农田杂草抗药性检测方法研究进展

对 19 类化学除草剂产生了抗药性［2］。抗药性杂草 已成为杂草治理和农业生产的严重威胁，由其引发 的严重经济和农业安全问题倍受全球关注。
随着杂草抗药性研究的不断深入，杂草抗药性 检测方法也不断创新。1970 年美国学者 Ryan 首次 公开报道了欧洲千里光（ Senecio vulgaris L． ） 对三氮 苯类除草剂西玛津和莠去津产生了抗性，提出了整 株植物测定方法，标志着杂草抗药性生物测定方法 的诞生。随着科学研究的深入和科学技术的创新， 杂草抗药性检测方法不断发展，出现了种子培养皿 测定法、叶片叶绿素荧光测定法、DNA 分析法等不 同水平的检测方法。为了便于研究人员或农技推广 人员在具体操作过程中根据快速、准确、经济等不同 的需要选择适宜的检测方法，本文通过检索文献，归 纳分析了目前比较常用的杂草抗药性检测方法。
董立尧等： 农田杂草抗药性检测方法研究进展
—3—
叶绿体光还原反应的测定包括希尔反应和荧光反 应。希尔反应是将叶绿体提取，放入希尔反应介质 中，有氧化剂存在 （ DCPIC） 时，在光照下会放出氧 气，同时将氧化剂还原。荧光反应是通过测定叶片 中荧光强度来鉴定光系统Ⅱ的功能。叶绿体荧光测 定须在黑暗中进行，蓝色闪光照射叶绿体悬浮液，叶 绿素发射荧光，用光电极管测定发射的荧光，并记录 在 X － Y 记录仪上［3，8］。此外，还可以通过测定叶绿 素含量的变化检测抗药性。1990 年 Joseph 等的研 究表明，野燕麦对苯氧羧酸类除草剂禾草灵的抗药 性生物型和敏感性生物型叶片内叶绿素 a 和叶绿素 b 的含量表现不同［16］。 1． 3． 3 光合速率测定法 由于抗光合作用抑制剂 生物型杂草在光合作用抑制剂处理后其光合速率变 化不大，而敏感生物型则受到严重抑制，因此，通过 测定光合速率的变化研究光合作用抑制剂对植物或 叶片的影响，可以检测鉴定杂草抗药性。主要方法 有红外线 CO2 测定法、氧电极测定法、pH 比色法、 气流测 定 法、改 进 的 干 重 测 定 法 和 半 叶 法 等［8］。 1992 年 Preston 等用百草枯处理敏感型大麦草，其 体内光合作用氧气释放被抑制了 66% ，而处理抗性 大麦草生物型后，除草剂对光合作用氧气释放的抑 制作用不明显［17］。 1． 3． 4 呼吸速率测定法 测定方法可参照光合速 率测定法［8］。 1． 3． 5 吸收和输导测定法 任何一种除草剂要发 挥其除草活性，必须条件是这种除草剂能被杂草吸 收并将足以发挥作用的剂量运输到作用部位。因 此，除草剂在敏感杂草和抗性杂草体内的吸收和输 导差异 可 用 于 检 测 杂 草 抗 药 性。Baerson 等［18］ 和 Lorraine － Colwill 等［19］通过比较抗草甘膦的瑞士黑 麦草和敏感的瑞士黑麦草生物型对草甘膦的吸收和 输导，发现草甘膦在二者体内的输导差异明显，敏感 型体内的草甘膦汇聚在植物的根，而抗性生物型体 内的草甘膦则汇聚在叶尖，他们认为草甘膦在植物 体内随蒸腾流快速向上移动后被泵入木质部，不能 泵到韧皮部汇聚到生长点，即输导方向的改变是产 生抗药性的原因。 1． 3． 6 酶活与代谢检测法 对于一些靶标已明确 的除草剂，可通过测定靶标酶或与靶标酶催化的反 应存在密切关联的酶的活性差异或某些代谢物质量 的差异 判 断 杂 草 抗 药 性。例 如，乙 酰 乳 酸 合 成 酶 （ ALS） 和乙酰辅酶 A 羧化酶（ ACCase） 抑制剂类除
收稿日期： 2011 － 03 － 15 基金项目： 国家自然科学基金（ 编号： 30971928） ； 江苏省农药学重点
实验室 2010 年度项目。 作者简介： 董立尧（ 1960—） ，男，博士，教授，从事除草剂毒理及抗药
性研究。Tel： （ 025） 84395672； E － mail： dly@ njau． edu． cn。
—2—
杂草科学 2011 年第 29 卷第 2 期
1 常用杂草抗药性检测方法
1． 1 整株水平测定方法 1． 1． 1 整株植物测定法 一般所使用的方法为 Ryan 法（ 1970） 。基本操作： 首先从长期单一使用某 除草剂并怀疑有抗药性的田块及未使用过该除草剂 的田块采集杂草种子，按小区大田播种或温室盆栽， 在播后芽前或苗后进行常规施药处理。药剂设置不 同剂量或浓度梯度，计算不同剂量下杂草的出苗率、 死亡率、鲜重抑制率等指标，与对照比较，以确定抗 药性水平［3］。2007 年杨彩宏等利用整株植物测定 法研究了江苏、安徽 11 个点油菜田日本看麦娘对高 效氟吡甲禾灵的抗药性，并用同样的方法进行了相 关药剂交互抗性的测定，发现句容点的日本看麦娘 对此药剂已产生明显抗性，并对芳氧基苯氧基丙酸 酯类其他药剂产生了不同程度的交互抗性［4］。 1． 1． 2 幼苗检测法 该法基本操作： 将怀疑对某种 除草剂有抗药性及敏感的杂草种子分别放在盛有水 的培养皿中培养，待根长至 3 ～ 5 mm 时，把带根种 子转移到封闭瓶中的滤纸上，将不同浓度药剂溶液 加到瓶中，在一定条件下培养，通过测量芽长或胚芽 鞘长度测定杂草抗药性水平［5］。2002 年 Retrum 等 采用幼苗检测法研究了大狗尾草对烯禾啶的抗药 性，发现该法可以有效地区分抗性和敏感种群［6］。 1． 2 器官或组织水平测定方法 1． 2． 1 培养皿种子检测法 这种方法是把催芽的 杂草种子放在加入药剂的琼脂平面或浸药的滤纸上 培养，通过测定发芽数、主根长、鲜重等指标诊断抗 药性水平。2007 年杨彩宏等在油菜田日本看麦娘 对高效氟吡甲禾灵抗药性研究中也使用了培养皿种 子检测方法，结果与整株植物测定法趋势一致，结果 相符［4］。2008 年丁君等采用培养皿种子检测法测 定了再生烟草种子对苯磺隆的抗性，以及对烟嘧磺 隆、噻吩磺隆、嘧硫草醚和莠去津的交互抗性，发现 经苯磺隆抗性选育的再生烟草抗性显著提高，并且 对这 4 种除草剂存在不同程度的交互抗性［7］。 1． 2． 2 分蘖检测法 该方法通常先将杂草种子种 植在粗沙和泥炭（ 体积比为 1 ∶ 3） 的混合物中，在温 室内培养至 3 叶期（ 第 3 叶未充分展开） 时，选取正 生长的分蘖，去根，然后放在一定的高浓度药剂溶液 中，一段时间后，通过比较第 3 叶坏死程度来评价杂 草的抗药性水平［8］。2000 年 Kim 等在研究稗草对 敌稗和精口恶唑禾草灵的抗药性时发现，根据分蘖的
1942 年 2，4 － 滴的发现揭开了近代化学除草的 新纪元。由于除草剂连续使用，很快导致了杂草抗 药性的产生［1］。1950 年在美国夏威夷的甘蔗田发 现了多年生杂草竹节花（ 又称铺散鸭跖草，Commelina diffusa） 对 2，4 － 滴产生了抗药性。从 20 世纪 80 年代开始，世界范围内大量应用除草剂，全球抗药性 杂草的发展几乎呈直线上升。根据 Heap 统计，截 至 2010 年 10 月，全球已有 194 种（ 114 种双子叶， 80 种单子叶） 杂草的 348 个生物型在各类农田系统
杂草科学 2011 年第 29 卷第 2 期 董立尧，吕 波，徐江艳，等． 农田杂草抗药性检测方法研究进展［J］． 杂草科学，2011，29（ 2） ： 1 － 4，9．
—1—
农田杂草抗药性检测方法研究进展
董立尧1，2 ，吕 波2 ，徐江艳1 ，李 俊1，2
（ 1． 南京农业大学植物保护学院 / 农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室，江苏南京 210095； 2． 南京农业大学理学院 / 江苏省农药学重点实验室，江苏南京 210095）
摘要： 杂草抗药性问题备受全球关注。文章通过检索国内外已报道的有关杂草抗药性的文献，对实验室常 用的杂草抗药性检测方法进行了概述，并将杂草抗药性检测方法归纳为整株水平、器官或组织水平、细胞或细胞 器水平以及分子水平，并对这些方法进行了简要分析，可为研究人员或农技推广人员根据快速、准确、经济等不同 需要提供相应的杂草抗药性检测方法。
（ 1． College of Plant Protection，Nanjing Agricultural University / Key Laboratory of Monitoring and Management of Crop Diseases and Pest Insects，Ministry of Agriculture，Nanjing 210095，China； 2． College of Science，Nanjing Agricultural
坏死程度可以快速检测抗性和敏感杂草生物型［9］。 1． 2． 3 花粉粒萌发法 按分蘖检测法种植杂草，剪 取 刚 从 颖 片 抽 出 的 具 花 药 的 穗，把 花 粉 震 落 到 0． 25% 含一系列浓度除草剂的固体琼脂培养基上。 在一定条件下培养一段时间后，用显微镜（ 200 倍） 观察花粉萌发情况。萌发花粉计数以花粉管长度至 少达半个花粉粒长度为准。在时间和剂量的最适选 择下，根据萌发花粉数的多少来判定抗性和敏感性 生物型［10 － 12］。2007 年 Burke 等用花粉粒萌发法研 究了假高粱对 ACC 酶抑制剂类除草剂的抗药性，发 现用 烯 草 酮 处 理 6 d 后，抗 性 和 敏 感 生 物 型 在 500 nm处的吸光度存在差异［13］。 1． 2． 4 叶圆片浸渍技术测定法 首先将叶圆片浸 渍在含有一定浓度除草剂的磷酸缓冲溶液的试管 中，抽真空，待叶圆块下沉至试管底部后，解除真空， 加入少量碳酸氢钠溶液，照光。对除草剂不敏感或 产生抗药性的生物型，光合作用未被抑制，组织间产 生足够多的 O2 ，叶圆片上浮； 而对除草剂敏感的生 物型，光合作用受抑制，不能产生足够多的 O2 ，圆片 仍沉在试管底部。根据一定时间内上浮的叶圆片数 或上浮需要的时间来比较光合作用的强弱程度，以 此来确定对除草剂敏感或抗性生物型［12，14］。 1． 3 细胞或细胞器水平测定方法 1． 3． 1 叶片叶绿素荧光测定法 叶绿素荧光测定 法机理是： 在黑暗的条件下用闪光灯照射光合作用 抑制剂类除草剂处理过的叶片时，光合作用抑制剂 阻断电子由 QA 到 QB 的传递，光系统Ⅱ的还原端被 中断，捕获的光能不能往下传递，叶绿素 a 处于激发 态，以荧光的方式释放能量，通过测定叶绿素 a 发射 荧光的强弱检测抗药性，抗性植株叶片表面的荧光 强度小，敏 感 性 生 物 型 叶 片 表 面 的 荧 光 强 度 大，所 以，根据叶片表面的荧光强度，可区分抗药性生物型 和敏感生物型［8］。1992 年 Lehoczki 等用相同浓度 的百草枯处理抗性和敏感性小蓬草生物型后，二者 均快速表现出典型的百草枯药害症状，CO2 固定和 叶绿素荧光受到抑制、氧释放减少、已烷生成受到刺 激，不同的是百草枯对敏感生物型的抑制不可逆转， 而抗药性生物型植株在光照中得到恢复，而且光照 强度的增加对叶绿素荧光的恢复作用非常明显［15］。 1． 3． 2 离体叶绿体测定方法 离体叶绿体测定法 的研究证实了杂草抗药性是由于改变了类囊体膜上 的光系统Ⅱ成分，从 而 改 变 了 光 系 统 Ⅱ 还 原 端 的 电 子传递反应。叶绿体的提取采用的是酶解法，离体
University / Jiangsu Key Laboratory of Pesticide Science，Nanjing 210095，China）
Abstract： The weed herbicide － resistance problem has become a global concern recently． In order to provide a rapid，accurate and economic detection methods for agricultural research and extension workers，documents concerning detection methods of weed herbicide － resistance reported at home and abroad were outlined and analyzed according to its research level on whole plant，organ or tissue，cells or organelles and molecular base respectively． Key words： weed； herbicide － resistance； detection
关键词： 杂草； 抗药性； 检测 中图分类号： S451 文献标志码： A 文章编号： 1003 － 935X（2011）02 － 0001 － 04
Hale Waihona Puke Baidu
Research Advance on Detection Methods for Weed Herbicide-resistance
DONG Li-yao1，2 ，Lü Bo2 ，XU Jiang-yan1 ，LI Jun1，2