毒理学大蒜根尖染色体观察.

微核试验

一、研究的目的与意义：

1：知道微核产生的原理。

2：学会识别微核以及计算微核率。

3：学用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤。

4：了解不同化学试剂对细胞各个分裂期的影响。

由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。真核测试系统能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害。利用微核实验这种遗传毒性试验方法可以检测检测染色体或者有丝分裂器损伤，计数细胞的微核率。检测已存在或潜在的危害。

二、研究内容与技术路线

2.1 研究内容：

通过观察不同浓度的1,2,4-三氯苯和铬以及它们的交互作用对大蒜根尖细胞微核率以及不同分裂期细胞的比例的影响，来判断其遗传毒性。 2.2 技术路线：

冷冻保存

24h

孚尔根染液配制

三、实验方法

3.1实验材料

大蒜、甲醇、冰乙酸、碱性品红、偏重亚硫酸钠、比重1.18的浓盐酸、蒸馏水、酒精、重铬酸钾、氯苯、丙酮、显微镜、载玻片、盖玻片、定性滤纸、烧杯、100毫升容量瓶、200毫升容量瓶、镊子、刀片、纱布、青霉素小瓶、移液管、试管

3.2试剂准备：

1、1mol/LHCl：用10mL 移液管量取8.69mL 浓盐酸加入100mL 容量瓶，用在蒸馏水定容至100mL 。

2、50mg/L、100mg/L、：称取170mg 重铬酸钾，加水溶解，在200mL 容量瓶中定容，配制300mg/L的Gr 6+母液，然后稀释到50mg/L、100mg/L。

3、卡诺式固定液：将甲醇：冰乙酸按3:1比例混合配制

5、Schiff 氏试剂：称取0.5g 碱性品红加入到100mL 煮沸的蒸馏水中，时时振荡，继续煮5min ，使碱性品红充分溶解。冷却致50℃，用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/LHCl，冷却致25℃，加入1.5g 偏重亚硫酸钠，充分振荡，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h ，用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封瓶塞，外包黑纸。贮存于冷暗处（4℃冰箱中）备用。

3.3实验过程：

3.3.1、材料准备：

将大蒜剥皮后放进垫了滤纸的培养基中，加入清水，放进25℃恒温培养箱中2~3天，催化大蒜生根。

选择根长0.5~1cm且不定根生长情况差不多的大蒜分为10组

3.3.2、Schiff 氏试剂检验：

在大蒜生根之后，先选取一些根尖放进卡诺式固定液中固定3个小时，用Schiff 氏试剂染色，镜检，观察染色体是否能染上色以及染色效果。若染色效果不行，则重新配制Schiff 氏试剂，直至染色效果良好，然后将其贮存于4℃

冰箱中准备使用。

3.3.3、大蒜根尖处理：

将分好组的大蒜分别用清水、50mg/L Gr 6+、100mg/L Gr 6+、浓度分别为

50mg/L Gr6+和秋水仙素的混合液、100mg/L Gr6+和秋水仙素的混合液培养24小时。清水组为对照组。

3.3.4、固定：

在早上有丝分裂旺盛的时候，将处理过的大蒜根尖剪下，分别放入青霉素小瓶中，加入卡诺氏固定液固定3个小时，然后放入4℃冰箱内保存，以备使用。

3.3.5、解离：

取出部分经过固定的根尖先用酒精和清水洗涤，加入1mol/LHCl覆盖根尖，放入60摄氏度水浴锅内水浴加热7~10分钟，取出用清水洗涤3次，每次5分钟。

3.3.6、染色制片：

取出解离后的根尖，放在载玻片上，用刀片切下根尖乳白色的分生区部分，滴加1滴Schiff 氏试剂染色10分钟，然后盖上盖玻片，吸干染液，并用镊子钝的一端在盖玻片上轻轻敲击，将细胞打散。

3.3.7、镜检:

将制备好的根尖放在显微镜下观察，统计微核数目、以及有丝分裂间期、前期、中期、后期、末期细胞数目并计算有丝分裂指数以及微核率。每组浓度细胞计数400个。微核识别标准：

（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。（2）小核着色与主核相当或稍浅。

（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。

4实验结果与分析

有丝分裂前期有丝分裂中期

有丝分裂后期有丝分裂末期

微核双倍体

5实验结果：

1、初步观察结果

经过初步观察统计，经过Cr 6+溶液处理过的根尖细胞有一定的机率发生变异，与清水培养的相比，经过六价铬处理过的根尖细胞，出现前期、中期、末期这三个时期机率较小，而有丝分裂中期的出现机率明显增大。并且经过六价铬处理的根尖细胞发生变异，出现微核，可能六价铬对大蒜根尖细胞有抑制分裂的作用，并且对大蒜根尖细胞的分裂有致畸作用，因为实验数据过少，不能说明问题。

6小结：

实验的每一个小步骤都不容忽视，这些都是关乎实验成败的关键点。因为我们对这个实验不熟悉，在染色制片这个步骤中，不能很好的掌握力度及实验技巧，导致重做了几次，浪费了很多时间。