植物生理研究法(含试验方法、数据、论文)汇总教材

《植物生理学研究法》（设计实验方案、实验报告、课程论文）

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开课时间

生命科学学院《植物生理与分子生物学实验室》

《植物生理学研究法》

(课程实习)

盐胁迫下钙对春小麦的生理效应

目录

一、实验设计方案 2

二、实验预习报告4

实验一小麦抗逆性的鉴定（电导仪法） 4 实验二小麦SOD活性测定（NBT法） 5 实验三小麦POD活性测定（愈创木酚法） 7 实验四小麦组织中可溶性蛋白含量的测定（Folin--酚试剂法）8 实验五小麦叶绿素含量测定（分光光度法） 9 实验六小麦脯氨酸含量测定（茚三酮试剂显色法） 11 实验七小麦丙二醛含量测定(TBA法) 12 实验八小麦水势测定（水势仪法） 13 实验九小麦生物量测定 14

三、测定数据记录及计算15

四、课程论文 24

一、《植物生理学研究法》实验设计方案（10分）

二、生理指标预习报告

实验一小麦抗逆性的鉴定（电导仪法）

（一）原理：逆境（高温或低温）伤害原生质体结构，质膜透性增加，细胞内含物（无机盐）不同程度外渗，使得外液电导度增大（伤害越重，外渗物越多，电导度的增加越大），故可用电导仪法测定外液的电导度增加值而得知膜的伤害程度。

（二）植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）

（三）仪器设备：真空抽滤设备、电导仪、恒温水浴锅、试管架、普通具塞、10ml移液管、打孔器、镊子、滤纸等。

（四）试剂配制：无离子水

（五）实验步骤及注意事项：

1、清洗用具：实验所用的玻璃器皿用洗衣粉洗→自来水冲洗干净→无离子水润洗→倒置在试管架上备用

2、材料准备：从各种处理的叶片中选择大小，厚度相对一致发的叶片→分别用自来水冲洗除去表面的污物→再用无离子水清洗→滤纸轻轻吸干表面的水分

3、将正常及不同温度处理叶小片分别放入普通试管中→每个处理做两个重复管，每管放入15片小叶片中

4、叶片抽气，水分交换、测定电导度

注意事项：1、所用的各种处理叶片叶龄要一致

2、整个过程中，叶片接触的用具必须绝对洁净，也不要用手接触叶片

3、抽气要使叶片下沉才能与水分进行充分交换

4、CO2在水中的溶解度较高，测定电导时要防止CO2气源和呼出的CO2进入试管，以免影响

结果的准确性

（六）结果计算公式：

1、相对电导度=初电导值—空白电导值/终电导值—空白电导值

逆境叶片的相对电导度—正常叶片的相对电导度

2、伤害率（%）=

1—正常叶片的相对电导度

（七）参考文献：

1. 西北农业大学植物生理生化教研室编．植物生理学实验指导．西安：陕西科学技术出版社。1987

实验二小麦SOD活性测定（NBT法）

(一)原理：

SOD是普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活力单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所用的酶量。

(二) 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）

(三) 仪器设备：、高速台式离心机、分光光度计、微量进样器、荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）、试管

(四) 试剂配制：

1、提取介质：50mmol/L（pH7.8）磷酸缓冲液(内含1%不可溶聚乙烯咯烷酮)

2、反应介质：50mmol/L (内含77.1umol/硝基四唑蓝，，13.37mmol/L

蛋氨酸

3、80.2 umol/L核黄素溶液：用含有0.1mmol/LEDTA（pH7.8）磷酸缓冲液配4

4、SOD反应混合液：3.9ml反应介质+0.1ml80.2umol/L核黄素溶液

(五) 实验步骤及注意事项：

1、酶液的提取

将小麦叶片剪细→混合均匀→称0.5g于预冷的研钵中，加入2ml预冷的提取介质及少量的石英砂→研磨成匀浆→再加入4ml缓冲液，研磨均匀后将均浆液倒入聚乙烯离心管→低温（0—4度），4000g离心15min →上清液即为酶液，将上清液倒入离心管，用于SOD活性测定。

2、SOD活性测定

注意事项：

1.核黄素产生 O2- ，NBT 还原为蓝色的化合物都与光密切相关，因此，测定时要严格控制光照的强度和时间。

2.植物中的酚类对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP），尽可能除去植物组织中的酚类等次生代谢物质。

3.测定SOD活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。

(六) 结果计算公式：

VT-总酶液量（ml）

Vs-所用酶液量（50ul）

W-叶片鲜重（g）

Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度

AE-样品管吸光度

(七) 参考文献：

1. 李合生主编.植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000年07月第1版.

实验三小麦POD活性测定（愈创木酚法）

(一) 原理：过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在470nm 处测定其消光值，即可求出该酶的活性。

(二) 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）

(三) 仪器设备：分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器

(四) 试剂配制：

愈创木酚、

30%H2O2、

0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.8）、

0.1mol/L磷酸缓冲溶液（PH6.0，）

反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲溶液（PH6.0）50ml，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后，加入（待溶液冷却后再加入，否则引起分解）30%H2O2 19μl，混合均匀，保存于冰箱中。

(五) 实验步骤及注意事项：

1、粗酶液的提取：称取小麦叶0.5g，加磷酸缓冲液（7.8）5ml（分几次加入），于研钵中研磨成匀浆，以