野生兰科植物菌根内生真菌分离及鉴定

为 兰科 植物 的快 速 繁殖 和快 速生 长技 术提 供可 靠 的理论 依 据 和有 益 的菌 根 真菌 ．
１ 材 料 和 方 法
１ １ 供 试 材 料 ．
２ ５种 野生 兰科 植 物为杭 州 师范 大学 生 命 与 环境 科 学 学 院 生 物化 学 与 分 子 生物 学 杭 州 市重 点 实 验 室
１ ４２ Ｐ ． ． ＣＲ 扩 增
利 用 通 用 引 物 Ｉ １（ Ｔ Ｃ ＡＧＧＴ ＴＳ ５＿ Ｃ ＧＴ ｒ ＧＡＡＣ Ｔ Ｇ ３）和 Ｉ Ｓ ５－ Ｃ Ｃ ＴＴ Ｃ ＧＴ － 扩增 内生 真 菌 ｒ ＮＡ Ｉ Ｓ区段 ． Ｄ Ｔ Ｐ Ｒ反应体 系为 ：０ ｘＴ ｑ Ｂ ｆ ｒ含 Ｍｇ。 ２ ５ Ｌ 模板 Ｄ ． Ｌ ｄ Ｐ ２ ５ｒ ｏ／ ） ． Ｌ Ｃ １ ×Ｅ ａ ｕｆ （ ｅ 。 ） ． 、 。 ＮＡ ２ ０ 、ＮＴ （ ． ｔ ｌＬ １ ５ｔ 、 ｅ ｏ ． ｔ
从平 板上 刮 取 约 ０ ．１ ｇ菌 丝 体 置 于 研 钵 中 ， 入 １ ｍＬ 裂 解 缓 冲 液 （ ０ 加 １ ０ ｍｍｏ／ ｉ ＨＣ 、 ｌＬ Ｔｒ － １ ｓ １ ０ｍｍｏ／ ＤＴ ４ ０ｍｍｏ／ ａ Ｉ ２， Ｓ ） ０ ｌＬ Ｅ Ａ、 ０ ｌＬ Ｎ Ｃ 和 Ｄｓ 与少 许 石英砂 ， 菌丝 充分 研磨 ． ９ ６ 将 液体 转移 至 １ ５ｍＬ ． 离心 管 ， 加 入 等 体 积 氯 仿 ／ 戊 醇 （ 积 比 为 ２ 并 异 体 ４：１ 抽 提． ） 高速 离 心后 取 上 清 液 ， 入 ２ Ｌ Ｒ ｓ 加 Ｎａｅ （ ０ｍｇ ｍＬ ，７℃水浴 保温 ３ ｉ． １ ／ ） ３ Ｏｒ ｎ 随后 ， ２倍 体积 无水 乙醇 沉淀 Ｄ ａ 用 ＮＡ， 用 ７ ％乙醇洗 涤 ２次 ， 并 Ｏ 自然 风 干后 溶 于适量 Ｔ Ｅ溶 液 ， 贮存 于 一２ Ｏ℃备 用． 取 ３肛 Ｌ ＤＮＡ样 品 用 ０ ８ 琼脂 糖凝 胶在 １ ． ×ＴＡＥ电泳 缓 冲液 中进 行 电泳 （ ０ ３ ｉ） 溴化 乙 １ ０Ｖ， ０ｒ ｎ ， ａ 啶 染色后 ， 紫外灯 下 观察拍 照 ．
（ ＡＭ４ ９ ７ ），ＨＫＵ一 ４ Ｄｑ５ ５ ８ ，Ｆ．Ｓ ６ ３（ １０４ ５ ３（ ３ １ ６） ．０ １ ＨＭ０ ４ ２ ，ＧＤ５ ７（ ６ ４ ９） ０ ＤＱ８ ０ ８ ），ＡＲＳ １ ０ １１ ７ ＥＦ ９ ５
第 ３ 期
采集保 存．
吴 剑丙 ， ： 等 野生 兰科 植物 菌根 内生 真 菌分 离及鉴 定
２９ ２
１ ２ 兰科 植物 菌根 结构 观察 ．
取新 鲜 的兰科 植 物根若 干 段 ， 用石 蜡切 片法 制 片 ， 红 固绿双 重染 色 ， 采 番 中性树 胶封 片后 ， 微镜 观察 显 结 构并 拍照 ．
Ｉ Ｓ （ ０￣ ｌＬ １ ５ Ｌ、Ｔ ４ Ｉ ｍｏ／ ） ． Ｌ、 ｑ酶 （ ｔ ）０ ２ Ｌ、 菌 ｄ Ｈｚ ５ ８ ． Ｔ １ １ ｍｏ／ ） ． Ｉ Ｓ （ Ｏｔ ｌＬ １ ５ ￣ Ｔａ ２Ｕ／ Ｌ ． ￣ 灭 ｄ ０ １ ． Ｌ 扩 增程 序 为 ：６℃预变 性 ２ｍｉ ；４℃ 变性 ４ 、５℃退火 ４ 、２℃延伸 ５ ，５个反 应循 环 ； ２℃ ９ ｎ９ ５Ｓ ５ ５Ｓ ７ ＯＳ ３ ７
１４ ４ Ｉ ． ． ＴＳ序 列 数 据 分 析
菌根 内生 真菌 ｒ ＮＡ １和 Ｉ Ｓ Ｄ Ｉ ＴＳ Ｔ ４序 列 的起 止 范 围通过 Ｂａ ｔ ｌｓ 比对并参 照 Ｇｅ Ｂ ｎ ｎ ａ ｋ中已有兰科 植 物
菌根 真菌 的 Ｉ Ｓ范 围确定 ． Ｔ
系统 树 的构建 使用 Ｄ ＮＡＭＡＮ 程序 （ ｒ ｎ５ ２ ２ Ｌ ｎ ｏ ｉｓ ｆ， ｅ ｅ ａ ａ ａ 的邻 接法 （ ｉｈ Ｖｅｉ ． ． ， ｙ ｎ ｎＢｏ ｏｔＱｕ ｂ ｎ ｄ ） ｏ Ｃ Ｎｅ — ｇ ｂ ｒ ｏｎｎ ） 行 ， ｏ－ ｉｉｇ 进 ｊ 步差 值为 １０ ０ ． ０ 次 系统 树 的水 平距 离与 序列 之间 的距 离成 正 比 ， 垂直距 离是 任 意 的． 用于 Ｄ ＮＡ 序 列 比较 的真菌 Ｉ ＴＳ序 列来 自于 Ｇｅ Ｂ ｎ ， Ｂａ ｔ ｎ ａ ｋ 以 ｌｓ 比较后 同源性 最 高 的序 列 为参 考 ． 序 列（ 用分 离 物编号 表 示 ， 号 内是 该 分 离 物 的 登 录 号 ） 括 ：Ｚ （ 括 包 Ｊ １ ＨＱ１ ３ ４ ） Ｅ － （ １ ９ ８ ， Ｄ ３ ＨＭ０ ３ ３ ） ｃ １ ４ ４ ７ ８ ，ｙ ４
收 稿 日期 ： ０ ００ — ２ ２ １ — １２
基 金 项 目 ： 家 自 然 科 学 基 金 项 目 （ ０ ７ １０，３ ０ ０ ９ ） 浙 江 省 重 大 科 技 专 门 项 目 （ ０ ８ ２ ８ ） 杭 州 市 科 技 计 划 项 目 国 ３８ ０ ８ １７２８ ； ２ ０ Ｃ１０ １ ；
（ 州 师 范大 学 生命 与 环 境 科 学学 院 ， 江 杭 州 ３ ０ ３ ） 杭 浙 １ ０ ６
摘
要 ： 用 石 蜡 切 片技 术 对 实 验 室 收 集 保 存 的 ２ 利 ５种 野 生 兰 科 植 物 的 菌 根 结 构 进 行 显 微 观 察 ， 采 用 常 并
规 分 离 方 法 ， 内生 真 菌 进 行 分 离 及 菌 落 形 态 和分 子 生 物 学 鉴 定 ． 果 表 明 ： 验 室 保 存 的 兰 科 植 物 具 有 典 型 的 对 结 实
１ ３ 内生真 菌 的分 离和 纯化 ．
取 多年 生老根 及新 鲜 营养 根根尖 （ ～５ｃ ， 面 泥 沙经 自来 水 冲洗 干 净后 ， ７ 乙醇 消 毒 ６ ． ４ ｍ） 表 用 ５ ０ｓ 弃 乙醇 ， 加入 ０ １ 升 汞 ， 菌 ５ｒｉ 取 出根尖 ， 无菌水 冲洗 ３次 ． ． 灭 ｎ后 ａ 用 随后 ， 无菌 条件 下用解 剖 刀将材 料 在 横切 成 ３ Ｔ 的薄 片 ， ～５ｍｌ ｌ 置于 含链霉 素 （ ０￣ ／ ） 马铃薯 葡 萄糖琼 脂 培养基 （ ＤＡ） ， 面 朝 向培 养 ５ ｇ ｍＬ 的 Ｐ 上 切 基． 每个 平板 放置 组织 ４ ～５块 ，５℃恒 温避 光培 养． ２
延 伸 ５ｍｉ． ｎ １ ４ ３ Ｉ Ｓ序 列 测 定 ． ． Ｔ
Ｐ Ｒ扩增 产 物用 ＤＮＡ 片段 回收试 剂盒 （ ｙ ｅ 司 ） Ｃ Ａｘ ｇ ｎ公 回收后 ， 连接 到 ｐ １ 一 ＭＤ ８Ｔ载 体 （ ＫＡＲ 公 ＴＡ Ａ
司 ） 转化 感受 态细 胞 Ｅ ｏｉ Ｈ一ａ 选 取 阳性克 隆进 行序 列测 定 （ ， ．ｃｌ Ｄ ５ ， 上海华 大 基 因公 司） ．
１ １属 １２ ７种 ， ７ ４ 包括 许 多著 名 的药用 植 物和珍 贵 花卉 ， 天 麻 、 如 铁皮 石 斛 、 花石 斛 、 兰 、 兰 和蝴 蝶 兰 密 蕙 墨 等 Ｌ ． 中， 斛 属 （ ｎ ｒｂｕ 植 物是 目前临 床应 用 和药理 研究 的重 要 材 料 ， 到 医学 和生 物 学 领域 的 １其 ］ 石 Ｄｅ ｄ ｏ ｉｍ） 受
（ ０ ８ ４ ２ ６， ０１ ０ ２Ｂ ５ ． ２ ０ ０ ３ Ｔ０ ２ ０１ ３ ２ ）
作者简介 ： 剑丙（９０ ）女 ， 江桐乡人 ， 理研究员 ， 士（ ）主要从事植物与微生物互作机理研究． 吴 １８ 一 ， 浙 助 博 后 ，
通 信 作 者 ： 慧 中 （ ９ ２ ） 男 ， 江 义 乌 人 ， 授 ， 士 ， 要 从 事 植 物 系 统 生 物 学 研 究 ． — ｉ： ｚ２ １ ３ ｃｍ 王 １６一 ， 浙 教 博 主 Ｅ ｍａｌｗｈ６ ＠ ６ ．０
菌 根 形 态 ； 菌 根 中共 分 离 获 得 ８ 株 真 菌 菌 株 ， 属 于 镰 孢 属 （ ｕａ ｉｍ ｉｋ 、 壳 属 （ ｈ ｅ ｍｉｍ Ｋｕ ｚ ｘ 从 ２ 分 Ｆ ｓｒｕ Ｌｎ ） 毛 Ｃ ａｔ ｕ ｎ ｅｅ ｏ
Ｆ ． 和 木 霉 属 （ ｒｃｏ ｅｍａＰ ｒｏ ｎ 等 １ 属 ， 中 镰 孢 属 真 菌 占 ７ ． ． ｒ） Ｔ ｉｈｄ ｒ ｅｓｏ ） １ 其 Ｏ７
诸 如移 栽苗 成活 率低 、 长 发育 速度 缓慢 、 花结 果率 低 于原生 态 条件下 的兰科 植物 等 新 问题 ． 生 开 删 究其 原 因， 主要 是 由于 兰科 为 菌根 植 物 ， 自然 条 件 下 与真 菌 形成 共 生 关 系口 。其 中 ， 在 。 ． 菌根 真 菌 能促 进 兰科 植 物 种 子萌 发 、 提高植 株 对矿 质元 素 的吸 收能 力 、 短 生长 周期 、 强抗 逆性 ， 兰科植 物 的生 长和 生命 活动 中 缩 增 在
鉴定 野 生 兰科植 物 菌根 真菌 ， 找有 益真 菌 ， 有 助于 提 高珍 稀 兰科 植 物 的 人工 栽 培 技 术． 研究 采 用 常 寻 将 该
规 的平 板分 离方 法 ， 对实 验室 收集 保存 的 ２ 种 野 生兰科 植 物进 行菌 根 内生 真菌 的分 离 、 定 和种类 研 究 ， ５ 鉴
待菌 丝体 从组 织块 中长 出 ， 形成 一定 大 小 的 菌 落 ， 其 边缘 挑 取 菌 丝 体 转 移 至新 鲜 Ｐ 从 ＤＡ 平 板 ， 复 重
至获 得纯 培养 物后 ， ＤＡ斜 面 保存． Ｐ
１ ４ 茵 根 内生真 菌分 子鉴 定 ．
１ ４ １ 总 ＤＮＡ 提 取 与 电 泳 检 测 ． ．
第 １ Ｏ卷 第 ３期
２１ ０ １年 ５月
杭 州师范 大 学学 报 （ 自然 科学 版 ）
Ｊ ｕｎ ｌ ｆ ａ ｇ ｈ ｕＮ ｒ ｌ ｎ ｅ ｓ ｙ Ｎ ｔｒ ｌ ｃ ｎ ｅ Ｅ ｉｏ ） ｏ ｒａ ｏ ｎ ｚ ｏ ｏ ｍａ Ｕ ｉ ｒ ｉ （ ａｕａ Ｓ ｉ ｃ ｄｔ ｎ Ｈ ｖ ｔ ｅ ｉ
密切 关 注 ． ］ 随着 需求 量 的 日益增加 和天然 资 源 的过度 采挖 ， 部分 珍 贵兰科 种 类 已濒 临灭绝 ． 因此 ， 究 推 研 广 兰科 植物 的人 工栽 培 扩繁 技术 ， 于保 护珍 稀 品种 、 高兰科 植 物产 量具 有重 要意 义． 对 提 目前 ， 稀 兰科 植物 的人 工扩 繁 多采 用实 验室 组织 培 养 技术 来 进 行． 而 ， 培苗 温 室 移栽 后 又 面 临 珍 然 组