垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

实验九、十垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

一、实验目的

1、了解并掌握垂直板凝胶电泳的使用方法。

2、学习电泳原理和技术。

二、实验原理

1.电泳

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为3.75%。电极缓冲液为Tris-甘氨酸系统。每泳道上样40μL，电泳在低温（4℃）下进行。浓缩胶电泳时电压为100V，分离胶电泳时电压200V。电泳时间约为4h。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）聚丙烯酰胺凝胶

本实验过程中，采取的不连续凝胶电泳，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为3.75%。电极缓冲液为Tris-甘氨酸系统

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为3.75%。电极缓冲液为Tris-甘氨酸系统。每泳道上样40μL，电泳在低温（4℃）下进行。浓缩胶电泳时电压为100V，分离胶电泳时电压200V。电泳时间约为4h。

3.蛋白质考马斯亮蓝染色及检测

蛋白质考马斯亮蓝染色。电泳过后，切取蛋白质区的凝胶，用蒸馏水轻洗一次后，用考马斯亮蓝染液（含0.1%考马斯亮蓝R-350、30%甲醇及10%冰醋酸）在室温下染色过夜。随后进行脱色。用注射针筒吸出染液，加入脱色液（含10%乙醇及15%冰醋酸），于床轻摇脱色，反复换脱色液运直到无背景色。最后照相记录染色结果。

4.植物过氧化物酶同工酶及染色

同工酶是指生物体中结构和性质不同而能催化相同反应的一类酶。许多酶都具有同工酶（约占已知酶的40 ~ 50% ），凝胶电泳可利用同工酶结构上的差异而将之分离。过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶，植物体内的许多生理代谢过程与过氧化物酶及其同工酶的种类有关。本实验用加有蔗糖的缓冲液作提取溶剂，提取甘蔗叶片中的过氧化物酶同工酶，所加蔗糖是为增加样品液比重，使加样时能让样品平铺于凝胶表面，有防止其扩散的作用。利用过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化为蓝色或棕色产物，将经过电泳后的凝胶置于有过氧化氢及联苯胺的溶液中染色，有色部位即为过氧化物酶在凝胶中存在的位置，从而得到过氧化物酶同工酶酶谱。

5.植物酯酶同工酶及染色

酶和蛋白质是基因表达的产物，基因位于染色体上。当某一对同源染色体缺失时，位于这对染色体上的基因和它们所编码的酶或蛋白质也就随之丢失。以正常小麦及其缺体系为材料，通过蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳和同工酶分析，即可确定编码这些酶或蛋白质的基因在基因组中的定位。

6.植物过氧化氢酶同工酶及染色

利用过氧化氢酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色的产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有过氧化氢及联苯胺的溶液染色，出现蓝色活棕褐色的部位几位过氧化氢酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化氢酶同工酶谱。

三、实验材料

水稻种子提取液、小麦种子提取液。

四、实验仪器和试剂

仪器：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、样品梳。

试剂：A液（1.0ml/L盐酸48ml，Tris36.3克，加水至100ml）B液（丙烯酰胺15g，甲叉双丙烯酰胺0.4g，水溶后，定溶至50ml；TEMED；10%过硫酸铵溶液（AP液），C液（联大茴香胺250mg溶于140ml95%乙醇中，加水20ml）；0.025%溴酚蓝—50%甘油；电极缓冲液（Tris6.0g，甘油酸28.8g，加蒸馏水至1000ml，调PH8.3，同时稀释10倍）；染色液；1%琼脂糖。

五、实验步骤

1.凝胶制备和装槽

①、将装配凝胶模具所用的玻璃板、橡胶板样品梳等用具洗净风干。②、用两块橡胶板固定于橡胶框上，用滴管吸取融化的琼脂糖封住底边。③、琼脂糖凝固后，将玻璃板及橡胶框的一边装在电泳槽上。④、取一个干净的烧杯，按照表中分离胶的组成依次加入相应的组分（A液7.5ml、B液7.5ml、C液15ml），混合摇匀。

2.加样

将凝胶板模具稍倾斜，把分离胶溶液沿两块玻璃板上方缓慢倒入，注意防止产生气泡，然后插上样品梳，用定量针管注入少量蒸馏水，在烤箱里里凝聚。

3.电泳

浓缩胶聚合后，拔出样品梳，加入电极缓冲液，接好电源；用微量加样器吸取30—50ml 样品缓慢加入到加样孔中；将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时电压为150 v，，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳。

4.取胶、染色

取下凝胶，用水冲洗后置于培养皿中；将200ml 0.1M磷酸缓冲液(pH 6.0), 10ml a-乙酸奈酯和10ml坚牢兰RR盐混合，加入培养皿中；室温保温染色，待褐色的酶带显示清楚后，用蒸馏水冲洗并保存；观察现象并分析。

六、实验结果

1.植物蛋白质电泳结果（图片）。

蛋白质考马斯亮蓝染色电泳图

2.植物过氧化物酶同工酶、酯酶同工酶及过氧化氢酶同工酶的酶谱结果图片，（标明正负极、溴酚蓝的位置）。

过氧化物酶同工酶染色过氧化氢酶同工酶酯酶同工酶

七、实验结果及评价

电泳完成后，将聚丙烯酰胺凝胶取下，按照实验前的设计将分区切下，并将各区域在相应的染色液中进行染色，照相记录。。从检测结果来看，此次多项实验技术的“整合”是成功的，取得了事半功倍的效果。通过这个实验，可以掌握聚丙烯酰胺凝胶的基本原理和操作方法。另外，可以掌握蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色检测技术。三种同工酶的电泳及检测技术也可以同步掌握。