大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良

大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良中国医科大学附属第一医院内分泌科(沈阳110001)　吴志香*　王玉霞△　刘国良 摘　要　目的:探讨一种简单易行的大鼠胰岛细胞培养方法,获取尽可能多的高质量胰岛,并寻找进行体外实验研究的最佳时间和条件。

方法:运用胶原酶 原位灌注法分离胰腺,F ico ll400纯化胰岛细胞,双硫腙(D T Z)染色鉴定胰岛,运用倒置显微镜观察细胞生活状态,放免法检测胰岛素分泌考察胰岛功能。

结果:每只大鼠可分离438±27个胰岛 胰腺,细胞存活率为92.3±2.3%,GS IS实验中胰岛素释放指数S I为3.25±0.26。

结论:本分离纯化方法可获得数量多,质量高的胰岛细胞,为原代胰岛细胞的体外研究提供实验条件。

主题词　细胞培养　胰岛 生理学　胰岛 分离和提纯　大鼠An i m provem en t m ethod of pr i m ary culture of w istar ra t pancrea tic isletsD ep artm en t of Endocrino logy,the F irst A ffiliated Ho sp ital,Ch ina M edical U n iversity(Shenyang　110001)W u Zh ix iang　W ang Yux ia　L iu Guo liang ABSTRACT　O b jective:To study the effects of iso lating and cu ltu ring the rat pancreatic islets invitro.M ethods:A fter in traductal infu si on of8210m l co ld H ank’s balanced so lu ti on con tain ing1m g m l oftype co llagenase,pancreas w ere su rgically p rocu red and digested at37℃fo r15220m in,and stopped digesti on by co ld H ank’s so lu ti on w hen the em u lsi on appeared.T he islets w ere pu rified by discon tinou sF ico ll den sity gradien t(25%,23%,20.5%and11%)cen trifugati on,and the degree of pu rity w asdefined as dith izone stain ing.A n i m ati on of islets w as ob served and in su lin secreti on w as detected.R esu lts:438±27islets w ere p rocu red from one rat,and su rvival rate w as92.3±2.3%,Gluco se sti m u latedin su lin secreti on in vitro show ed the m ean value of in su lin in the low2gluco se m edium w as39.74±2.73mM,w h ile that of h igh2gluco se m edium w as128.94±8.72mM,the S I w as3.25±0.26.Conclu si on:T h is m ethod cou ld ob tain large quan tities and h igh quality islets,w h ich offered better experi m en tal conditi on s fo r cell study.KEY WORD S　Cell cu ltu re　Istets of langerham s physi o logy　Istets of langerham s iso lati on pu rificati on　R ats 近年来许多有关糖尿病方面的研究均利用体外培养的胰岛细胞株作为研究对象,然而源自肿瘤细胞系的细胞株毕竟在基因表达功能上与正常细胞有差别,因此,本研究采用了培养的大鼠原代胰岛细胞作为研究对象,以期更接近在体研究的结果,同时又可避免在体研究很难避免的混杂因素。

材料与方法1　实验材料　实验动物选择两月龄的健康W istar大鼠,体重250±23g,购自中国医科大学实验动物中心。

主要试剂有 型胶原酶(co llagenase typ e ,Sigm a);R PM I1640及*辽宁中医药大学附属第一医院△中国医科大学附属第四医院DM E M培养基(G I BCO)、胎牛血清(FB S, H yclone)、青霉素、链霉素(华北制药厂)、F ico ll 400(Pharm acia)、H ank’s液,40目不锈钢网, H EPES(Sigm a)、D T Z(Sigm a)、(OA,北京华美)。

胰岛素放免药盒(北京原子高科技核技术应用股份有限公司灵敏度:1.5m I U L;精密度:批内Cvv5%,批间Cvb10%)2　实验方法2.1胰岛细胞的分离纯化:胰腺的原位灌注:W istar大鼠禁食16h后,10%水合氯醛腹腔麻醉,常规消毒后经腹中线开腹。

暴露胆管,寻找胆管穿过胰腺进入十二指肠处,320丝线穿过(暂不结扎),充分暴露胰尾,在肝门胆管分叉处逆行胆管插管,少量推入含冷却的胶原酶(1m g m l)的H ank’s缓冲液(pH7.8,H EPES10mM),待胆汁排出后结扎丝线,切开大鼠腹主动脉和下腔静脉放血,缓慢注入胶原酶消化液8～10m l,使胰腺完全膨胀,完整切取胰腺置于含相同缓冲液的50m l硅化的离心管中冰浴。

胰岛的消化分离: 37℃水浴消化15～20m in,其间振荡离心管。

观察胰腺消化情况,当胰腺呈现“融化”,消化液变混浊,出现乳糜样时,即可迅速加入30m l冷却的H ank’s液并冰浴,终止消化。

消化的胰腺组织经振荡后低温离心(4℃,1000rpm×3m in),反复清洗2次,将沉淀物加入25m l H ank’s缓冲液再次振荡混匀,经40目不锈钢网过滤,将过滤后的细胞悬液再次离心(4℃,1000rpm×3m in),尽量去除上清液,若有未消化的大块组织重复上述消化步骤,离心后沉淀物为胰岛细胞和外分泌腺的混合物,冰浴备用。

胰岛的纯化:采用梯度密度离心,介质为F ico ll400和H ank’s缓冲液的混合物,浓度分别为25%、23%、20.5%、11%。

将胰岛悬液与25%的F ico ll2m l混合,而后逐层沿管壁缓慢加入23%、20.5%、11%F ico ll各2m l,形成4层梯度离心柱。

最后加入2m l H ank’s缓冲液。

离心(4℃,2400rpm×10m in),于23%、20.5%交界和20.5%、11%层交界间吸取胰岛细胞,经含10% FB S的H ank’s缓冲液清洗3次(4℃,1000rpm×3m in)。

纯化的胰岛细胞重悬于10%FB S的RM P I1640培养液中37℃,5%CO2培养箱中培养。

2.2　胰岛细胞的D T Z染色、计数:用无水乙醇和氨水配制D T Z(10m gD T Z∶3m l无水乙醇∶50Λl浓氨水,H ank’s缓冲液12m l稀释)原液备用,临用时用H ank’s液1∶100稀释,0.22Λm微孔滤膜过滤除菌,与纯化的胰岛细胞37℃水浴10m in,肉眼观察培养皿中出现细小红色颗粒,表明染色完成。

显微镜下观察并拍照,用50Λl定量加样器在胰岛悬液中重复取样3次,于倒置显微镜下分别镜检计算D T Z阳性细胞数,按以下公式计数[1]:胰岛数=3次阳性细胞总数÷3×20×样本量(m l)。

2.3　成活率的检测:取少许纯化的细胞经台盼蓝染色后,计算成活率:成活率=未染色细胞数 总细胞数×100%。

2.4　胰岛的生物活性鉴定:葡萄糖刺激下的胰岛素分泌实验(Gluco se sti m u lated in su lin secreti on,GS IS):24孔培养板每孔10个胰岛为一组,共6组,每孔加入预先配制的K reb s2 R ingerH EPES缓冲液(KRHB,含118mM N aC l, 4.4mM KC l,1.2mM M gC l2,1.5mM KH2PO4, 5mM N aHCO3,2.8mM Gluco se,10mM H EPES, 0.2%B SA,pH:7.4)1m l,置于5%CO2培养箱内37℃孵育2h,收集上清-20℃保存用于测定基础胰岛素水平,而后在6组胰岛中加入含16.7mM 葡萄糖的KRHB并在培养箱中孵育1h,收集上清采用放免法(R I A法)测定胰岛素水平,计算胰岛素释放指数(S I)[2]:S I=第3h(高糖环境)的胰岛素含量 第2h(低糖环境)的胰岛素含量。

2.5　胰岛的原代培养:24孔培养板每孔10个胰岛为一组,加入10%FB S的RM P I1640(含2mM L2谷氨酰胺,10mM H EPES)原代培养7d,每天经倒置相差显微镜下观察并收集培养上清测定胰岛素分泌水平。

3　统计学处理　计量资料以均数±标准差表示,所有数据均采用SPSS12.0统计软件包进行统计学分析。

结　果1　纯化胰岛的计数与鉴定　倒置显微镜下可见大量表面光滑、不透光的暗黄色胰岛细胞团,而外分泌腺碎片几乎见不到。

D T Z特异性的与胰岛Β细胞内胰岛素颗粒中的锌离子螯和使其着色,经D T Z染色10m in后,90%以上细胞团成猩红色或红色。

每只大鼠可分离438±27个胰岛 胰腺,细胞存活率在92.3±2.3%以上。

2　葡萄糖刺激下胰岛素分泌实验　在低糖溶液中胰岛素含量平均为39.74±2.73mM,高糖溶液中胰岛素分泌量128.94±8.72mM,S I为3. 25±0.26,说明胰岛功能良好。

3　胰岛细胞的生活观察　培养初期(1～3d)胰岛细胞生长良好,呈圆形或椭圆形,大多数细胞胞浆丰富,部分细胞核仁明显,其外包有完整被膜,这些细胞团即为胰岛,个别细胞分散为单个细胞,折光性减弱。