高效液相色谱法测定头孢地尼及制剂中聚合物的含量

高效液相色谱法测定头孢地尼及制剂中聚合物的含量

作者：陈文静周志慧陈永森

来源：《医学信息》2014年第11期

摘要：目的采用聚苯乙烯高效液相色谱法检查头孢地尼中聚合物的方法。方法色谱柱为聚苯乙烯凝胶为填料的TSKgel G2000SWxl（7.8 mm×300 mm 5um）色谱柱，流动相为0.1 mol/L，pH=7.0缓冲溶液-甲醇（95∶5），流速为0.5 mL/min，检测波长285 nm，通过HPLC-ESI-MS法鉴定高分子杂质峰，并对其结构进行推定。结果头孢地尼在0.0002～1.5 mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好线性关系（r=1.0000）最小检测浓度为0.2 ug/mL，聚合物杂质与头孢地尼能有效分离，并先于主峰流出，方法专属性良好，样品在溶液中不稳定，需临用新配。结论建立的方法快速准确。适用于头孢地尼及其聚合物的测定。

关键词：高效液相色谱；聚苯乙烯凝胶；头孢地尼；聚合物；β-内酰胺类抗生素；过敏原

头孢地尼为半合成的第三代口服头孢菌素，属于β-内酰胺类抗生素，具有抗菌谱广、疗效高、毒性低等特点。β-内酰胺抗生素是目前临床上最常用的抗感染药物[1]。研究证明，引发过敏反应的过敏原不是抗生素本身，而是其中的高分子杂质，因此国内外对β-内酰胺类抗生素的高分子杂质的控制非常重视。2010版中国药典已有22个品种43个标准的控制[2]。

中国药典2010年版已采用葡聚糖G-10自身对照外标法对大部份常用注射用头孢类抗生素进行了高分子杂质控制，也有文献报道使用葡聚糖G-10用于头孢地尼聚合物的测量[3]。葡聚糖G-10可以手工填装，也有商品化色谱柱，使用该填料的分离的色谱峰拖尾严重，不利于该产品聚合物的测定。日本药典（JP）对头孢卡品酯采用以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基础的TSKgel G2000 色谱柱进行聚合物控制。也有文献报道使用国产的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基础的，以分子排阻为主要分离机制，用于测定头孢呋辛酯中高分子聚合物的检查[4]。

因此我们采用苯乙烯为填料的TSKgel G2000SWxl色谱柱。

1仪器与试药

液相色谱仪，检测器： Waters2998，溶液输送泵：Waters2695，柱温箱：Waters Corporation工作站：Empower版本6.20。

2色谱条件

色谱柱，TOSOH TSKgel G2000SWxl （300mm）；柱温：35℃恒温。流速：0.5 mL/min。

3溶液的制备

3.1对照品溶液的制备取头孢地尼对照品适量，精密称定，用0.1 mol/L pH=7.0缓冲液制成含头孢地尼对0.01 mg/mL的溶液。

3.2供试品溶液的制备取样约品10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L pH=7.0缓冲液稀释至刻度摇匀。

4色谱条件的选择与优化

4.1流动相组成的选择去头孢地尼对照品适量，精密称定，用pH=7.0缓冲溶液稀释成1 mg/mL的溶液，在25℃放置48 h，精密量取10 μL，分别用表1中的四种流动相进行分析，色谱图如图所示，用头孢地尼主成分与其检出杂质、分离度、峰面积及总分析时间为分析指标，发现上述五种色谱系统中，0.1 mol/L pH=7.0缓冲溶液-甲醇（95∶5），作为流动相时，各项指标最优，故选用0.1 mol/L pH=7.0缓冲溶液-甲醇（95∶5）作为流动相，见图1。

4.2流速的影响在0.1 mol/L pH=7.0缓冲溶液-甲醇（95∶5）色谱系统中，考察选流速对色谱分离的影响，结果显示流速为1.0ml/min时，杂质峰与主成分峰不能有效分离，当流速降为0.5 mL/min时，各峰的分离度良好，杂质峰的保留时间为22.067 min主峰流出在2

5.010 min 之后，在30 min内，完成一个样品分析，典型的色谱图，见图2。

4.3柱温的影响取供试品溶液按2.1项下的方法，分别在25℃、35℃、50℃下进行测定，结果在35℃时主成分与杂质锋的分离效果和对称性最优。

5专属性考察

5.1聚合物的结构鉴定采用LC-ESI-MS法，测定系统适用性考察用溶液中高分子聚合物的分子量，通过对待测样品LC分析，样品中有少量杂质峰，根据相关文件报道，猜测其是头孢地尼的低聚物。对强度较大的813.0，791.0，828.9峰分析，它们分别对应与二聚加钠峰，二聚加钾峰，见图3。

5.2强力破坏样品中聚合物的分离取本品原料适量，分别经强酸（0.1 mol/L HCl）沸水浴，强碱（0.1 mol/L NaOH）沸水浴，过氧化氢沸水浴，加热破坏处理，光照，综合后分别用流动相稀释成0.2 mg/mL的供试品溶液。取10 uL按上述色谱条件进行分离。结果表明，在上述色谱系统下，各种破坏试验均能使聚合物峰增大，以碱破坏和氧化破坏最为明显，各峰分离度良好。溶剂不干扰头孢地尼及其高分子杂质的测定。表明该方法的专属性良好。

5.3辅料的干扰取空白辅料，按片剂的配方除主成分外的混合辅料，按3.1供试液制备的方法配制空白辅料溶液，摇匀，取续滤液。立即精密量取10 uL，按照样品测定方法测定，结

果表明，在该色谱条件下辅料在286 nm检测波长下均不出峰，对高分子杂质的色谱行为不产生干扰。

5.4线性与范围精密称取头孢地尼对照品适量，用0.1 mol/L pH=7.0缓冲液稀释制成每1 mL中含头孢地尼分别为0.0005、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1和1.5mg的对照品溶液，进样10 uL，用2.1的色谱条件测定。以头孢地尼的峰面积（A）对其浓度（C）进行线性回归，得线性方程A=65099678.3C-109555.5结果表明，头孢地尼在0.0002～1.5 mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好线性关系r=1.0000。

5.5精密度取连续进样6次，1 mg/mL的对照品溶液，测峰面积，相对标准差RSD为

0.32%，表明方法精密度良好。

5.6最低检测限精密量取头孢地尼对照品适量用0.1 mol/L pH=7.0缓冲液溶解，逐级稀释后进样10 uL，按S/N=3作为检测限，记录色谱图，最低检测浓度约为0.2 ug/mL，灵敏度良好。

5.7供试品浓度与聚合物测定结果性关系考察按3.1配制供试品溶液分别用0.1 mol/L

pH=7.0缓冲液稀释制成0.01、0.02.、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5mg的溶液，摇匀，精密量取10 uL按样品测定方法测定，结果表明在0.01～1.5 mg/mL浓度范围内，聚合物峰面积与头孢地尼主峰相关性良好，相关系数为r=1.0000。

5.8样品测定精密称取头孢地尼片样品粉末适量，用0.1 mol/L pH=7.0缓冲液稀释并制成约含1 mg/mL的溶液。按文中所提的方法进行实验，3批样品测定结果，见表2。

6讨论

以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基础的TSKgel G2000该色谱柱以分子量排阻为主要分离机制，有别于其他聚合物基质的色谱填料，具有耐高压，耐酸碱的特点，对水溶性和有机溶剂流动相均适用。今后可以适用于其他β-内酰胺类抗生素中聚合物的测定。

在PDA全波长扫描下，检测系统适用性溶液，所得杂质及主成分的最大吸收在285 nm，主成分峰的最大吸收为285 nm，故选择285 nm为检测波长。较之普通聚合物采用单一检测波长254 nm更具有合理性

参考文献：

[1]金少鸿，胡昌勤，仇士林，等.β-内酰胺类抗生素过敏反应的研究[J].医学研究通讯，2002，31（4）：22-23.

[2]国家药典委员会.中国药典，2010二部附录VH[S].北京：中国医药科技出版社，2012.