕赤酵母感受态细胞混匀，然后转移到冰预冷的0.2 cm的电转移杯中，冰上放置5mino(2)将电转移杯放在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件:电压1500V电容25uF，电阻200，时间5ms,温度O 'c(3)电击结束，立即加入1mL冰预冷的lmol/L山梨醉，混匀，取250uL转化物涂营养缺陷型MD培养基平皿，置28'C恒温培养2-4d，能在MD培养基上生长的菌落为His，转化子。

另一种方法:①从毕赤氏酵母GS115平板上挑取一单菌落，接种于10 mL YPD培养基中，30℃，250 r/ min,振荡培养过夜;②从上述过夜培养液中吸取1 ML，接种于200 mL YPD培养基中，30℃，250 r/min, 振荡培养至OD600为1.1-1.5;③500Xg离心培养液，沉淀细胞，用去离子水和1 m的山梨糖醇各洗两次;④加入1 ML预冷的1M的山梨糖醇重悬细胞，此即为感受态细胞;⑤把感受态细胞分装，每管100 uL，-70℃保存，备用.①将冻存于一70℃的GS115感受态细胞取出，冰浴融解;②分别将四种各10 uL线性化重组表达载体加入100 uL GS115感受态细胞中，用Tip头轻轻混匀;③将混匀的感受态细胞和重组表达载体混合物加入2 mm的电击杯底部，轻轻振荡，使混合物完全沉落于电击杯底部，冰浴5m in;④将JY2000-1B基因导入仪的电压调到1500 V，电阻调到200 ，电容调到25 uF, 电击10m s;⑤将1 mL 1 M冰浴的山梨糖醇加入电击杯，混匀，各吸出200 pL，分别涂于4个YP D+Zeocin平板上;⑥将平板置于30℃培养箱，培养2d至长出菌落。

毕赤酵母转化相关整理

1.电转化相关事项①在电转完毕涂MD平板时，我是不加抗生素的，因为MD平板本身就有组氨酸营养缺陷的筛选标记，据说再加抗生素很容易压力过大，不长菌。

20度培养48-55h后，酵母长出来，挑单菌落，到YPD液体培养基（刚筛选时我一般只加0.5mg/ml的G418），菌长好后，提基因组，验证插入基因和拷贝数，拷贝数这时也可以通过添加不同浓度G418的平板来验证。

如果基因插入没问题，再培养诱导，测活。

②YPD可以直接灭菌，刚开始我葡萄糖单灭，后来发现酵母粉蛋白胨葡萄糖一起加也没问题。

③.温度方面，毕赤酵母最常用的是30度，只要不长时间超过32度就没有问题，诱导温度与表达的蛋白是否被降解有关，但通常30度。

④.生物素方面，只要用到酵母粉的培养基都可以不用。

⑤. MD是的氮源是无机氮，没有组氨酸，空的毕赤酵母不在它上面不会长，长的有99％都是重组菌⑥可以用G418 YPD平板筛选高考贝菌，一般情况下拷贝数高的表达量就高（但有些蛋白酶不一定表达量高就好），一般情况下MD平板上长出的菌可以直接用牙签挑到1.5mg/ml或2mg/ml G418的平板上，这个时候一般培养三天时间，长的大的菌落可能就没有几个了，这几个大的获得高表达的可能性是最大的。

⑦灭菌温度方面，只要有葡萄糖的都115度20分钟，没有的都可以121度20分钟。

⑧甲醇诱导方面，一天加一次终浓度1％的甲醇即可，前提条件是第一次一定要换掉培养基。

⑨蛋白降解方面，在发酵上一般通过调整pH,收获时间来解决，通过诱导温度是不理想的；从宿主上可以选用SMD1168，SMD1165,SMD1163,SMD1168用的最多，从分子上，可以突变掉目标蛋白的酶切位点。

可以通过不同的载体不同的线性化位点对已有的高表达酵母进行再转化，以获得更高表达的菌株；些方法也可以进行两种不同蛋白的共表达。

⑩电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。

酵母转化常用培养基及程序

酵母实验操作方案一．质粒酶切及线性化1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。

2）线性化质粒使用80μl酶切体系9KSF2质粒70μl内切酶（SacI，SalI，BglⅡ）2μl10 x buffer 8μl3）酶切3－16小时，一般3小时即可；二．乙醇回收酶切质粒1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA；2）－200C数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清；3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）；4）37℃烘干水分和残留乙醇；5）用20μl ddH2O重溶；6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量；三．电转化1．准备感受态细胞1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌24 hours；2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，300C ，250rpm，7～8hours，直到OD600＝1.3～1.5；3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，40C离心5 min，弃上清；4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清；5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清；6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，40C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－700C冰箱大约3周。

2．转化1)100μl GS115感受态细胞加入＋20μl 线性化质粒，用枪打匀；2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴；3) 电转化，参数设定：电压1500V 电容25μF电阻200欧姆，放电时间4～5ms4)立即加650μl 冰1M sorbitol 入转化杯，打匀；5) 迅速涂板，250μl/块MD板，共3块；6) 涂好的板放在300C培养箱中培养4～5天，至菌落直径1mm即可。

毕赤酵母电击转化注意事项

毕赤酵母电击转化注意事项一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。

1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。

每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2）OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。

高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。