黄连HPLC数字化指纹图谱研究及7种生物碱含量测定_刘芳
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分别精密称取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药 根碱、黄连碱、表小檗碱、groenlandicine、非洲防己碱 适量于 10 mL 量瓶中，加甲醇-盐酸（100∶ 1） 溶解并 稀 释 至 刻 度，其 质 量 浓 度 分 别 为 1. 772，0. 193， 0. 384，0. 300，0. 300，0. 261，0. 234 g · L － 1 ，作 为 对 照品储备液。 2. 3 供试品溶液的制备
［摘要］ 该文建立了峨眉地区道地药材黄连的 HPLC 数字化指纹图谱，并将其在全国不同主产区的黄连测定中进行了 应用，同时测定黄连中 7 种季胺型生物碱的含量，为科学评价与有效控制黄连质量提供依据。采用 Diamonsil C18 色谱柱（4. 6 mm × 250 mm，5 μm） ，流动相乙腈-0. 025mol·L － 1 KH2 PO4 溶液（ 磷酸调 pH 3. 0） （40∶ 60） ，内含 SDS 1. 7 g·L － 1 ，流速 1. 2 mL· min －1 ，检测波长 345 nm，柱温 40 ℃ 。运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（ 国家药典委员会） 进行分析，10 批次峨眉产黄 连样品得到的指纹图谱相似度均大于 0. 99，标定共有峰 10 个，并对其中 8 个色谱峰进行了归属。全国 5 个黄连主产区样品与 峨眉产黄连进行相似度分析比较，整体相似度高。同时对黄连药材中 groenlandicine，非洲防己碱，药根碱，表小檗碱，黄连碱， 巴马汀，小檗碱 7 种主要生物碱进行了含量测定。该方法灵敏度高、专属性强，HPLC 指纹图谱结合生物碱含量测定能全面反 应其内在质量，为黄连的质量控制提供科学依据。
［收稿日期］ 2013-05-03 ［基 金 项 目］ 科 技 部 国 家 科 技 支 撑 计 划 重 点 项 目 （2007BA140B05） ； 中 国 博 士 后 科 学 基 金 第 6 批 特 别 资 助 项 目 （2013T60863） ［通信 作 者］ * 张 浩，教 授，博 士 生 导 师，Tel： （ 028 ） 85503037， E-mail：zhanghhx@ vip. sina. com
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2. 4. 3 重复性试验 取同一供试品（ S1） 5 份，按 2. 3 项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶 液 5 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以小檗 碱色谱峰为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的相 对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰的相对保 留时间的 ＲSD ＜ 0. 4% ，各共有峰的相对峰面积的 ＲSD ＜ 2. 0% ，表明该方法重复性良好。 2. 4. 4 四川峨眉山地区产黄连药材的相似度评价
第 38 卷第 21 期 2013 年 11 月
Vol. 38，Issue 21 November，2013
黄连 HPLC 数字化指纹图谱研究及 7 种生物碱含量测定
刘芳1 ，张浩2* ，青琳森3
（1． 长治医学院，山西 长治 046000； 2． 四川大学 华西药学院，四川 成都 610041； 3. 中国科学院 成都生物研究所，四川 成都 610041）
2 方法与结果 2. 1 色谱条件
流动相为乙腈-0. 025 mol·L － 1 KH2 PO4 溶液（ 磷 酸调 pH 3. 0） （40∶ 60） ，内含十二烷基硫酸钠（ SDS） 1. 7 g · L － 1 ； 检 测 波 长 345 nm ； 流 速 1. 2 mL · min － 1 ；柱温 40 ℃ ；进样量 5 μL。 2. 2 对照品溶液的制备
表 2 10 批次黄连药材共有峰的相对保留时间 Table 2 Ｒelative retention time of common peaks in fingerpringts of Coptidis Ｒhizoma samples
共有峰相对保留时间 样品
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 对照药材 0. 15 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00
物碱的含量。并且为了准确反应与评价生物碱类成 分在黄连内的形成、积累等与环境影响因素的关系， 本文将所建立的方法在全国不同主产区进行了应 用，结果表明整体相似度均在 0. 99 以上，但在生物 碱的含量上存在较大差异。 1 材料
Shimadzu LC-10Atvp 高 效 液 相 色 谱 仪 （ LC10Atvp 泵、SPD-10Avp 紫外检测器、CTO-01Asvp 柱 温 箱、SCL-10Avp 系 统 控 制 器、Class-vp 色 谱 工 作 站） ； Diamonsil C18 色 谱 柱 （ 4. 6 mm × 250 mm，5 μm） ；中药色谱指纹图谱相似度评价系统（ 中国药 典委员会 2004A） ； BP211D 1 /10 万电子天平（ 德国 Sartorius 公司） ； KQ3200 超声波清洗器（ 昆山超声 仪器有限公司，工作频率 40 kHz，超声功率 120 W） ； pH 计（ PHS-3C 型，上海雷磁） 。
乙腈（ 美国 Fisher 公司） 色谱纯，水为超纯水， 其他试剂均为分析纯。
黄连对照药材、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、、表小檗碱、非洲防己碱、groenlandicine、木兰花 碱由作者分离、纯化制备，并经红外、紫外、核磁、质 谱鉴定，纯度均达 99% （ 相对纯度） 以上。
No.
采集地点
1 四川峨眉山市龙池镇高万村 2 四川峨眉山市龙池镇陶渊村 3 四川峨眉山市龙池镇金川村 4 四川峨眉山市龙池镇富友村 5 四川峨眉山市沙溪乡林坝村 6 四川峨眉山市高庙镇黄茅村 7 四川峨眉山市高桥镇张沟村 8 四川峨眉山市龙门乡杨林村
No.
采集地点
9 四川峨眉山市川主乡荷叶村 10 四川峨眉山市大为镇中山村 11 四川彭州白鹿镇 12 四川峨眉山市洪雅高庙 13 湖北利川 14 四川巫山 15 重庆石柱
按 2. 2 项下方法制备对照品溶液，按选定色谱条 件进行测定。所得混合对照品色谱图见图 1。按 2. 3 项下方法制备供试品溶液，分别取黄连对照药 材和 10 批次四川峨眉地区黄连药材制备供试品溶 液，按选定色谱条件进行测定。所得色谱图见图 2。
2. 4. 5 指纹图谱数据处理 将对照药材与 10 批次 黄连药材样品测定数据导入《中药色谱指纹图谱相 似度评价系统 A 版》，经过色谱峰自动匹配，进行色 谱峰整体相似性评价。通过比较，确定共有峰为 10 个，并对其中 8 个色谱峰进行了归属。由于第 1 号 色谱峰为小檗碱，是黄连的主成分，其峰面积平均占
取黄连根茎细粉（ 过 40 目筛，干燥至恒重） 约 0. 1 g，精 密 称 定，置 具 塞 锥 形 瓶 中，加 甲 醇-盐 酸 （100∶ 1） 溶液 50 mL，称定总质量，冷浸过夜，超声提 取 60 min，补足失重，摇匀，0. 45 μm 微孔滤膜过滤， 取续滤液备用。 2. 4 黄连药材 HPLC 指纹图谱的建立 2. 4. 1 精密度试验 取同一供试品溶液（ S1） 连续 进样 5 次，记录色谱图，以小檗碱色谱峰为参照峰， 计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰 面积，结 果 各 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 的 ＲSD ＜ 0. 3% ，各共有峰的相对峰面积的 ＲSD ＜ 1. 5% ，表明 仪器精密度良好。 2. 4. 2 稳定性试验 取同一供试品溶液（ S1） 分别 在 0，2，4，6，8，12，24 h 进行测定，记录色谱图，以小 檗碱色谱峰为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的 相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰的相对 保留时间的 ＲSD ＜ 0. 5% ，各共有峰的相对峰面积的 ＲSD ＜ 1. 8% ，表明该供试品溶液在 24 h 内稳定。
1 0. 16 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 2 0. 16 0. 22 0. 39 0. 49 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 3 0. 15 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 4 0. 16 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 5 0. 15 0. 22 0. 40 0. 49 0. 55 0. 58 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 6 0. 15 0. 22 0. 39 0. 49 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 7 0. 15 0. 22 0. 39 0. 49 0. 55 0. 58 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 8 0. 15 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 9 0. 16 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 58 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 10 0. 15 0. 21 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 60 0. 69 0. 87 1. 00
［关键词］ 黄连；HPLC；指纹图谱；含量测定
黄连为毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franch. 的干燥根茎，常用中药材，主产于四川峨眉、洪雅、彭 州，重庆石 柱、巫 山，湖 北 利 川 等 地［1］，其 中 峨 眉 历 来是黄连的道地主产区，栽培历史悠久，在历代本草 《名医别录》、《唐本草》、《本 草 纲 目》等 中 均 有 记 载［2］。黄连 中 所 含 的 生 物 碱 主 要 有 小 檗 碱、巴 马 汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱等［3-4］季胺型生物碱。 小檗碱及其衍生物除了具有抗炎抗菌［5-6］的作用外， 还在治疗 肿 瘤［7-10］、糖 尿 病［11-14］、心 血 管 疾 病［15-16］、 高血 脂［17］、脑 缺 血 性 损 伤［18］ 等 多 方 面 具 有 药 理 作 用。中药的化学成分复杂，在质量控制中采用单一 成分或某几个成分难以反映中药材的整体特征，建 立简便可行的指纹图谱方法，确定其特征的共有峰 图谱，是从整体上控制其质量已成为普遍运用的方 法［19-21］。本文采用 HPLC，选择了四川峨眉地区具 代表性的 10 批次黄连药材样品进行了分析测定，以 生物碱类成分作为评价指标，建立了峨眉山地区黄 连药材的生物碱指纹图谱，确定了 10 个共有峰，其 分离度和重现性均较好，同时测定了 7 种季胺型生
黄连药材由作者采集及四川大学华西药学院标 本室提供，经四川大学华西药学院生药教研室张浩 教授鉴定为黄连 C. chinensis 的干燥根茎，见表 1。
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第 38 卷第 21 期 2013 年 11 月
Vol. 38，Issue 21 November，2013
表 1 黄连药材样品 Table 1 Samples of Coptidis Ｒhizoma
第 38 卷第 21 期 2013 年 11 月
Vol. 38，Issue 21 November，2013
总峰面积的 50% ，比较稳定，且与相邻峰分离度较 好，故将其指定为参照峰。其余 7 个色谱峰 2 号为 巴马汀，3 号为黄连碱，4 号为表小檗碱，5 号为药根 碱，6 号为非洲防己碱，8 号为 groenlandicine，9 号为 木兰花碱。黄连对照药材与 10 批次黄连药材样品 色谱图的共有峰相对保留时间见表 2，相对峰面积 见表 3。
表 3 10 批次黄连药材共有峰的相对峰面积 Table 3 Ｒelative areas of common peaks in fingerpringts of Coptidis Ｒhizoma samples
［摘要］ 该文建立了峨眉地区道地药材黄连的 HPLC 数字化指纹图谱，并将其在全国不同主产区的黄连测定中进行了 应用，同时测定黄连中 7 种季胺型生物碱的含量，为科学评价与有效控制黄连质量提供依据。采用 Diamonsil C18 色谱柱（4. 6 mm × 250 mm，5 μm） ，流动相乙腈-0. 025mol·L － 1 KH2 PO4 溶液（ 磷酸调 pH 3. 0） （40∶ 60） ，内含 SDS 1. 7 g·L － 1 ，流速 1. 2 mL· min －1 ，检测波长 345 nm，柱温 40 ℃ 。运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（ 国家药典委员会） 进行分析，10 批次峨眉产黄 连样品得到的指纹图谱相似度均大于 0. 99，标定共有峰 10 个，并对其中 8 个色谱峰进行了归属。全国 5 个黄连主产区样品与 峨眉产黄连进行相似度分析比较，整体相似度高。同时对黄连药材中 groenlandicine，非洲防己碱，药根碱，表小檗碱，黄连碱， 巴马汀，小檗碱 7 种主要生物碱进行了含量测定。该方法灵敏度高、专属性强，HPLC 指纹图谱结合生物碱含量测定能全面反 应其内在质量，为黄连的质量控制提供科学依据。
［收稿日期］ 2013-05-03 ［基 金 项 目］ 科 技 部 国 家 科 技 支 撑 计 划 重 点 项 目 （2007BA140B05） ； 中 国 博 士 后 科 学 基 金 第 6 批 特 别 资 助 项 目 （2013T60863） ［通信 作 者］ * 张 浩，教 授，博 士 生 导 师，Tel： （ 028 ） 85503037， E-mail：zhanghhx@ vip. sina. com
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2. 4. 3 重复性试验 取同一供试品（ S1） 5 份，按 2. 3 项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶 液 5 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以小檗 碱色谱峰为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的相 对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰的相对保 留时间的 ＲSD ＜ 0. 4% ，各共有峰的相对峰面积的 ＲSD ＜ 2. 0% ，表明该方法重复性良好。 2. 4. 4 四川峨眉山地区产黄连药材的相似度评价
第 38 卷第 21 期 2013 年 11 月
Vol. 38，Issue 21 November，2013
黄连 HPLC 数字化指纹图谱研究及 7 种生物碱含量测定
刘芳1 ，张浩2* ，青琳森3
（1． 长治医学院，山西 长治 046000； 2． 四川大学 华西药学院，四川 成都 610041； 3. 中国科学院 成都生物研究所，四川 成都 610041）
2 方法与结果 2. 1 色谱条件
流动相为乙腈-0. 025 mol·L － 1 KH2 PO4 溶液（ 磷 酸调 pH 3. 0） （40∶ 60） ，内含十二烷基硫酸钠（ SDS） 1. 7 g · L － 1 ； 检 测 波 长 345 nm ； 流 速 1. 2 mL · min － 1 ；柱温 40 ℃ ；进样量 5 μL。 2. 2 对照品溶液的制备
表 2 10 批次黄连药材共有峰的相对保留时间 Table 2 Ｒelative retention time of common peaks in fingerpringts of Coptidis Ｒhizoma samples
共有峰相对保留时间 样品
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 对照药材 0. 15 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00
物碱的含量。并且为了准确反应与评价生物碱类成 分在黄连内的形成、积累等与环境影响因素的关系， 本文将所建立的方法在全国不同主产区进行了应 用，结果表明整体相似度均在 0. 99 以上，但在生物 碱的含量上存在较大差异。 1 材料
Shimadzu LC-10Atvp 高 效 液 相 色 谱 仪 （ LC10Atvp 泵、SPD-10Avp 紫外检测器、CTO-01Asvp 柱 温 箱、SCL-10Avp 系 统 控 制 器、Class-vp 色 谱 工 作 站） ； Diamonsil C18 色 谱 柱 （ 4. 6 mm × 250 mm，5 μm） ；中药色谱指纹图谱相似度评价系统（ 中国药 典委员会 2004A） ； BP211D 1 /10 万电子天平（ 德国 Sartorius 公司） ； KQ3200 超声波清洗器（ 昆山超声 仪器有限公司，工作频率 40 kHz，超声功率 120 W） ； pH 计（ PHS-3C 型，上海雷磁） 。
乙腈（ 美国 Fisher 公司） 色谱纯，水为超纯水， 其他试剂均为分析纯。
黄连对照药材、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、、表小檗碱、非洲防己碱、groenlandicine、木兰花 碱由作者分离、纯化制备，并经红外、紫外、核磁、质 谱鉴定，纯度均达 99% （ 相对纯度） 以上。
No.
采集地点
1 四川峨眉山市龙池镇高万村 2 四川峨眉山市龙池镇陶渊村 3 四川峨眉山市龙池镇金川村 4 四川峨眉山市龙池镇富友村 5 四川峨眉山市沙溪乡林坝村 6 四川峨眉山市高庙镇黄茅村 7 四川峨眉山市高桥镇张沟村 8 四川峨眉山市龙门乡杨林村
No.
采集地点
9 四川峨眉山市川主乡荷叶村 10 四川峨眉山市大为镇中山村 11 四川彭州白鹿镇 12 四川峨眉山市洪雅高庙 13 湖北利川 14 四川巫山 15 重庆石柱
按 2. 2 项下方法制备对照品溶液，按选定色谱条 件进行测定。所得混合对照品色谱图见图 1。按 2. 3 项下方法制备供试品溶液，分别取黄连对照药 材和 10 批次四川峨眉地区黄连药材制备供试品溶 液，按选定色谱条件进行测定。所得色谱图见图 2。
2. 4. 5 指纹图谱数据处理 将对照药材与 10 批次 黄连药材样品测定数据导入《中药色谱指纹图谱相 似度评价系统 A 版》，经过色谱峰自动匹配，进行色 谱峰整体相似性评价。通过比较，确定共有峰为 10 个，并对其中 8 个色谱峰进行了归属。由于第 1 号 色谱峰为小檗碱，是黄连的主成分，其峰面积平均占
取黄连根茎细粉（ 过 40 目筛，干燥至恒重） 约 0. 1 g，精 密 称 定，置 具 塞 锥 形 瓶 中，加 甲 醇-盐 酸 （100∶ 1） 溶液 50 mL，称定总质量，冷浸过夜，超声提 取 60 min，补足失重，摇匀，0. 45 μm 微孔滤膜过滤， 取续滤液备用。 2. 4 黄连药材 HPLC 指纹图谱的建立 2. 4. 1 精密度试验 取同一供试品溶液（ S1） 连续 进样 5 次，记录色谱图，以小檗碱色谱峰为参照峰， 计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰 面积，结 果 各 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 的 ＲSD ＜ 0. 3% ，各共有峰的相对峰面积的 ＲSD ＜ 1. 5% ，表明 仪器精密度良好。 2. 4. 2 稳定性试验 取同一供试品溶液（ S1） 分别 在 0，2，4，6，8，12，24 h 进行测定，记录色谱图，以小 檗碱色谱峰为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的 相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰的相对 保留时间的 ＲSD ＜ 0. 5% ，各共有峰的相对峰面积的 ＲSD ＜ 1. 8% ，表明该供试品溶液在 24 h 内稳定。
1 0. 16 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 2 0. 16 0. 22 0. 39 0. 49 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 3 0. 15 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 4 0. 16 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 5 0. 15 0. 22 0. 40 0. 49 0. 55 0. 58 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 6 0. 15 0. 22 0. 39 0. 49 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 7 0. 15 0. 22 0. 39 0. 49 0. 55 0. 58 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 8 0. 15 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 9 0. 16 0. 22 0. 39 0. 48 0. 55 0. 58 0. 61 0. 69 0. 88 1. 00 10 0. 15 0. 21 0. 39 0. 48 0. 55 0. 57 0. 60 0. 69 0. 87 1. 00
［关键词］ 黄连；HPLC；指纹图谱；含量测定
黄连为毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franch. 的干燥根茎，常用中药材，主产于四川峨眉、洪雅、彭 州，重庆石 柱、巫 山，湖 北 利 川 等 地［1］，其 中 峨 眉 历 来是黄连的道地主产区，栽培历史悠久，在历代本草 《名医别录》、《唐本草》、《本 草 纲 目》等 中 均 有 记 载［2］。黄连 中 所 含 的 生 物 碱 主 要 有 小 檗 碱、巴 马 汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱等［3-4］季胺型生物碱。 小檗碱及其衍生物除了具有抗炎抗菌［5-6］的作用外， 还在治疗 肿 瘤［7-10］、糖 尿 病［11-14］、心 血 管 疾 病［15-16］、 高血 脂［17］、脑 缺 血 性 损 伤［18］ 等 多 方 面 具 有 药 理 作 用。中药的化学成分复杂，在质量控制中采用单一 成分或某几个成分难以反映中药材的整体特征，建 立简便可行的指纹图谱方法，确定其特征的共有峰 图谱，是从整体上控制其质量已成为普遍运用的方 法［19-21］。本文采用 HPLC，选择了四川峨眉地区具 代表性的 10 批次黄连药材样品进行了分析测定，以 生物碱类成分作为评价指标，建立了峨眉山地区黄 连药材的生物碱指纹图谱，确定了 10 个共有峰，其 分离度和重现性均较好，同时测定了 7 种季胺型生
黄连药材由作者采集及四川大学华西药学院标 本室提供，经四川大学华西药学院生药教研室张浩 教授鉴定为黄连 C. chinensis 的干燥根茎，见表 1。
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表 1 黄连药材样品 Table 1 Samples of Coptidis Ｒhizoma
第 38 卷第 21 期 2013 年 11 月
Vol. 38，Issue 21 November，2013
总峰面积的 50% ，比较稳定，且与相邻峰分离度较 好，故将其指定为参照峰。其余 7 个色谱峰 2 号为 巴马汀，3 号为黄连碱，4 号为表小檗碱，5 号为药根 碱，6 号为非洲防己碱，8 号为 groenlandicine，9 号为 木兰花碱。黄连对照药材与 10 批次黄连药材样品 色谱图的共有峰相对保留时间见表 2，相对峰面积 见表 3。
表 3 10 批次黄连药材共有峰的相对峰面积 Table 3 Ｒelative areas of common peaks in fingerpringts of Coptidis Ｒhizoma samples