生物分离工程 第4章-细胞的破碎-
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生物分离工程5(细胞破碎技术)
01
02
03
04
生物制药
用于提取和分离药物、蛋白质 、酶等生物制品。
食品工业
用于提取植物和动物细胞中的 营养成分，如植物油、动物蛋
白等。
环境科学
用于处理废水中的有害物质， 如重金属、有机污染物等。
农业领域
用于提取植物细胞中的有用成 分，如植物激素、天然色素等
。
02
细胞破碎技术的基本原理
物理法
01
表面活性剂法
利用表面活性剂改变细胞 壁的通透性，使细胞内容 物释放出来。
有机溶剂法
利用有机溶剂如丙酮、乙 醇等溶解细胞壁，使细胞 内容物释放出来。
生物法
酶解法
利用酶如溶菌酶、蛋白酶等将细胞壁分解，使细胞内容物释 放出来。
细菌分泌的蛋白酶
利用某些细菌分泌的蛋白酶将细胞壁分解，使细胞内容物释 放出来。
细胞破碎技术的历史与发展
最早的细胞破碎技术可以追溯到19世纪末，当时人们开始使用机械研磨法破碎细胞。
随着科技的发展，出现了多种新型的细胞破碎技术，如超声波破碎、高压均质破碎、 化学渗透压破碎等。
近年来，随着生物技术的快速发展，细胞破碎技术也在不断改进和完善，以满足更 高效、环保和低成本的需求。
细胞破碎技术的应用领域
细胞破碎过程需要消耗大量的能量，这可能导致生产成本的增
加。
可能引起样品污染
02
在破碎过程中，如果设备或条件控制不当，可能会引起样品的
交叉污染或样品中原有成分的降解。
对细胞的损伤
03
高强度的破碎条件可能会对细胞内部结构造成损伤，影响后续
的分离和提取过程。
04
细胞破碎技术的应用案例
在制药行业中的应用
生物分离工程 细胞分离与破碎
vg
2 S L dp
18 L
g
v S S 2 r
细胞分离－离心分离方法
差速离心分级
区带离心
差速区带离心
平衡区带离心
差速离心分离
差速离心是以菌体细胞的收集或除去为目的
的固液离心分离方法，应用某一特定颗粒沉淀
的离心力在预定的离心时间内得到一部分颗粒
沉淀及包含未沉淀颗粒的上清液。
－细胞膜组成
（A）
（B）
胞内产物释放
－影响产物释放的环境因素
在复杂培养基中生长的大肠杆菌细胞其破碎较单 一培养基中生长的大肠杆菌细胞更难； 对数生长期的细胞会表现得更加脆弱。 从连续培养过程中获得的、具有较高比生长速率 的念珠菌的细胞壁更加脆弱，而摇瓶培养的念珠 菌体则有更加充裕的机会构建更加坚固的细胞壁。 酵母细胞壁的厚度和破碎阻力随年龄增长而增加 经常在幼酵母细胞中出现的芽痕（Bud scars） 可引起酵母细胞局部细胞壁强度的降低
模型校正
形态校正：颗粒的形状系数 速度校正：空隙率函数
S
F ( )
A AP
提高重力沉降的途径
加入中性盐：双电层排斥电位降低 加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝图 引入外力
细胞分离－重力沉降理论
模型校正
形态校正 速度校正
提高重力沉降的途径
加入中性盐； 加入高分子絮凝剂 引入外力
模型假设：
细胞破碎速度与未破碎细胞浓度x成正比 从破碎的细胞释放产物的速率与胞内未释放的产物浓度 成正比 模型推导
胞内产物释放
－非机械破碎之
酸碱处理 化学试剂处理 酶溶 自溶 渗透压冲击法 冻结-融化法
生物分离工程细胞分离与破碎课件PPT
二、发酵液的预处理及细胞破碎
固液分离
常规的分离方法：
重力沉降 离心沉降 过滤 生物细胞分离的主要手段
液固体系中的重力沉降
球形粒子Stokes匀速沉降方程：
d u ( s ) g 18
2
细胞悬浮液的基本特性
细胞悬浮液：包含生物细胞、水、细胞代谢物、未消 耗的培养基以及少量的细胞碎片。 细胞悬浮液能否实现理想的分离效果取决于细胞 的种类及表面特性、分泌物的性能等，因为这些特性 决定了细胞在发酵液中的状态、即是自由状态还是絮 凝状态以及悬浮液的黏度等。 发酵液的黏度、细胞的大小、状态决定了固 -液 分离采用的方式、设备。
Fc r 2 4 2 N 2 r
Fc
4 2 N 2 r Z g
离心力或离心加速度
Z
分离因素或离心强度
在科学文献中，常用离心力或离心 强度来表征离心的操作条件
离心设备
Z越大，越有利于分离。常按分离因素Z的大小，对离心机进行分类。
（1） Z 3000，为常速离心机 （2） Z= 3000 ~ 5000，为中速离心机 （3） Z 50000，为高速离心机 （4） Z= 2104 ~ 106， 为超高速离心机 离心沉降设备 瓶式离心机：实验室常用的离心机，低、中速； 工业用无孔转鼓离心机 （1）管式离心机：直径为40-150mm，长径比为4~8，离心强度可达 15000~65000，处理能力为0.1~0.4m3/h, 适合分离 的 固体粒子直径为0.01~100m, 固液密度差大于 0.01g/cm3, 体积浓度小于1%的难分离悬浮液，常 用 于微生物菌体和蛋白质的分离。
絮凝作用：利用含有多个功能基团的线状高分子 聚合物的架桥作用使细胞发生絮凝而 变成粗大的絮凝团。絮凝剂的浓度、 悬浮液的酸度和离子强度都将影响絮 凝的效果。
固液分离
常规的分离方法：
重力沉降 离心沉降 过滤 生物细胞分离的主要手段
液固体系中的重力沉降
球形粒子Stokes匀速沉降方程：
d u ( s ) g 18
2
细胞悬浮液的基本特性
细胞悬浮液：包含生物细胞、水、细胞代谢物、未消 耗的培养基以及少量的细胞碎片。 细胞悬浮液能否实现理想的分离效果取决于细胞 的种类及表面特性、分泌物的性能等，因为这些特性 决定了细胞在发酵液中的状态、即是自由状态还是絮 凝状态以及悬浮液的黏度等。 发酵液的黏度、细胞的大小、状态决定了固 -液 分离采用的方式、设备。
Fc r 2 4 2 N 2 r
Fc
4 2 N 2 r Z g
离心力或离心加速度
Z
分离因素或离心强度
在科学文献中，常用离心力或离心 强度来表征离心的操作条件
离心设备
Z越大，越有利于分离。常按分离因素Z的大小，对离心机进行分类。
（1） Z 3000，为常速离心机 （2） Z= 3000 ~ 5000，为中速离心机 （3） Z 50000，为高速离心机 （4） Z= 2104 ~ 106， 为超高速离心机 离心沉降设备 瓶式离心机：实验室常用的离心机，低、中速； 工业用无孔转鼓离心机 （1）管式离心机：直径为40-150mm，长径比为4~8，离心强度可达 15000~65000，处理能力为0.1~0.4m3/h, 适合分离 的 固体粒子直径为0.01~100m, 固液密度差大于 0.01g/cm3, 体积浓度小于1%的难分离悬浮液，常 用 于微生物菌体和蛋白质的分离。
絮凝作用：利用含有多个功能基团的线状高分子 聚合物的架桥作用使细胞发生絮凝而 变成粗大的絮凝团。絮凝剂的浓度、 悬浮液的酸度和离子强度都将影响絮 凝的效果。
《细胞破碎分离》ppt课件
法
珠捣碎
细胞的大规模处置
超声波法 使细胞遭到液体剪 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模
切力而破碎
处置
2.非机械法
非机械方法很多 1) 生物法-酶溶解〔enzyme lysis〕 2) 化学法溶胞〔chemical treatment〕 3) 物理法 浸透压冲击〔osmotic shock〕 冻结和融化〔freezing and thawing〕 枯燥法 其中酶溶解法和化学溶胞运用最广
大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖 构成，少数含纤维素。
红面包霉菌细胞壁构造： 最外层(a)是α-和β-葡聚糖的
混合物， 第2层(b)是糖蛋白的网状构造 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。
真菌细胞壁的构造表示图
真菌细胞壁的强度：主要决议于聚合物的网状构 造，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维 状构造，所以强度更高。
➢ 缺陷： ➢ 超声波产生的化学自在基能使某些敏感性活性
物质失活。 ➢ 对冷却的要求非常高，所以不易放大，但在实
验室小规模细胞破碎中常用。
不同机械破碎方法的比较
技术
匀浆法 (孔型)
原理
效果 本钱
举例
使细胞遭到液体剪 猛烈 适中 细胞悬浮液大规模
切力而破碎
处置
研磨破碎 细胞被玻璃珠或铁 猛烈 廉价 细胞悬浮液和植物
度，研磨剂量，颗粒大小，以及温度等 相关。
3〕超声波破碎
作用机理：液体剪切力 超声波破碎法
〔Ultrasonication)利用超 声波振荡器发射的15-25kHz 〔千赫〕的超声波探头处置 细胞悬浮液。 超声波的细胞破碎效率与细 胞种类、浓度和超声波的频 率有关。
超声波破碎的机理
生物分离工程 第4章-细胞的破碎-
9
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
8
第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
5
细胞破碎的必要性
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast 应用范围 治疗急性淋巴癌 牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
8
第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
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细胞破碎的必要性
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast 应用范围 治疗急性淋巴癌 牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
生物分离工程5(细胞破碎技术)
影响超声波破碎的因素
超声波的声强、频率、温度控制能力和破碎时间。 细胞悬浮液的离子强度、pH和细胞种类等对破碎 效果也产生影响。 发射针的快速振动会产生大量的热，在使用中必 须每间隔几分钟关掉发生器以消散热量。 超声波破碎时细胞浓度一般在20％左右，高浓度 和高黏度都会降低破碎速度。 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性 物质变性失活，噪声令人难以忍受，而且大容量 装置的声能传递、散热均有困难，因而超声破碎 的工业应用潜力有限。
性增强。
Triton X-100
Triton X-100 是非离子型清洁剂，对
疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并
溶解磷脂，因此其作用部位主要是内膜的
双磷脂层。 tritonX—100 常与其它试剂混
合使用。
盐酸胍和脲
盐酸胍和脲是常用的变性剂。一般认为胍能与 水中氢键作用，削弱了溶质分子间的疏水作用， 从而使疏水性化合物溶于水溶液，如胍能从大肠 杆菌膜碎片中溶解蛋白。
霉菌的细胞壁
大多由几丁质和葡聚糖构成，还含有少量蛋白质和脂类。
酵母和真菌的细胞壁
主要为葡聚糖为β -1，6葡聚糖，通过β -1，3糖苷键与 D-葡萄糖第一侧链交联，也含有甘露糖和几丁质
植物细胞壁
含纤维素、半纤维素、木质素等
原核细胞的结构
在电子显微镜下，可 观察到革兰阳性菌细胞壁 较厚，具有20～80 nm的 肽聚糖层，约占细胞壁干 重的50％。而革兰阴性菌 的肽聚糖层较薄，仅2—3 nm，占细胞壁干重的10％ 左右。 在肽聚糖层外还有一 较厚的外壁层，约8～10 nm，主要为脂蛋白、脂多 糖和其他脂类，含量为细 胞壁干重的80％。
胶体磨基本参数
细胞的破碎与分离课件
2)目的产物测定法 蛋白质量或酶的活力
• 细胞破碎后，测定悬浮液中细胞内含 物的增量来估算破碎率。 • 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测 定上清液中蛋白质的含量或酶的活力 ，并与 100% 破碎所获得的标准值直接 比较。
3)导电率测定法
• 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放 到水相，使导电率上升。
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖 ，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。 有些目标产物存在于生物体中。
尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质
是在细胞内沉积。
脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
1 概述
• 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代 谢物如氨基酸、抗生素 • 细胞本身： 单细胞蛋白 如面包酵母 • 胞内产品： 各种胞内酶、基因工程产物
不同机械破碎方法的比较
技术 原理 效果 成本 适中 举例 细胞悬浮液大规模 处理 细胞悬浮液和植物 细胞的大规模处理 细胞悬浮液小规模 处理 匀 浆 法 ( 须 使 细 胞 通 过 的 小 剧烈 孔型) 孔，使细胞受到剪 切力而破碎 珠 磨 破 细 胞 被 玻 璃 珠 或 铁 剧烈 碎法 珠捣碎 超 声 波 用 超 声 波 的 空 穴 作 适中 法 用使细胞破碎
1）-3 X－挤压器法 X-press法
• 改进的高压方法：将浓缩的菌体悬浮液冷却至 25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击， 使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。 • 细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的 微生物变形而引起的。
• 此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、 细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但 不适应于对冷冻敏感的生化物质。
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
超声波法Ultrasonication
生物分离工程(细胞破碎技术)
②细胞外形完整；碎片少，有利于后分离。 细胞外形完整；碎片少，有利于后分离。 ③核酸释出量少，浆液黏度低，便于进一步提 核酸释出量少，浆液黏度低， 取。 缺点： ①时间长，效率低。②化学试剂具有毒性。 时间长，效率低。 化学试剂具有毒性。 ③通用性差。 通用性差。
（一）高压匀浆破碎法
1、高压匀浆阀及其破碎机理 高压匀浆阀及其破碎机理 2、温控与能耗 3、 存在的问题
影响超声波破碎的因素
超声波的声强、频率、温度控制能力和破碎时间。 细胞悬浮液的离子强度、pH和细胞种类等对破碎 细胞悬浮液的离子强度、pH和细胞种类等对破碎 效果也产生影响。 发射针的快速振动会产生大量的热，在使用中必 须每间隔几分钟关掉发生器以消散热量。 超声波破碎时细胞浓度一般在20％左右，高浓度 超声波破碎时细胞浓度一般在20％左右，高浓度 和高黏度都会降低破碎速度。 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性 物质变性失活，噪声令人难以忍受，而且大容量 装置的声能传递、散热均有困难，因而超声破碎 的工业应用潜力有限。
盐酸胍和脲
盐酸胍和脲是常用的变性剂。 盐酸胍和脲是常用的变性剂。一般认为胍能与 水中氢键作用，削弱了溶质分子间的疏水作用， 水中氢键作用，削弱了溶质分子间的疏水作用， 从而使疏水性化合物溶于水溶液， 从而使疏水性化合物溶于水溶液，如胍能从大肠 杆菌膜碎片中溶解蛋白。 杆菌膜碎片中溶解蛋白。 盐酸胍不仅能改变细胞的通透性， 盐酸胍不仅能改变细胞的通透性，而且能溶解 不溶性重组蛋白(如包含体) 不溶性重组蛋白(如包含体)，并在其它试剂的配 合下使其二硫键断裂，变性解离成单体， 合下使其二硫键断裂，变性解离成单体，从而释 放出来。除去变性剂和杂蛋白后， 放出来。除去变性剂和杂蛋白后，在一定条件下 恢复肽链内或肽链间的二硫键， 恢复肽链内或肽链间的二硫键，再折迭复性成具 有活性的蛋白质立体结构。 有活性的蛋白质立体结构。
生物分离工程第四章细胞破碎课件ppt
通过破碎细胞，可以释放 细胞内的蛋白质，便于后 续的提取和纯化。
药物生产
在制药工业中，细胞破碎 技术可用于生产各种药物， 如抗生素、疫苗等。
基因工程
细胞破碎是基因工程中的 重要步骤，通过破碎细胞， 可以分离出基因表达产物。
在食品工业领域的应用
பைடு நூலகம்食品添加剂
利用细胞破碎技术，可以 从天然原料中提取出食品 添加剂，如植物色素、天 然香料等。
低温破碎法
总结词
利用低温下细胞膜的通透性增加和脆性增加而破碎
详细描述
低温破碎法是在低温下进行细胞破碎的方法。在低温下，细胞膜的通透性增加， 脆性也增加，因此容易受到外力的破碎。该方法对细胞内物质损伤较小，但需要 控制好温度和时间，以避免对细胞内物质造成不良影响。
03
非机械法细胞破碎
渗透压冲击法
压差循环破碎法
总结词
利用压力差使细胞通过狭窄通道时受到 挤压而破碎
VS
详细描述
压差循环破碎法是利用压力差使细胞通过 狭窄的通道或阀门时受到挤压而破碎。在 高压下，细胞受到较大的流体剪切力和挤 压力，导致细胞壁破裂。该方法破碎效率 较高，适用于大规模生产，但对细胞内物 质损伤较大，且需要针对不同细胞类型选 择合适的压力和循环速度。
化学法
总结词
利用化学试剂与细胞膜发生反应的方法
详细描述
通过使用某些化学试剂，如酸、碱、有机溶剂等，与细胞膜 发生反应，破坏细胞膜的结构和功能，从而使细胞内容物释 放。化学法具有操作简便、适用范围广等优点，但可能会对 细胞造成一定的损伤。
04
细胞破碎的应用
在生物制药领域的应用
01
02
03
蛋白质提取
与纳米技术的结合
药物生产
在制药工业中，细胞破碎 技术可用于生产各种药物， 如抗生素、疫苗等。
基因工程
细胞破碎是基因工程中的 重要步骤，通过破碎细胞， 可以分离出基因表达产物。
在食品工业领域的应用
பைடு நூலகம்食品添加剂
利用细胞破碎技术，可以 从天然原料中提取出食品 添加剂，如植物色素、天 然香料等。
低温破碎法
总结词
利用低温下细胞膜的通透性增加和脆性增加而破碎
详细描述
低温破碎法是在低温下进行细胞破碎的方法。在低温下，细胞膜的通透性增加， 脆性也增加，因此容易受到外力的破碎。该方法对细胞内物质损伤较小，但需要 控制好温度和时间，以避免对细胞内物质造成不良影响。
03
非机械法细胞破碎
渗透压冲击法
压差循环破碎法
总结词
利用压力差使细胞通过狭窄通道时受到 挤压而破碎
VS
详细描述
压差循环破碎法是利用压力差使细胞通过 狭窄的通道或阀门时受到挤压而破碎。在 高压下，细胞受到较大的流体剪切力和挤 压力，导致细胞壁破裂。该方法破碎效率 较高，适用于大规模生产，但对细胞内物 质损伤较大，且需要针对不同细胞类型选 择合适的压力和循环速度。
化学法
总结词
利用化学试剂与细胞膜发生反应的方法
详细描述
通过使用某些化学试剂，如酸、碱、有机溶剂等，与细胞膜 发生反应，破坏细胞膜的结构和功能，从而使细胞内容物释 放。化学法具有操作简便、适用范围广等优点，但可能会对 细胞造成一定的损伤。
04
细胞破碎的应用
在生物制药领域的应用
01
02
03
蛋白质提取
与纳米技术的结合
生物分离工程-细胞破碎幻灯片
过滤设备选择的依据
被过滤液体的特性 固形物含量1-10％是采用连续式过滤机的极限。
生产规模：大规模——连续式 小规模——间歇式
操作条件 操作要求 过滤机的材料：食品和药品工业—聚丙烯或聚酯
过滤设备
板框过滤机 优点：
构造简单、装配紧凑、过滤面积大、允许采 用较大的操作压力，辅助设备少，动力消耗小， 过滤和洗涤质量好，对固形物含量要求低，材料 选择范围广。 缺点：
常用凝聚剂——高价阳离子
凝聚能力的次序为： Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li
+
常用电解质： Al2(SO4)3·18H2O、AlCl3·6H2O、FeCl3、
ZnSO4、MgSO4
絮凝
定义： 是指在某些高
分子絮凝剂存在下， 基于架桥作用，使 细胞聚集形成粗大 的絮凝团的过程。
• 超声波振荡过程中遇到的最
大问题就是产生的热量不容 易驱散，所以影响了它在大 规模工业上的应用，但在实 验室和小规模生产中是一种 很好的方法
15.2.2 非机械法
非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻结 和融化、枯燥法和化学法溶胞等.
1)酶解法 是利用酶反响，分解破坏细胞壁上特 殊的键，从而到达破碎目的。酶解法可以在细 胞悬浮液中参加特定的酶，也可以采用自溶作 用。
真空转鼓过滤机
14.2.3 离 心
定义： 借助离心机旋转所产生的离心力的作
用，促使不同大小，不同密度的粒子别离 的技术。
离心力〔单位质量〕
F C r 2 r ( 2 N ) 2 4 2 N 2 r
分离因数
相关主题
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高压匀浆机
35
高压匀浆法使用时注意事项
高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa 为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节 温度，使出口温度调节在20℃左右。 可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方 式。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎 的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用 多次循环的操作方法。
破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同
大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎； 生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基 上容易破碎。
41
X-Press挤压机
改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至25℃至-30℃形成冰晶体，利用500MPa以上的 高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。 细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋 在冰中的细胞变形所引起的。 主要用于实验室中。 优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的 粉碎程度低以及活性的保留率高。 对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。
蔗糖酶
青霉素酰化酶
Saccharomyces Cerevisiae
Escherichia Coli
糖果、蜜饯
苄青霉素的脱酰作用
6
表2 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物
药物名 宿主 用途
胰岛素 人生长激素（HGH）
α-干扰素
大肠杆菌 大肠杆菌
大肠杆菌
治疗糖尿病 治疗侏儒病
治疗毛状细胞白血 病和卡波济肉瘤
机械破碎 物理破碎
捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法 温度差破碎法 压力差破碎法 有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱 自溶法 外加酶制剂法
24
化学破碎
酶促破碎
细胞破碎方法原理
分
机
高压匀浆法 液体剪切作用
液体剪切作用 固体剪切作用 酶分解作用
类
珠磨法
作 用 机 理
固体剪切作用
适
应
性
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分 子目的产物易失活，浆液分离困难
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
3
概述
不同类型细胞生产目标产物的类型：
动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/霉菌等）胞内、胞外
4
概述
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，
及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。
有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是
外因：各类微生物的遗传信息、培养条件、 菌龄、外界环境等。
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植物细胞壁的结构
对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生 壁两部分。
初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～ 3μm），富有弹性。 初生壁由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维 素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚 糖，许多这样的长链形成微纤丝。 它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来 自于微纤丝。
细胞
动物细胞 革兰氏阴性芽孢杆菌和球 菌 革兰氏阳性芽孢杆菌 酵母 革兰氏阳性球菌 孢子 菌丝
声波
7 6 5 3.5 3.5 2 1
搅拌
7 5 (4) 3 (2) (1) 6
液压
7 6 5 4 3 2 (1)
冷冻压力
7 6 4 2.5 2.5 1 5
注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。
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植物次生细胞壁
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生 细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚 (4μm以上)，常有三层组成。 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增 加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则， 而且存在木质素的沉积。 因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性， 使植物细胞具有很高的机械强度。
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红面包霉菌细胞壁具有同心圆层 状结构主要存在三种聚合物 最外层(a)是α-和β-葡聚糖的 混合物， 第2层(b)是糖蛋白的网状结构 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。
红面包霉菌细胞壁的结构示意图
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微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的 组成以及它们之间相互关联的程度。 内因：连接细胞壁网状结构的共价键。
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
8
第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
9
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
7
n
细胞破碎（cell disruption）技术是指利用外力破坏细 胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来 的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质 （产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认 为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
n
n
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细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围；
使细胞具有一定的形状和强 度。
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细菌细胞壁结构
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构， 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存 在的肽键的数量和其交联的程度。网状结构越致 密，破碎的难度越大。 革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很 大不同。革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳 性细菌的坚固。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种 细胞生产了很多细胞重组的产物。
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图1 革兰氏菌细胞壁结构图
（a）革兰氏阳性菌 （b）革兰氏阴性菌
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酵母的细胞壁结构
最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了 细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状； 上面的是一层糖蛋白； 最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接 成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复 合物。 破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交 联的紧密程度和它的厚度。
20
n
n
不同种类的细胞结构差别很大，破碎的 难易程度也不同，由难到易的大致排列 顺序为：植物细胞＞真菌（如酵母菌） ＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞ 动物细胞。
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第二节 细胞破碎技术
以大肠杆菌为 宿主的药物多 为胞内产物 n
n
目的：释放细胞内含物。 分类：按照是否存在外加作用力
分为机械法和非机械法。 问题： 破碎率是否越高越好？
第四章 细胞的破碎
生物分离过程的一般流程
原料液 预处理和固液分离 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 复性 细胞破碎 碎片分离 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 纯化(层析、电泳) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤) 精制(结晶、干燥)
2
路线一
路线二
清液－胞外产物
路线一A
本章的主要内容
◆压力 ◆温度 有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450750kg/m3时，温度由300C提高到500C，破碎率 约提高1.5倍。 ◆通过均浆器阀的次数
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图7 细胞浓度及压力大小对破碎率的影响
匀浆次数 40 图8 匀浆次数对破碎效果的影响
影响高压匀浆器细胞破碎因素
升高压力有利于破碎
减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几 乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。 但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p 超生一定值时，R增加但很慢。 在工业生产中，通常采用的压力为55－70Mpa。
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破碎方式 机械法 非机械法
固体剪切 作用 压榨 研磨
液体剪切 作用 高 压 匀 浆 超 声 破 碎
干燥 处理 酶溶法
溶胞 作用 化学法 物理法
珠磨法
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细胞破碎方法分类
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
30Βιβλιοθήκη 高压匀浆阀结构示意图出液口
进液口
高压匀浆器
阀杆 阀座 碰撞环
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高压匀浆器
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标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀 锥型阀 球型细胞破碎阀 高压匀浆器各种阀型设计
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大、中、小型高压匀浆器
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高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多：
WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi
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高压匀浆法适用的范围
是大规模细胞破碎的常用方法 ☆高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎； 料液细胞浓度可以很高，20%左右。 ☆不宜使用高压匀浆法的情况：