肺炎链球菌的分离和鉴定
肺炎链球菌鉴定流程
肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌（肺炎链球菌属）是导致人类社区获得性肺炎（CAP）最常见的病原体之一。
准确鉴定肺炎链球菌对于指导适当的抗菌治疗和监测抗菌剂耐药性的出现至关重要。
该鉴定过程涉及多个步骤，包括：革兰氏染色：革兰氏染色是鉴定肺炎链球菌的第一步，因为它是一种革兰氏阳性球菌，通常成链状排列。
形态学检查：通过显微镜检查革兰氏阳性标本，可以观察到肺炎链球菌的典型的链球菌形态。
链条的长度和排列模式可能因菌株而异。
荚膜染色：肺炎链球菌具有多糖荚膜，可通过荚膜染色技术（例如，奎肯斯泰特染色）显现出来。
荚膜的存在是肺炎链球菌鉴定的关键特征。
血清学检测：血清学检测，如奎肯斯泰特试验，可用于确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
肺炎链球菌的荚膜由不同的血清型组成，每种血清型与不同的抗原性决定簇（PSA）相关。
生物化学测试：多种生物化学测试可用于确认肺炎链球菌的鉴别，包括：溶血反应：肺炎链球菌通常在绵羊红细胞琼脂平板上显示β溶血反应。
胆盐耐受性：肺炎链球菌可耐受高浓度的胆汁盐，这是区分其与其他链球菌的重要特征。
尿素酶活性：肺炎链球菌通常产生尿素酶，可水解尿素。
分子诊断：分子诊断方法，如聚合酶链反应（PCR），可用于快速鉴定肺炎链球菌，尤其是在培养困难的情况下。
PCR检测靶向肺炎链球菌基因，如lytA或cpsA。
抗菌剂敏感性测试：进行抗菌剂敏感性测试对于指导针对肺炎链球菌的适当治疗至关重要。
通常使用琼脂稀释法或扩散法来确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
鉴定肺炎链球菌的流程通常涉及以下步骤：1. 革兰氏染色：确定标本中是否存在革兰氏阳性球菌。
2. 形态学检查：观察革兰氏阳性球菌的链球菌形态。
3. 荚膜染色：显示肺炎链球菌荚膜的存在。
4. 血清学检测：确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
5. 生物化学测试：进行溶血反应、胆盐耐受性和尿素酶活性测试以确认鉴别。
6. 分子诊断：如有必要，进行PCR检测以快速鉴定肺炎链球菌。
7. 抗菌剂敏感性测试：确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
肺炎链球菌的鉴定方法
肺炎链球菌的鉴定方法来源：检验医学网细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。
一、生物学性状肺炎链球菌革兰染色呈阳性。
球形或矛头状，成双排列，少呈链状。
在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。
2. 培养特点（1）培养基肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（ 5％马血或羊血）。
琼脂浓度可适当下降至1％～1.2％，有利于肺炎链球菌的生长。
1）标本处理及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。
因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。
2）选择性分离培养基培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。
3)培养环境5～10％CO2、35℃培养24～48h。
（3）肺炎链球菌的菌落形态在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。
3.抗原结构（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。
（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。
（3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。
二、肺炎链球菌鉴定肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。
其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。
必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。
在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。
必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。
1. 溶血性检查肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。
2. Optochin(OP)敏感试验optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。
肺炎链球菌的分离和鉴定
血琼脂培养基
将样本接种在含有血液和琼脂的培养基上， 适宜的温度下培养，观察是否有肺炎链球菌 的生长。
分离步骤
增菌
将采集的样本在适宜的温度和环境下进行增菌培 养，使细菌增殖。
纯化
对单个菌落进行纯化培养，确保分离得到的菌株 为纯培养物。
ABCD
分离
将增菌后的样本划线接种在选择性培养基上，使 肺炎链球菌在培养基上形成单个菌落。
需要加强临床医生和微生物实 验室之间的合作，提高肺炎链 球菌的早期诊断和治疗效果。
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鉴定
通过形态学观察、生化试验和分子生物学方法对 纯化的菌株进行鉴定，确认为肺炎链球菌。
04
鉴定方法
形态学鉴定
总结词
通过观察细菌的形态、染色特性及排列方式，初步判断是否为肺炎链球菌。
详细描述
在显微镜下观察细菌的形态，肺炎链球菌通常呈双排列或四排列，呈革兰氏阳性染色。
生化鉴定
要点一
总结词
通过细菌的生化反应来进一步确定是否为肺炎链球菌。
鉴定准确性
分子生物学鉴定和血清型鉴定的 结果一致，表明实验鉴定方法的 准确性较高。
临床意义
了解分离菌株的血清型和抗生素 敏感性，对于指导临床合理用药、 控制感染和预防疾病传播具有重 要意义。
06
结论与展望
研究结论
01
肺炎链球菌是引起肺炎的重要病原菌，具有多重耐药性，给临床治疗 带来挑战。
02
分离和鉴定肺炎链球菌的方法不断改进，包括传统的培养法、免疫学 方法和分子生物学方法等。
详细描述
肺炎链球菌是一种需氧或兼性厌氧的细菌，在培养基中生长迅速。在血琼脂平板上，肺 炎链球菌形成中等大小、灰白色、半透明、圆形、凸起的菌落，表面光滑，周围有明显
肺炎链球菌鉴定流程
肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌是一种革兰阳性菌，可引起肺炎、脑膜炎和败血症等严重感染。
其识别需要准确可靠的实验室检测。
以下是肺炎链球菌鉴定的综合流程：显微镜检查：将疑似标本制成涂片，革兰染色。
在显微镜下观察革兰阳性球菌，通常呈卵圆形或兰氏链球菌排列。
培养和形态学特征：疑似标本接种于适当的培养基上，如血琼脂平板。
培养 24-48 小时，观察菌落形态、溶血性（α、β、γ）。
α溶血菌落周围出现绿色透明晕环。
生化反应：进行生化反应，如 katalase 试验、optochin 敏感性试验。
Katalase 阳性菌产生气泡，optochin 敏感菌在含 optochin 的培养基上生长受抑制。
抗原检测：利用免疫学方法检测肺炎链球菌荚膜多糖 (CPS) 抗原。
常见的技术包括乳胶凝集试验和酶联免疫吸附测定 (ELISA)。
不同血清型荚膜多糖抗原可用于区分不同的肺炎链球菌株。
分子检测：利用聚合酶链反应 (PCR) 等分子技术检测肺炎链球菌特异性基因。
PCR 可快速灵敏地检测出肺炎链球菌，即使在标本量少或菌载量低的情况下。
血清分型：根据肺炎链球菌荚膜多糖抗原的不同，将其分为 90 多种血清型。
血清分型对于流行病学调查和疫苗接种策略至关重要。
耐药性检测：检测肺炎链球菌对常用抗生素的耐药性。
常见的抗生素包括青霉素、头孢菌素和宏观内酯类。
耐药性检测结果指导临床治疗方案的选择。
综合解读：结合上述检测结果，综合解读以确定疑似标本中是否含有肺炎链球菌。
准确的鉴定有助于指导患者的管理和控制肺炎链球菌感染的传播。
优势和局限性：肺炎链球菌的鉴定流程提供了准确可靠的结果。
综合方法提高了检测的灵敏性和特异性。
分子检测技术在标本量少或难以培养的情况下尤为有用。
培养时间和抗生素耐药性检测结果的等待时间可能是局限性。
肺炎链球菌的分离和鉴定
（1）试管法:
取新鲜培养物分装于两支试管内（每支 1ml），其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液 0.1ml或纯牛胆汁0.2ml，另一支加入无菌盐水 两滴（对照），15min后，阳性者细菌被溶解， 试管内液体呈透明状，阴性者无变化。
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（2）平皿法:
加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁 于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔 被溶解，阴性者无变化。试验应有已知肺炎链 球菌作阳性对照。
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3.抗原结构
（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在 于肺炎链球菌的细胞壁。
（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜 中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可 将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其 中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。
（3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋 白质，无特异性。
3.以optochin 试验和胆汁溶菌试验将肺炎链球菌 与其他－溶血链球菌相区别；
4. 血清学鉴定特异性高； 5. 要注意对PRP和MDR的检测。
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4.乳胶凝集试验
结果准确、快速、特异性高。
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5. 荚膜肿胀试验
取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少
量美蓝液混合后加盖片，室温10~20min后，用
油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限
明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎
链球菌的分型。
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2. 培养特点
（1） 培养基
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1.肺炎链球菌的耐药机制
青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）的耐药机制 是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白（PBP）发 生改变，因为PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是β-内酰 胺类抗生素的作用靶位，改变后使PBP与青霉 素G的结合力下降；
青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）始发现于 1967年；
肺炎链球菌的分离和鉴定
卫生部北京医院
陈东科
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概述
肺炎链球菌（S.pneumoniae），俗称 肺炎球菌（pneumococcus）。经常寄居于 正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成 带菌状态。当机体免疫力下降时才致病。 尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、老年 体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染。
*d.不同菌株
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三、肺炎链球菌的药敏试验
K-B法：采用Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血 培养基。直接菌落悬液法(0.5麦氏单位菌液， 在15分钟内接种完)作为接种液。
稀释法：包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和 Etest法。
培养条件：为35℃ 、5％CO2培养20～24小 时。质控菌株ATCC 49619。
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2）选择性分离培养基
培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球 菌的分离。
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3） 培养环境 5～10％CO2、35℃培养24～48h。
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（3）肺炎链球菌的菌落形态 在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形
成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数 菌可呈粘液型菌落。
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4.肺炎链球菌感染的治疗
青霉素G敏感均可直接用青霉素G进行治疗; 青霉素G中度耐药株可用大剂量青霉素G进
行治疗； 如重度耐药可选用三代头孢菌素加万古霉
素或利福平进行治疗。
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总结
1. 肺炎链球菌寄居于人的上呼吸道中，是条件 致病菌；
2.肺炎链球菌对营养要求较高，在含有新鲜血液 的培养基中生长良好；
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1. 溶血性检查
肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力 大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿 色链球菌相区别。
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2. Optochin(OP)敏感试验
optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎 宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。该药对肺炎链 球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成。
optochin敏感试验方法似药敏试验。挑取被 检菌，密涂于血平板上，贴上含5μg/片的 o3p5t℃oc孵hin育纸过片夜，。置抑5菌~1环0%直C径O2>的=大14气mm中为（敏或感烛，缸推）， 断为肺炎链球菌。抑菌环直径<14mm时参照胆汁 溶菌试验。肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm 以上，甲型溶血性链球菌（约98%）小于12mm。
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也有例外，我们在实际工作中检出过耐optochin 的肺炎链球菌，并发现大多数的缓症链球菌和部 分口腔链球菌对optochin的抑菌环直径>=14mm。 应注意鉴别。
但大多数肺炎链球菌对苯唑西林（Oxacillin,OX） 是敏感的(除外PRP)，而缓症链球菌和口腔链球 菌对OX耐药。这可作为辅助鉴别点。
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一、生物学性状
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1. 形态与染色
肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛 头状，成双排列，少呈链状。在组织中 可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失）， 无鞭毛及芽孢。
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2. 培养特点
（1） 培养基
肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的 哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（ 5％马血或羊 血） 。
琼脂浓度可适当下降至1％～1.2％，有利于肺 炎链球菌的生长。
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（2）分离培养
1）标本处理
及时将采集标本接种到适当的培养基 上是提高分离率的前提。因为，肺炎链球菌 对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离 开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率 十分低，不及时接种适当培养基是导致分离 率低的主要原因。
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3.肺炎链球菌的药敏报告
用1ug/片苯唑西林纸片测试青霉素敏感性，当 抑菌环≥20mm或MIC≤0.06ug/ml可报告青霉素 敏感。并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿 莫西林/克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢 吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢 丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢 唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感而 不需要再测定这些药的敏感性。
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3. 胆汁溶菌试验
自溶酶是一种L-丙氨酸--N-乙酰胞壁 酰胺酶，能切断肽聚糖上L-丙氨酸与N-乙 酰胞壁酸间的连接键，从而破坏细胞壁， 使菌溶解。
自溶酶在菌生长的稳定期被激活，也 可被胆汁或胆盐等活性物质激活，从而促 进培养物中的菌体溶解。肺炎链球菌胆汁 溶菌试验为阳性，甲型溶血性链球菌的胆 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ溶菌试验为阴性。
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肺炎链球菌的药敏报告（续1）
当苯唑西林抑菌圈≤19mm时应确定青霉素、头 孢 噻 肟 或 头 孢 曲 松 的 MICs ， 因 为 抑 菌 环 ≤19mm可以发生在青霉素耐药、中介或敏感菌 株中。
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肺炎链球菌的药敏报告（续2）
当从血液或脑脊液中分离出肺炎链球菌，应常 规报告MICs。测定的药物应包括青霉素、头孢 噻肟或头孢曲松、美罗培南和万古霉素。
敏 感 溶菌 七叶苷 肉汤 酮 酶
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肺炎链球菌
+ +— —
—
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——
牛链球菌
— —+
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—
—
—D
无乳链球菌
— ——
d
—
—
+
B
草绿色链球菌 — — — —
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营养变异链球菌 — — — —
+
+
——
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耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种途径:
(1)克隆传播，是耐药菌株从一个国家或地区传播到另
一个国家或地区。
(2)基因水平转移，是把耐药基因转移到敏感菌株中。
过度使用抗生素是耐药菌株传播的危险因素。一般认
为在抗生素的压力选择下，敏感菌株被杀死，耐药菌株确
能生存下来, 或者其他相关链球菌耐药的DNA序列通过基
3.以optochin 试验和胆汁溶菌试验将肺炎链球菌 与其他－溶血链球菌相区别；
4. 血清学鉴定特异性高； 5. 要注意对PRP和MDR的检测。
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肺炎链球菌不产生外毒素，主要靠 荚膜侵袭力致病。肺炎链球菌主要引起 人类大叶性肺炎，肺炎后可继发胸膜炎、 脓胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻 窦炎、支气管炎、心内膜炎、腹膜炎、 关节炎、脑膜炎和败血症等。
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细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有 重要价值，同时对临床治疗的药物选择 也具有十分重要意义。
因转移在肺炎链球菌之间传播。
研究发现证实儿童鼻咽部存在“隐匿性耐药克隆株” 。
随着我国儿童β-内酰胺类抗生素大量使用, 可以预计不
久的将来, 不敏感的肺炎链球菌将会急剧增加。
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2.耐青霉素肺炎链球菌的检测
纸片扩散法对β内酰胺类药物结果的准确 性不够，用1μg/片苯唑西林(OX)筛选肺炎链 球菌对青霉素耐药时，当抑菌环直径小于 20mm时，就必须做稀释法证实是耐药。
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（1）试管法:
取新鲜培养物分装于两支试管内（每支 1ml），其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液 0.1ml或纯牛胆汁0.2ml，另一支加入无菌盐水 两滴（对照），15min后，阳性者细菌被溶解， 试管内液体呈透明状，阴性者无变化。
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（2）平皿法:
加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁 于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔 被溶解，阴性者无变化。试验应有已知肺炎链 球菌作阳性对照。
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肺炎链球菌鉴定要点
革 兰 阳 性 双 球 菌， 矛 头 状， 不 呈 链； 血 平 皿 菌 落 呈 草 绿 溶 血， 湿 润， 菌
落 表 面 无 小 白 点； 培 养 时 间 长 出 现 脐 窝 状； 胆汁溶解试验阳性； 乳 胶 单 克 隆 抗 体 凝 集 阳 性。
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多重耐药肺炎链球菌（MDR）1977年首次在 南非爆发流行。
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肺炎链球菌对奎诺酮类抗生素的耐药主 要是由该菌产生拓扑酶所致。
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肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主 要为靶位的改变，即核糖体50S亚单位改变所 致，由ersB(erythromycin resistance methylase) 基因介导，其耐药表型为MLS，即对大环内酯 类、林可酰胺类和链阳霉素B交叉耐药。另一 耐药机制为主动外排系统，由mefA基因介导， 其耐药表型为M，即对14元环（红霉素、罗红 霉素、克拉霉素、地红霉素、氟红霉素）、15 元环（阿奇霉素）大环内酯类低水平耐药，而 对16元环大环内酯类（罗他霉素、柱晶白霉素、 交沙霉素、麦迪霉素、麦白霉素、螺旋霉素、 乙酰螺旋霉素、米欧卡霉素）、林可霉素和链 阳霉素B敏感。
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4.乳胶凝集试验
结果准确、快速、特异性高。
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5. 荚膜肿胀试验
取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量