饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法-编制说明
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验
附件食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。
2 檢驗方法〆2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。
每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。
2.2 器具及材料〆2.2.1 乾熱滅菌器。
2.2.2 高壓滅菌釜。
2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。
2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。
2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL之刻度。
2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。
2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其他缺點。
2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。
2.2.11 pH測定儀。
2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。
2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
2.2.15 接種針及接種環（直徑約3 mm）〆鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。
2.2.16 曲玻棒〆可滅菌者，直徑3～4 mm，塗抹區域45～55 mm。
2.2.17 試管〆10 ×100 mm，13 ×100 mm，13 ×120 mm，15 ×150 mm，16 ×150 mm試管，或其他適用者。
食源性阪崎肠杆菌检测方法研究进展
食源性阪崎肠杆菌检测方法研究进展邓丽萍1,2,3，邓访萍4，张 琴1,2,3（1.广东省食品质量监督检验站，广东广州 511442；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东广州 511442；3.广东省食品工业公共实验室，广东广州 511442；4.广东药科大学附属第一医院，广东广州 510080）摘 要：阪崎肠杆菌可感染婴幼儿，引发脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。
因此，探究出快速、灵敏、高效的阪崎肠杆菌检测方法对于保障食品质量安全至关重要。
目前，阪崎肠杆菌的检测方法中比较常见的是分离鉴定法、分子生物学检测技术和免疫学检测法。
分离鉴定法易于操作、成本低，但检测周期长，无法满足对目标食品快速检测的需求；分子生物学检测技术是一种高灵敏度和特异性的检测手段，但是由于其对检测人员要求高，所需设备和试剂价格昂贵，目前多在实验室进行，不适用于现场检测；免疫学检测方法简单快捷，适用于现场快速检验，但容易受到其他杂菌的影响，敏感性较低。
本文综述了分离鉴定法、分子生物学检测技术、免疫学检测技术等多种阪崎肠杆菌的检测方法，结合参考文献就检测研究进展予以分析，以期为食品中阪崎肠杆菌的快速检测方法研究提供参考。
关键词：阪崎肠杆菌；检测方法；研究进展Research Progress in Detection Methods for FoodborneEnterobacter sakazakiiDENG Liping1,2,3, DENG Fangping4, ZHANG Qin1,2,3(1.Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station, Guangzhou 511442, China;2.Guangdong Food Industry Institute Limited Company, Guangzhou 511442, China;3.Guangdong Provincial Food Industry Public Laboratory, Guangzhou 511442, China;4.The First Hospital of Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510080, China)Abstract: Trace amounts of E. sakazakii can infect newborns and young children, causing meningitis, septicaemia and necrotising small bowel colitis, among others. Therefore, exploring a rapid, sensitive and efficient detection method for E. sakazakii is essential for ensuring food quality and safety. At present, conventional isolation and identification, molecular biology and immunological detection methods for E. sakazakii are more common. The separation and identification method is easy to operate and low cost, but the detection cycle is long, which can not meet the demand for rapid detection of target food. Molecular biotechnology is a highly sensitive and specific means of detection, but due to its high demand for test technicians, the required equipment and reagents are expensive, and is currently mostly carried out in the laboratory, is not suitable for on-site testing. The method of immunological determination is simple and fast, which is suitable for field rapid detection, but it is easy to be interfered with other miscellaneous bacteria and its sensitivity is not high enough. In this paper, separation and identification method, molecular biological detection techniques, immunological detection techniques and other detection methods of E. sakazakii were reviewed, and the research progress of detection was analyzed in combination with references, in order to provide reference for the rapid detection of E. sakazakii in food.Keywords:Enterobacter sakazakii; detection method; research progress阪崎肠杆菌（又称阪崎氏肠杆菌）是一种寄生于人和动物肠道内的条件致病菌，在自然界中分布广泛，具有一定的耐热性、耐干燥性、耐高渗环境性，可抵抗超高温瞬时灭菌。
食源性致病微生物阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒的研究
正值炎炎夏季，湿热的空气为细菌、真菌等微生物的生长繁殖提供了必备的温度和湿度，因此更容易引起食物中毒等食源性疾病的发生。
由于传统的食源性微生物检测技术繁琐耗时，故致病微生物的创新检测技术引起了越来越多科研人员的关注。
只有深入分析食源性微生物检测技术，才能帮助相关人员更好地掌握有关的知识和应用要点，从而更有效地发挥关键技术的作用，进一步保证食品的质量与安全。
为此，本刊特设“食源性微生物及其检测技术”专题，对常见的食源性致病菌进行了详细解读，并深入探讨了食源性微生物检测方法的应用与发展，以期为食品安全提供有力保障，促进我国食品工业的健康发展。
需要警惕的“头号敌人”——食源性微生物食源性微生物及其检测技术Aug 2019 CHINA FOOD SAFETY21食品安全问题一直是社会各界关注的重点。
世界卫生组织曾报道称，食源性疾病是受全球关注的卫生问题，更是影响人类健康的重要因素，而病原微生物感染则是导致食源性疾病发生的主要因素。
阪崎肠杆菌在2002年被国际食品微生物标准化委员会（ICMSF）确定为食源性致病菌，如被阪崎肠杆菌感染可能会引起婴幼儿尤其是新生儿患病，如脑膜炎、菌血症及坏死性小肠结肠炎等，更有甚者会引起严重的后遗症或死亡。
有数据显示，目前只有婴幼儿奶粉与这一疾病的爆发相关。
传统的致病微生物检测方法有国标法和纸片法，但因操作复杂且测试周期过长，其已经无法跟上经济发展的步伐，不能满足我国快速发展的食品行业对食品检测工作的需求。
因此，建立一种在婴幼儿奶粉中快速、高效、灵敏的检测阪崎肠杆菌的方法至关重要。
本研究是一种基于环介导等温扩增技术而开发的快速检测食品中阪崎肠杆菌的方法。
环介导等温基因扩增技术（Loop Mediated Isothermal Amplification，以下简称“LAMP 法”）是日本荣研株式会社研究发明的核酸等温扩增方法，其利用4个特殊的引物特异识别靶基因的6个特定区域，采用具有强链置换活性的BstDNA 聚合酶，实现在恒温条件下的体外扩增。
婴幼儿健康的“敌人”食品中阪崎肠杆菌的检测方法
婴幼儿健康的“敌人”-食品中阪崎肠杆菌的检测方法阪崎肠杆菌阪崎肠杆菌是广泛存在于环境中的一种微生物，可以感染婴幼儿并对他们的健康造成严重威胁，阪崎肠杆菌耐热、耐干燥、对渗透压有较强的忍耐力，可长时间生存在干燥的环境中。
阪崎肠杆菌最喜欢袭击1岁以下的婴儿，如果你在冲调、存放奶粉时操作不当，它就可以趁虚而入，婴儿的胃酸PH值比成人高，可以存活在他们的肠道中，并且婴儿血脑屏障未发育完全，阪崎肠杆菌可以轻易进入他们的脑部引发脑膜炎，由阪崎肠杆菌引起的新生儿脑膜炎、菌血症等严重疾病，死亡率高达20-50％。
世界卫生组织建议，您应当使用不低于70℃的热水冲调婴儿配方奶粉，并在2小时内尽快喂哺，如果需要预先冲调，冲调后应快速冷却并且存放在不超过5℃的冰箱内，还要在冲调后24小时内饮用，喂哺前必须重新加热，那些早产、体重低或免疫力低的高风险婴儿，可以使用商业无菌的液态婴儿配方奶，你记住了吗？食品中阪崎肠杆菌的检测方法1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：1.1 恒温培养箱：25℃±1℃，36℃±1℃，44℃±0.5℃1.2 冰箱：2℃-5℃1.3恒温水浴箱：44℃±0.5℃1.4天平：感量0.1g1.5 均质器1.6 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）1.7 无菌锥形瓶：容量100mL、250mL、2 000mL1.8 无菌培养皿：直径90mm1.9 pH计或精密pH试纸2 培养基和试剂2.1 缓冲蛋白胨水2.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素2.3 阪崎肠杆菌显色培养基2.4 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）2.5 API 20E生化鉴定试剂盒2.6 氧化酶试剂3 操作步骤3.1 前增菌和增菌取样前，应消毒检样包装的开启处。
以无菌操作，称取检样100g（mL）加至预热到44℃装有900mL灭菌缓冲蛋白胨水的2 000mL锥形瓶中，缓缓振摇使样品充分溶解，36℃±1℃培养18h±2h。
阪崎肠杆菌实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立
２ １， ２ （ ０） ０１ ７ １
Ｃｈｉ ｓ ｏｕ ｎ ｌ ｏ ｏｎ ｅ ｎｅ ｅ Ｊ ｒ ａ ｆ Ｚｏ ｏｓ ｓ ８ ７ ５
文 章 编 号 ：０ ２ ６ ４ ２ １ ）０ ８ ７ ４ １ ０ —２ ９ （ ０ １ １ —０ ５ —０
阪崎肠杆 菌实时荧 光双重 Ｔ ｑ ｎＰ Ｒ ａ Ｍａ Ｃ 快速检测体 系的建立 ＊
ｓ ｅ ｉ ｃ ａ ｌ ｉａ ｉ ｎ ｒ ｒ ｓ ｎ ｅ ｅ ｈ ０ ｏ ｈ ｒｃ ｍｍｏ ｎ ｅ ａ ｈ ｇ ｎ ｃ ｂ ｃ ｅ ｉ ａ ｄ ｓ ｍｅ ｉｏ ａ ｅ ａ ｓｎ ｏ ｏ ｏ ａ ｐ ｃｆ ｍｐ ｉ ｃ ｔ ｓ ｗｅ ｅｐ ｅ ｅ ｔ ｄ ｗｈ ｎ ｔ ｅ ５ ｔ ｅ ｏ ｉ ｆ ｏ ｎ ｅ ｔ ｒｐ ｔ ｏ ｅ ｉ ａ ｔ ｒａ ｎ ｏ ｌ ｔ ｓｃ ｕ ｉｇ ｎ ｓ ｃ ｍｉｌ ｓ
中 图分 类 号 ： ３ ８ ２ 文 献 标 识 码 ： Ｒ ７ ． Ａ
Ｎｏ ｅ ｕ ｌ ｘ ｒ ａ － ｉ ｅ Ｔａ Ｍ ａ ｖ ｌｄ ｐ ｅ ｅ ｌｔｍ ｑ ｎ ＰＣＲ ｓ ａ ｏ ｈｅ ｄ ｔ ｃ ｉ ｎ ａ ｓ ｙ ｆ ｒ ｔ ｅ ｅ ｔｏ
ｏ ｆＥ ｒ 易 ｃ ｒ ｓ ａ ａ ｉ Ｄ ｎ ａｋ ｚ ｋ ｉ
阪崎 肠杆 菌是 一种 革 兰 阴性 、 周生 鞭 毛 、 运 有 能 动 、 性厌 氧 的无芽 孢杆 菌 ， 兼 起初 被认 为是 阴 沟肠杆 菌 的生物 变 型菌 。后来 Ｆ ｒ ｒ 通 过 ＤＮＡ 杂交 实 ａｍｅ
作 为一 种重 要 的条 件 致 病 菌 ， 崎肠 杆 菌感 染 阪
的大多 数病 例都 是 婴儿 ， 特别 是早 产儿 、 出生 体 重偏 低 等身 体 状 况 较 差 的 新 生 儿 。感 染 主要 引 起 脑 膜 炎 、 血症 和坏 死 性 小 肠 结 肠 炎ｐ 在 阪崎 肠杆 菌 的致 病 过程 中发 挥 ｏ Ａ）
LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的对比探究
LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的对比探究作者：颜学伟来源：《中外医学研究》2013年第05期【摘要】目的：研究LAMP法和PCR法在阪崎肠杆菌快速检测中的差异，指导临床在阪崎肠杆菌快速检测中方法的选择。
方法：针对阪崎肠杆菌的OmpA基因，设计相关特异性引物，分别建立LAMP法和PCR法两种检测方法体系对其进行检测，并对两种检测方法的灵敏度进行记录比较；分别采用两种方法对45株阪崎肠杆菌近源菌进行检测，分析比较两种方法的特异性；最后采用两种方法对60份商场奶粉样品进行检测，将检测结果与FDA检测结果进行比较分析。
结果：两种检测方法的灵敏度检测结果显示：LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测的敏感度（101 cfu/ml）明显高于PCR法（102 cfu/ml），两者比较差异有统计学意义（P【关键词】 LAMP； PCR；阪崎肠杆菌中图分类号 R33 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2013）5-0001-02阪崎肠杆菌是肠杆菌科的一种，是奶粉（乳）制品中新发现的一种致病菌。
由其可引发婴儿各种疾病，致病机制可能与其侵入、诱导凋亡及肠毒素作用有关[1]。
对于阪崎肠杆菌的检测，最新研究发现LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测，灵敏度高、特异性强[2]。
笔者所在医院应用LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的进行对比探究，现报道如下。
1 资料与方法1.1 菌株标本所研究的菌株共60株，其中2株阪崎肠杆菌标准菌株是由广东省微生物研究所提供的ATCC51329和ATCC29544，8株阪崎肠杆菌野生菌株是采用FDA传统手段从商场奶粉或果汁中提取出来的；其余在试验中用到的菌株均为本实验室自己保存。
1.2 仪器细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），Bst DNA Polymerase（美国NEB公司），betaine（美国Sigma公司），agarose（Promega），DK28D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司），PCR仪：PTC-200型；美国Bio-rad公司，EPS301电泳仪（瑞典Amersham公司）。
阪崎肠杆菌检测标准
阪崎肠杆菌检测标准1. 引言阪崎肠杆菌（Hafnia alvei）是一种革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科。
它在自然环境中广泛存在，也可以在人和动物的消化道内找到。
阪崎肠杆菌可以对人类和动物造成感染，引起各种疾病，如泌尿系统感染、呼吸道感染和胃肠道感染等。
为确保食品和饮用水的安全，阪崎肠杆菌的检测标准十分重要。
2. 检测方法2.1 阪崎肠杆菌的培养方法阪崎肠杆菌可以在一般细菌培养基上生长，常用的培养基包括MacConkey琼脂培养基和Eosin Methylene Blue（EMB）琼脂培养基。
培养时一般在37°C下孵育24-48小时。
2.2 阪崎肠杆菌的生化检测阪崎肠杆菌可以通过一系列的生化反应进行检测和鉴定。
常用的生化试验包括氧化/发酵葡萄糖试验（O/F试验）和酮糖酸盐（Voges-Proskauer）试验等。
2.3 阪崎肠杆菌的PCR检测PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学方法，可以快速、准确地检测阪崎肠杆菌。
通过特定的引物在PCR反应中扩增阪崎肠杆菌的DNA片段，然后通过凝胶电泳进行检测和鉴定。
3. 检测标准3.1 食品中阪崎肠杆菌的检测标准根据国家食品安全标准，食品中阪崎肠杆菌的检测标准如下： - 生肉制品：阪崎肠杆菌在每克样品中不得超过10 CFU； - 加工食品：阪崎肠杆菌在每克样品中不得超过100 CFU； - 饮用水：阪崎肠杆菌在每100毫升样品中不得检出。
3.2 环境中阪崎肠杆菌的检测标准根据环境保护标准，阪崎肠杆菌的检测标准如下： - 水质：阪崎肠杆菌在每升水样中不得超过100 CFU； - 空气：阪崎肠杆菌在每立方米空气中不得超过100 CFU； - 土壤：阪崎肠杆菌在每克土壤样品中不得超过1000 CFU。
4. 检测流程4.1 样品采集从食品、饮用水或环境样品中采集足够数量的样品。
使用无菌容器收集，并确保样品处于最佳的保存条件。
4.2 样品处理将采集的样品经过适当的处理，在无菌条件下进行前处理，如制备悬浮液或稀释样品。
食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌 ppt课件
阪崎肠杆菌介绍
易感人群:
免疫力低下者和婴幼儿、新生儿， 尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感 染来源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉， 人与人之间无传染性。
阪崎肠杆菌介绍
1、阪崎肠杆菌在自然界分布广泛，在水、土壤、食 物、排泄物等中都能够检出。细菌不耐热，加热到 72℃持续15秒就可以杀灭。细菌不在人与人之间传播。 2、阪崎肠杆菌在一般情况下不对人体健康产生危害， 但对于新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可以致病。 3、绝大多数患者为轻症病例，表现为轻微的消化道 症状，恢复良好；重症病例罕见但病死率高。对于发 现的病例应及时报告。
阪崎肠杆菌介绍
阪崎肠杆菌（Enterobater sakazakii）属肠杆菌科肠杆 菌属，革兰染色阴性杆菌。阪崎肠杆菌在自然界分布 广泛，繁殖迅速，但不耐热，可通过巴斯德消毒法杀 灭。阪崎肠杆菌属条件致病菌，在一般情况下，不对 人体健康产生危害，但对于免疫力低下者和婴幼儿、 新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感染来 源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉，人与人之间无传
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阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
一、采标情况
二、适用范围 三、操作过程 1 第一法 阪崎肠杆菌的检验 2 第二法 阪崎肠杆菌的计数
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
二、适用范围
适用于婴幼儿配方奶粉、乳和乳制品及 其原料中阪崎肠杆菌的检验
挑取绿色菌落
接种TSA平板
25℃±1 ℃ 48 h ± 4 h 挑取黄色菌落
生化鉴定
PCR法检测阪崎肠杆菌的研究
PCR法检测阪崎肠杆菌的研究
周吉海;侯殿东;胡英;张志瑜;米超;文涛
【期刊名称】《中国热带医学》
【年(卷),期】2008(8)2
【摘要】目的建立阪崎肠杆菌的PCR检测方法。
方法用热裂解法和酚-氯仿法提取DNA。
针对阪崎肠杆菌的ompA基因设计引物,优化PCR条件,验证其特异性和敏感性。
结果优化后的条件选择为:Mg2+浓度2.0mmol/l,退火温度60℃;PCR扩增后,出现469bp的产物,具有良好特异性;采用酚-氯仿法时,其最小检出量
103CFU/ml菌液,热裂解法,为105CFU/ml菌液。
结论优化的PCR检测阪崎肠杆菌条件,显示方法灵敏、特异快捷,可作为阪崎肠杆菌检测的新手段。
【总页数】2页(P186-187)
【关键词】阪崎肠杆菌;快速检测;PCR
【作者】周吉海;侯殿东;胡英;张志瑜;米超;文涛
【作者单位】中国医科大学公共卫生学院;辽宁中医药大学基础医学院;辽宁省疾病预防控制中心
【正文语种】中文
【中图分类】R378.2
【相关文献】
1.奶粉中阪崎肠杆菌PCR和荧光PCR 检测方法的研究 [J], 高虹;张霞;高旗利
2.实时荧光定量PCR法检测阪崎肠杆菌和肠杆菌科 [J], 崔溢;张贵海
MP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的对比探究 [J], 颜学伟
4.生乳阪崎肠杆菌、大肠杆菌和细菌总数的实时定量PCR检测 [J], 李祖明;王磊;吴聪明;许文涛;田文莹;江海洋
5.食品中克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)双重PCR检测方法研究 [J], 王翔;徐幸莲;祝长青;周光宏
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食品克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验原始记录
食品克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验原始记录样品编号：检验开始时间：年月日样品名称：检验完成时间：年月日检测项目：克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检测依据：GB 4789.40-2016 第一法 第二法一、克罗诺杆菌属定性检验无菌操作称（量）取样品100g或ml置于灭菌锥形中，加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，摇动充分溶解，36±1℃培养18±2h，移取1mL转种于10mLST-Vm肉汤，44±0.5℃培养24±2h。
轻轻混匀培养物，各取1环，分别划线于两个阪崎杆菌显色培养基平板，36±1℃培养24±2h。
挑取可疑菌落，划线于TSA平板，25±1℃培养48±4h。
观察，挑取可疑菌落进行生化鉴定。
二、克罗诺杆菌属平板计数法无菌操作称（量）取样品100g（ml）、10g（ml）、1g（ml）置于灭菌锥形中，加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，摇动充分溶解，36±1℃培养18±2h，移取1mL转种于10mLST-Vm肉汤，44±0.5℃培养24±2h。
轻轻混匀培养物，各取1环，分别划线于两个阪崎杆菌显色培养基平板，36±1℃培养24±2h。
挑取可疑菌落，划线于TSA平板，25±1℃培养48±4h。
挑取可疑菌落进行生化鉴定。
注：+生长或有可疑菌落；-未生长或无可疑菌落。
计算及结果：定性检验：得100g(mL) 计数法，查MPN检索表，得MPN/g,mL电子天平编号：使用状况试验前：试验后：培养箱编号：使用状况试验前：试验后：检测人：校核人：审核人：。
阪崎肠杆菌
阪崎肠杆菌检验 GB 4789.40—2010
Donna吴
阪崎肠杆菌 样品介绍 操作流程第一法
操作流程第二法
阪 崎 肠 杆 菌
阪崎肠杆菌
阪崎肠杆 菌能引起 （又称阪崎 严重的新 氏肠杆菌） 生儿脑膜 是肠杆菌科 炎、小肠 的一种， 结肠炎和 1980年由黄 茵血症， 色阴沟肠杆 死亡率高 菌更名为阪 达50% 崎肠杆菌。 以上。
②分离
各取增菌培养物1 环，分 别划线接种于两个阪崎肠 杆菌显色培养基平板
挑取1 个～5 个可疑菌落，划 线接种于TSA 平板。 25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。
③鉴定
自TSA 平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。阪崎肠杆菌的主 要生化特征见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。
刚分离的阪崎肠杆菌在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂上生长 形成两种不同的菌落：一种菌落呈干燥或粘液状，边缘不规 则，用接种环挑动，菌落具有明显的附着感并且有弹性；另 一种菌落则很光滑，很容易用接种环挑取，并发现该菌在肉 汤培养基中生长呈现团块或沉淀状，但目前还不清楚菌落特 征差别是否与毒性有关。
阪崎肠杆菌的生理生化特征
• ④结果与报告
• 综合菌落形态和生化特征，报告每100 g（mL）样品中检出 或未检出阪崎肠杆菌。
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2010
①样品的稀释
样品各三份
第二法 阪崎肠杆菌的计 数 ②分离 （同第一法） ③鉴定
100g
10g
1g
已预热到 44℃的蛋 白胨稀释 900ml 90ml 9ml 剂 置36 ℃±1 ℃培养18 h±2 h。
培养基和试剂
培养基和试剂
3、阪崎肠杆菌显色培养基DFI
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《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测 EMA-PCR法》河南省地方标准编制说明一、编制的目的和意义阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazaii）是一种革兰氏阴性、周生鞭毛、能运动、无芽孢的兼性厌氧细菌，属条件性致病菌。
自1961年，英国首次报道2例由阪崎肠杆菌引起的脑膜炎病例以来，相继在美国、加拿大、比利时等国家报道了新生儿阪崎肠杆菌感染事件。
国际食品微生物标准委员会(ICMSF)在2002年将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”。
阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可能引起神经系统后遗症和死亡，在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%～80%。
因此，对阪崎肠杆菌活菌建立快速、特异、灵敏的检测标准对于该菌的早期发现及传播的有效控制至关重要。
目前阪崎肠杆菌的检测方法较多，主要有传统培养方法和分子生物学方法。
我国目前采用传统的细菌学方法，检测时间需要一周左右，费时费力；分子生物学方法虽然快速，灵敏，但不能区分死菌与活菌，而死菌DNA的存在容易导致假阳性问题。
本研究以阪崎肠杆菌16S rDNA保守序列为靶基因设计一对特异性引物，采用EMA与PCR结合的方法进行检测，能够有效地区分阪崎肠杆菌的死菌与活菌，避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结果，同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。
本次研究结果显示，PCR检测阪崎肠杆菌的灵敏度在1.0×102cfu/mL左右，从样品处理、预增菌、PCR扩增、凝胶电泳只需要48h左右，与传统培养方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异性强，可用于检测饲料中阪崎肠杆菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。
二、任务来源及编制原则和依据1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫质监标发〔2017〕104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法》（立项编号：20171210482）的起草、制定工作。
2、编制原则符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则，开展了本次研究工作。
3、编制依据主要依据以下标准：GB 4789.40-2016 食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验；GB 19489 实验室生物安全通用要求；GB 4789.28 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求。
三、编制过程标准的编制过程分三个阶段进行：第一阶段：阪崎肠杆菌活菌EMA-PCR检测方法的建立1.引物设计根据阪崎肠杆菌16S rDNA设计一对特异性引物。
根据该基因中的保守且特异性序列，设计扩增932 bp大小的特异性引物对。
表1 引物序列2. EMA-PCR方法参数的优化首先是探索阪崎肠杆菌培养物的最佳致死方法和EMA最佳终浓度，分别采用煮沸裂解、紫外照射及化学方法对培养物进行处理，再分别加入EMA，制备成EMA终浓度成梯度变化的菌悬液，采用卤素灯进行光照交联。
然后通过离心收集上清液，进行PCR 扩增，观察凝胶电泳结果，选出最优的致死方法和最佳EMA添加终浓度。
其次是最佳曝光时间的确定，在上述试验的结果上，选出最优组合，采用卤素灯下分别照射0、1、2、4、6、8、10min，离心收集上清液，进行PCR扩增。
3.确定方法的灵敏度和特异性。
4. 用建立的阪崎肠杆菌EMA-PCR方法检测饲料及饲料原料样品，并与GB 4789.40克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验比对，以验证该方法的实用性和准确性。
第二阶段：阪崎肠杆菌EMA-PCR检测方法应用实验本阶段主要进行阪崎肠杆菌EMA-PCR检测方法在河南省范围内的应用实验。
为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性，由河南省兽药饲料监察所进行饲料样品检测应用试验。
共对来自全国4个省（大部分样品来自河南省）共计216批饲料及饲料原料样品进行了应用检测；共检测出1批阪崎肠杆菌阳性样品，并对阪崎肠杆菌进行了分离鉴定。
同时与GB 4789.40 《克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》进行了对比，检测结果显示，EMA-PCR方法检测结果与传统培养法GB 4789.40检测结果完全一致，但检测时间比传统培养法缩短了2-3天的时间。
通过对比发现，EMA-PCR方法具有准确、快速的特点，在应用推广方面具有一定的优势。
第三阶段：标准的起草、修改与制定根据以上实验资料及所有参与实验人员意见，在系统统计、科学分析的基础上，组织有关专家起草了《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测 EMA-PCR法》河南省地方标准草案，规定了适用范围、样品处理方法、实验操作方法、结果判定等，并将标准草案送微生物有关方面专家征求意见，按照专家意见对标准草案进行多次修改完善，制定了当前的《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法（草案）》。
项目主持人：吴志明，河南省兽药饲料监察所，主持本项地方标准的制定与编写。
主要起草人：高延玲：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和技术推广。
方忠意：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和检测方法的优化。
董鹏：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和检测方法的建立。
李金磊：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和检测方法的建立。
狄元冉：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和优化。
四、主要内容的确定1. 检测方法基本原理EMA能够穿过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其基因组DNA发生不可逆转的结合，使死细菌和游离状态的DNA不能作为模板进行PCR扩增。
根据阪崎肠杆菌的16S rDNA基因设计一对特异性引物，通过对样品进行EMA处理然后进行PCR扩增及凝胶电泳分析，含阪崎肠杆菌活菌的样品会在932 bp处出现一条目的条带，而含有阪崎肠杆菌死菌及非阪崎肠杆菌的样品不会出现该条带。
2. 最佳致死方法、EMA浓度及曝光时间向煮沸致死、紫外处理和异丙醇处理后的0.5麦氏单位（MCF）阪崎肠杆菌菌悬液中分别加入EMA，使其终浓度分别为0、0.5、1、2、4、 8 μg/mL，PCR结果电泳图分别为图1，图2，图3。
由图可以看出煮沸法致死效果最理想，加入EMA终浓度为0.5 μg/mL既能完全抑制0.5 MCF阪崎肠杆菌死菌的扩增。
另向0.5 MCF活菌菌悬液加入EMA，使其终浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 μg/mL，PCR电泳结果如图4。
由图可以看出加入终浓度为8 μg/mL的EMA样品PCR电泳条仍无明显减弱，表明终浓度≤8 μg/mL的EMA添加量不会抑制阪崎肠杆菌活菌的扩增。
图1 煮沸处理注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 μg/mL EMA；3：0.5 μg/mL EMA；4：1 μg/mL EMA； 5：2 μg/mL EMA；6：4 μg/mL EMA； 7：8 μg/mL EMA图2 紫外照射处理注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 μg/mL EMA；3：0.5 μg/mL EMA；4：1 μg/mL EMA； 5：2 μg/mL EMA；6：4 μg/mL EMA； 7：8 μg/mL EMA图3 异丙醇处理注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 μg/mL EMA;3：0.5 μg/mL EMA；4：1 μg/mL EMA； 5：2 μg/mL EMA；6：4 μg/mL EMA； 7：8 μg/mL EMA图4 EMA抑制阪崎肠杆菌活菌浓度注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 μg/mL EMA；3：2 μg/mL EMA；4：4 μg/mL EMA；5：6 μg/mL EMA；6：8 μg/mL EMA；7：10 μg/mL EMA；8：12 μg/mL EMA；9：14 μg/mL EMA；10：16 μg/mL EMA； 11：18 μg/mL EMA 向煮沸致死0.5 MCF的阪崎肠杆菌菌悬液中加入EMA，使其终浓度为0.5 μg/mL，黑暗环境下孵育5 min后，分别曝光0、1、2、4、 6、8、10 min，处理后PCR产物电泳结果如图5所示。
由图5可以看出只有不曝光的有条带，其他均无条带，说明EMA 处理后，曝光1 min，即可使EMA与死菌充分交联。
图5曝光时间注：M：Marker；1：0 min； 2：1 min； 3：2 min；4：4 min； 5：6 min； 6：8 min；7：10 min； 8：阴性对照3. PCR方法的敏感性用灭菌棉签蘸取新鲜培养的营养琼脂固体平板上的阪崎肠杆菌菌落转接于5 mL灭菌去离子水中，用比浊仪调至0.5 MCF，系列稀释至10-1-10-8，以此为模板，按上述方法进行EMA-PCR试验，同时对检出的最低稀释度进行涂板计数，每个稀释度做3个重复，37 ℃培养24 h，检测PCR反应灵敏度。
结果表明，建立的PCR方法检测限是1.0×102 cfu/mL（图6）。
图6 PCR敏感性检测注：M：Marker；1：阴性对照； 2：108 CFU； 3：107 CFU；4：106 CFU； 5：105 CFU；6：104 CFU； 7：103 CFU；8：102 CFU；9：10 CFU；10：1 CFU4.PCR方法的特异性将阪崎肠杆菌标准菌株及其余待测菌株单菌落分别接种于LB肉汤中过夜培养，取菌液作为PCR反应模板，按上述方法进行试验。
结果如图7，由图可以看出以阪崎肠杆菌标准菌株为模板PCR产物出现有1条特异性的932 bp 条带，与预测序列片段大小相符；阴性对照、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌等12株非阪崎肠杆菌菌株未出现任何扩增条带；同时也未发现有其他非特异性扩增条带，表明建立的PCR方法具有很高的特异性。
图7 PCR特异性注：M：Marker； 1：阪崎肠杆菌 ATCC 29544 2：阴性对照；3：甲型副伤寒沙门氏菌；4：鼠伤寒沙门氏菌； 5：猪霍沙门氏菌； 6：肠炎沙门氏菌；7：志贺氏菌；8：福氏志贺氏菌；9：宋内氏志贺氏菌；10：鲍氏志贺氏菌；11：金黄色葡萄球菌；12：大肠杆菌；13：单增李斯特氏菌；14：肠致病性大肠杆菌5．结果报告凡被检样品的PCR扩增产物电泳结果在932 bp处出现一条目的条带（见图8），即可报告该样品中检出阪崎肠杆菌。
图8 阪崎肠杆菌活菌的EMA-PCR检测注：M：Marker；1：阴性对照； 2：阪崎肠杆菌五、与国家法律法规和强制性标准的关系在标准的制订过程中严格贯彻国家有关方针政策、法律法规，严格执行强制性国家标准和行业标准。