饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法-编制说明

《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测 EMA-PCR法》河南省地方标准编制说明

一、编制的目的和意义

阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazaii）是一种革兰氏阴性、周生鞭毛、能运动、无芽孢的兼性厌氧细菌，属条件性致病菌。自1961年，英国首次报道2例由阪崎肠杆菌引起的脑膜炎病例以来，相继在美国、加拿大、比利时等国家报道了新生儿阪崎肠杆菌感染事件。国际食品微生物标准委员会(ICMSF)在2002年将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可能引起神经系统后遗症和死亡，在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%～80%。因此，对阪崎肠杆菌活菌建立快速、特异、灵敏的检测标准对于该菌的早期发现及传播的有效控制至关重要。

目前阪崎肠杆菌的检测方法较多，主要有传统培养方法和分子生物学方法。我国目前采用传统的细菌学方法，检测时间需要一周左右，费时费力；分子生物学方法虽然快速，灵敏，但不能区分死菌与活菌，而死菌DNA的存在容易导致假阳性问题。本研究以阪崎肠杆菌16S rDNA保守序列为靶基因设计一对特异性引物，采用EMA与PCR结合的方法进行检测，能够有效地区分阪崎肠杆菌的死菌与活菌，避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结果，

同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。本次研究结果显示，PCR检测阪崎肠杆菌的灵敏度在1.0×102cfu/mL左右，从样品处理、预增菌、PCR扩增、凝胶电泳只需要48h左右，与传统培养方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异性强，可用于检测饲料中阪崎肠杆菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。

二、任务来源及编制原则和依据

1、任务来源

根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫质监标发〔2017〕104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法》（立项编号：20171210482）的起草、制定工作。

2、编制原则

符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则，开展了本次研究工作。

3、编制依据

主要依据以下标准：GB 4789.40-2016 食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验；GB 19489 实验室生物安全通

用要求；GB 4789.28 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求。

三、编制过程

标准的编制过程分三个阶段进行：

第一阶段：阪崎肠杆菌活菌EMA-PCR检测方法的建立

1.引物设计

根据阪崎肠杆菌16S rDNA设计一对特异性引物。根据该基因中的保守且特异性序列，设计扩增932 bp大小的特异性引物对。

表1 引物序列

2. EMA-PCR方法参数的优化

首先是探索阪崎肠杆菌培养物的最佳致死方法和EMA最佳终浓度，分别采用煮沸裂解、紫外照射及化学方法对培养物进行处理，再分别加入EMA，制备成EMA终浓度成梯度变化的菌悬液，采用卤素灯进行光照交联。然后通过离心收集上清液，进行PCR 扩增，观察凝胶电泳结果，选出最优的致死方法和最佳EMA添加终浓度。

其次是最佳曝光时间的确定，在上述试验的结果上，选出最

优组合，采用卤素灯下分别照射0、1、2、4、6、8、10min，离

心收集上清液，进行PCR扩增。

3.确定方法的灵敏度和特异性。

4. 用建立的阪崎肠杆菌EMA-PCR方法检测饲料及饲料原料

样品，并与GB 4789.40克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验比对，以验证该方法的实用性和准确性。

第二阶段：阪崎肠杆菌EMA-PCR检测方法应用实验

本阶段主要进行阪崎肠杆菌EMA-PCR检测方法在河南省范围

内的应用实验。为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏

感性和实用性，由河南省兽药饲料监察所进行饲料样品检测应用

试验。共对来自全国4个省（大部分样品来自河南省）共计216批

饲料及饲料原料样品进行了应用检测；共检测出1批阪崎肠杆菌

阳性样品，并对阪崎肠杆菌进行了分离鉴定。同时与GB 4789.40 《克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》进行了对比，检测结果显示，EMA-PCR方法检测结果与传统培养法GB 4789.40检测结果完

全一致，但检测时间比传统培养法缩短了2-3天的时间。

通过对比发现，EMA-PCR方法具有准确、快速的特点，在应

用推广方面具有一定的优势。

第三阶段：标准的起草、修改与制定

根据以上实验资料及所有参与实验人员意见，在系统统计、

科学分析的基础上，组织有关专家起草了《饲料中阪崎肠杆菌活

菌的检测 EMA-PCR法》河南省地方标准草案，规定了适用范围、样品处理方法、实验操作方法、结果判定等，并将标准草案送微生物有关方面专家征求意见，按照专家意见对标准草案进行多次修改完善，制定了当前的《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法（草案）》。

项目主持人：吴志明，河南省兽药饲料监察所，主持本项地方标准的制定与编写。

主要起草人：

高延玲：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和技术推广。

方忠意：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和检测方法的优化。

董鹏：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和检测方法的建立。

李金磊：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和检测方法的建立。

狄元冉：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和优化。

四、主要内容的确定

1. 检测方法基本原理

EMA能够穿过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其基因组