转基因菊花遗传分析和杂交育种的研究

采种花
平均每花
代
杂交花序
产籽总数
杂交（或自交）组合
序数
号
数（朵）
（粒）
序产籽数 千粒重（g）
（朵）
（粒）
A
05株系ב晚粉’
14
14
910
65.00
0.398
a
‘美矮黄’ב晚粉’
12
12
800
66.67
0.359
05套袋不授粉
10
10
1
0.10
B
08ב玫瑰红’
13
13
970
74.62
0.431
b ‘美矮黄’ב玫瑰红’
菊花 (Dendranthema ×grandiflorum)是我国一大传统名花之一，具有悠久的栽培历史， 其中的地被菊在园林绿化中发挥重要的作用，本课题组已将与花色代谢有关的查尔酮合成酶 基因(chalcone synthase, CHS)转入优良的地被菊品种‘美矮黄’中[2]。在国内外，应用转基因技 术进行育种研究己有报道，但利用转基因植株进行杂交育种和对后代进行遗传分析的研究较 为少见。在此背景下，本实验将高亦珂(2000)转化成功的转基因地被菊作为一种新的种质资 源[3]，利用其中4个不同的转基因株系和对照未转基因植株分别与红、粉、黄、紫等颜色的 地被菊优良品种杂交，对地被菊若干性状的遗传分析，找出一些菊花性状的遗传规律，为菊 花杂交育种提供依据；在检测外源基因遗传的同时，分析菊花外源基因的遗传稳定性；最后 从杂交的Fl代中选出优良的单株，为进一步的育种作准备。
10.28
黄
5.45
36.8
5-6
10.10
10.28
黄
5.38
39.4
5-6
10.06
10.25
黄
5.40
38.8
5-6
10.08
10.26
末花期
12.06
12.05 12.08 12.08 12.06
根据菊花开放特点，人工授粉时于母本花瓣开展有5-6层，心花的第一、二圈雄蕊放粉 时开始。每隔一天一次，共进行5-6次。采用脱脂棉授粉法，比毛笔法更简便高效。为了使 花头多结种，花头进入成熟期后，将余下的花瓣齐根剪去，其优点是：①使花头充分接受阳 光；②防止花梗负担过重；③减少养料消耗。
表4 温室中栽培的转基因菊花在开花时的表现
Table4 Characteristcs of transgenic chrysanthemum during flowering
花色
花径 开花数 花瓣层数 初花期 盛花期
黄
5-6层或
5.46
34.5
7-8层
10.08
10.28
黄
5.42
38.2
5-6
10.07
1. 引言
转基因植株是一种全新的种质资源，利用其作为育种的原始材料与其他品种杂交，以便 育出新品种，在国际上其他花卉的育种中己有过报道，如世界上第一例改变花色的分子育种 是在矮牵牛上取得成功的，将玉米DFR基因导入矮牵牛后，产生了淡砖红色花朵的变异， Oud(1995)以转基因植株相互杂交，最后育出了橙色的矮牵牛新品种，这一成果说明了综合 运用生物化学、基因工程和杂交育种的新技术，可以为花卉带来全新花色的新品种[1]。
采用了上述杂交技术后，杂交结果较为理想（见表5）。杂交花朵平均成活率为97.8%， 平均每花产籽数67.3粒。不同杂交组合平均产籽差异变化幅度为50.00-93.75。转基因植株与
-4-

对照分别与某一品种杂交时，平均每花产籽数极为接近。 菊花自交结实较少，王四清（1993）对部分小菊品种进行自交试验，自交结实率为每花
3.1.3 温室中栽培的转基因菊花在开花时的表现
转基因菊花和对照未转基因菊花在花色上没有差异，在花期、花茎、开花数等方面稍有 差异，但差异不显著，可能是随机误差所致（如表4）。但05株系的个别植株在花瓣层数上比 其他转基因植株多1-2层，转基因株系之间表现出一定的差异。
株系
05
08 33 42 对照
2.2.6 菊花杂交后代若干性状的观察 开花时观测菊花的株高、冠幅、花色、花径和重瓣性等指标，并进行归类和对比分析。
对株高数据采用SPSS统计软件进行方差分析，多重比较统一用邓肯氏法。
2.2.7 菊花F1代的优株选择 开花时对表现较好的单株进行性状的观测和描述，主要包括花色、花径、心径、瓣数、
-2-Байду номын сангаас
8
8
560
70.00
0.384
08套袋不授粉
10
10
3
0.30
C
33株系ב赛旗红’
8
8
590
73.35
0.385
c ‘美矮黄’ב赛旗红’
8
7
430
61.43
0.384
33套袋不授粉
10
10
0
0.00
D
42株系ב铺地金’
9
9
460
57.50
0.451
d ‘美矮黄’× ‘铺地金’
9
9
450
50.00
照未转基因品种‘美矮黄’进行生根培养试验，选出较好的培养基(1/2MS十NAAO.1)用作菊花 的生根培养，待茎段长出根后，搬入温室中进行炼苗，并移栽到育苗盘中。
每隔25d测量转基因植株及对照未转基因植株的平均株高、冠幅等指标；开花时开始记 录菊花的最终株高、花期、花色、花径、重瓣性等指标，并进行对比分析。对最终株高数据 采用SPSS统计软件进行方差分析，多重比较统一用邓肯氏法。

重瓣性、花期长短、花朵数、株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长、托叶、节间等指标，并进 行归类整理。
3. 结果与分析
3.1 转基因菊花的表现
3.1.1 不同培养基对菊花生根的影响 菊花的组织培养容易生根，对菊花的生根率、根长和根数进行方差分析和邓肯氏多重比
较(见表1、表2)，结果表明，4种培养基对菊花的生根率差异不显著，生根率均达87%以上， 但对菊花的平均根长、平均根数的差异达显著水平。1 /2MS十1BA 0.1和1/2MS+NAA0.1之间 在根长和根数上差异不显著，但它们的根长显著的小于MS和1/2MS培养基，根数显著的多 于MS和1/2MS培养基；MS和1/2MS培养基在根长和根数上差异均不显著。MS和1/2MS培养 基的根数长而少，1/2MS+NAA0.1和1/2 MS+IBA0.1培养基的根数短而多。
2.2.2 转基因菊花的杂交技术 用‘晚粉’、‘赛旗红’、‘玫瑰红’、‘铺地金’、‘紫勋章’等5个菊花品种作父本，与转基因菊
花和对照未转基因植株杂交，对其最终株高进行观测和统计分析。 在菊花现蕾时，用硫酸纸进行套袋隔离。柱头分泌物出现时，每朵花重复授粉5-6次，
当菊花种子完全变黑后，采种并统计杂交结实率，晒干后称千粒重。
229.636
40
5.741
总计
4468.000
44
3.1.2 温室栽培转基因菊花的营养生长
转基因植物是否能正常生长是育种者始终关心的问题。试验表明，转基因菊花的株高、
冠幅生长均与未转基因菊花相似，没有明显差异。对其株高进行方差分析和多重比较（见表
3），结果表明，转基因菊花和对照差异不明显。同时各个转基因株系的株高和冠幅的增长具
表1 菊花根长方差分析表
Table1 Analysis of the length of chrysanthemum's roots
变异来源
SS
df
组间
152.973
3
MS
F
F0.05
50.991
26.354#
2.84
组内
1274.415
1
1274.415
658.674
机误
77.393
40
1.935
2. 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 转基因菊花
在继代培养基上生长的未转基因菊花品种‘美矮黄’及转基因（CHS）‘美矮黄’ 05、08、 33和42四个株系。
-1-

2.1.2 非转基因菊花 未转基因的地被菊‘晚粉’、‘玫瑰红’、‘赛旗红’、‘铺地金’、‘紫勋章’五个品种。
有很大的相关性，这表明在一定生长期内，冠幅随着株高生长而增大，转基因菊花发育正常。
如图1。
表3 转基因菊花株高与冠幅方差分析表
Table Plant height and width of transgenic chrysanthemum and control
Source
SS
df
组间
2.5419
4
混合，按常规管理，种子萌动时开始记录。观测种子的萌发期、子叶出土期、真叶展开期、 真叶发育期、成苗期等指标。移栽后开始一记录菊花的株高、冠幅、现蕾期和花期等指标。
2.2.5 外源基因在转基因菊花中的遗传稳定性检测 随机选取08ב玫瑰红’的后代7株，采用CTAB提取法进行DNA的提取。以被检植株总
DNA、阳性对照总DNA为模板，进行PCR扩增反应，并设置空白对照。
MS
F
F0.05
0.635
0.246
2.42
组内
37587.336
1
37587.336
14577.15
-3-
机误
116.003
45
总计
37705.910
50
2.579

图1 菊花株高与冠幅相关曲线图 Fig.1 Relation of plant height and width
2.2.3 种子发芽试验 将杂交的种子浸泡在经高温灭菌的培养皿中24h左右，每个培养皿内依序排放50粒种子，
设3个重复，然后置25℃的发芽箱内进行培养，每天观察记载种子发芽数。
2.2.4 菊花温室促成栽培与生长发育节律的观测 将种子分别撒播到平底式育苗盘中，基质为泥炭、蛙石、珍珠岩和少量细沙按一定比例
0.405
42套袋不授粉
10
10
2
0.20
E
08ב紫勋章’
9
8
750
93.75
0.419
‘美矮黄’套袋不授粉
10
10
1
0.10
3.2 转基因菊花F1代种子活力
由表6可以看出转基因菊花与对照未转基因菊花的种子在发芽率、日平均发芽率和发芽 指数等指标没有显著差异，说明转入外源基因影响不大。其中08ב玫瑰红’发芽率等指数较 高，其中一个原因是这个杂交组合的种子较为饱满，其千粒重较高。
总计
1504.780
44
表2 菊花根数方差分析表
Table2 Analysis of the numbers of chrysanthemum's roots
变异来源
SS
df
组间
267.364
3
MS
F
F0.05
89.121
15.524#
2.84
组内
3971.000
1
3971.000
691.720
机误

转基因菊花遗传分析和杂交育种的研究
玉云祎，张启翔，高亦珂，陆苗
北京林业大学园林学院，国家花卉工程中心，北京（100083）
E-mail: zqx@
摘 要：本研究选取转 CHS 基因的地被菊品种‘美矮黄’的四个株系以及未转基因植株分别与 不同颜色的其他菊花优良品种杂交，对转基因菊花进行遗传育种问题的探讨。 结果表明，转基因菊花在温室中能够正常生长，不因外源基因的转入而使其生长受到阻碍， 能够保持原有的优良性状，开花时不同的株系间存在一定的差异，05株系的个别单株重瓣性 发生了变异，但包括花色在内的其他大部分性状没有发生变异。在杂交育种中，通过杂交技 术的改进，得到了大量的菊花种子，转基因菊花的F1代种子发芽率高，不因外源基因的转入 而影响菊花种子的活力。转基因菊花F1代在温室中生长良好，将杂交育种与温室促成栽培相 结合，能够在一年之内完成两代的育种工作。进一步对08ב玫瑰红’的后代进行PCR检测表 明，外源基因可以通过有性方式遗传给后代，两个开黄色花的植株有外源基因的存在。 通过对菊花若干性状的遗传分析可知，菊花花色具有偏母性遗传的倾向，株高具有一定的遗 传优势，花径和重瓣性具有趋小性退化的趋势。杂交后代的性状出现了广泛的分离，花色、 株高、花径、重瓣性等性状都有超亲遗传的现象有利于菊花育种的选择。通过对后代的评比 和选择，己选出若干综合性状相对较好的单株。 关键词：转基因菊花，遗传分析，杂交育种
2.1.3 外源基因检测试剂与引物 PCR引物：PCR反应中所使用的引物是根据潮霉素抗性基因设计的，序列为： 5’primer：CGT CTG CTG CTC CAT CAC AG 3’primer：GGA AGT TCA TTT CAT TTG GA
2.2 试验方法
2.2.1 转基因菊花的表型观察 用4种培养基(MS, 1/2MS, 1/2MS+NAAO.1, 1/2MS+IBAO.1)对4个转基因菊花株系及对
絮0-5.4粒种子[4]。陈俊愉（1963）、戴思兰（1992）先后报道小红菊、毛华菊、甘菊等野生 菊花自交结实很少[5][6]。本试验套袋不授粉的组合平均每花产籽率也极少，变化范围仅为 0-0.3粒，因此选好亲本后，对母本进行套袋不去雄是可行的。
表5 转基因菊花杂交情况及结果
Table5 The result of crossing transgenic chrysanthemum