枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化
枯草杆菌溶栓酶的液体发酵工艺和分离纯化研究
枯草杆菌溶栓酶的液体发酵工艺和分离纯化研究
胡淳罡;刘常金;周平;肖丽梅
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2008(000)010
【摘要】以产溶栓酶的枯草芽孢杆菌SBS为出发菌株,采用单因子试验和正交试验研究了液体发酵培养条件和培养基组成对酶活性的影响.发酵液经硫酸铵分段盐析、离子交换色谱、凝胶过滤色谱等手段得到了电泳纯级别的溶血栓酶.结果表明,产溶
栓酶的最佳液体培养基组成为:10g/L米糠、25g/L大豆分离蛋白、0.2g/L CaCl2;最佳发酵培养条件为37℃,初始pH 8.0,15L发酵罐,发酵时间为70h,酶活性达到542U/mL,SDS-PAGE测得其分子量为32kDa.
【总页数】4页(P32-35)
【作者】胡淳罡;刘常金;周平;肖丽梅
【作者单位】天津科技大学,食品工程与生物技术学院,天津,300457;天津科技大学,食品工程与生物技术学院,天津,300457;天津科技大学,食品工程与生物技术学院,天津,300457;天津科技大学,食品工程与生物技术学院,天津,300457
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-3
【相关文献】
1.60Coγ-DES复合诱变选育高产中性蛋白酶枯草杆菌及其发酵工艺研究 [J], 张新国;刘英娟;陈文洁;张春生;曹心张
2.枯草杆菌溶栓酶的分离纯化研究 [J], 韩润林;张小勇;张建安;李佐虎
3.枯草杆菌6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的分离纯化及部分性质研究 [J], 秦岭;刘克武;莫宏春;江琰;国锦林;刘祝君;喻东
4.1株诱变的枯草杆菌溶栓酶体内外溶栓性质初探 [J], 余蓉;祁晖;张涛;吴梧桐
5.产纤溶酶枯草杆菌液体发酵工艺优化研究 [J], 刘常金;赵彦丽;曹卫忠
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枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化
枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化李洪康;李由然;李赢;顾正华;丁重阳;石贵阳;张梁【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2016(042)005【摘要】对1株枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵培养基以及发酵条件进行了优化,最终确定了摇瓶最佳发酵培养基为:甘油40 g/L、豆粕粉30 g/L、麸皮10 g/L、Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L.摇床最佳发酵条件为:温度30℃、转速250 r/min、接种量体积分数6％,在此发酵条件下,酶活达到6 082.7 U/mL,发酵强度为56 U/(mL·h).在15 L发酵罐进行了初步验证,通过流加甘油分批发酵,在第25h酶活达到最大值,为11 871 U/mL.【总页数】6页(P102-107)【作者】李洪康;李由然;李赢;顾正华;丁重阳;石贵阳;张梁【作者单位】江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文【相关文献】1.枯草芽孢杆菌J-4菌株产抑菌物质发酵条件优化 [J], 翟玉洁;邓祖丽颖;姜军坡;王世英2.枯草芽孢杆菌8-32产抗真菌物质发酵条件优化 [J], 贾田惠;杨可欣;时向哲;王欢;刘雪娇;高同国;朱宝成3.枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶发酵条件优化 [J], 卢超;陈景鲜;王国霞;陈刚;李春阁;王会鱼4.枯草芽孢杆菌S-16产抗菌蛋白发酵条件优化及蛋白分离纯化 [J], 路妍;杨鑫;吴文庆;连紫倩;扈景晗;周洪友5.枯草芽孢杆菌SX3411产抑菌物质的发酵条件优化 [J], 丰磊;魏伟群;付鸣佳;肖世平;叶德晓;钟雪晴;黄紫妍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化
枯草芽孢杆菌的培养、筛选分离和鉴别
03
枯草芽孢杆菌的筛选分离
枯草芽孢杆菌的分离纯化
制样品稀释液
取得土壤样g，放入盛 1 有99ml的无菌水锥形
瓶中，充分振荡。
培养
用移液枪将各个浓度梯度的一 3 定量稀释液接种到开始时制作 好的培养基上，用无菌刮铲涂 匀。37℃下倒置培养24小时。
加热筛选能形成芽孢的 细菌
在超净工作台中，将装有锥形瓶 2 的菌悬液加塞、包扎、摇匀后放
3
高压灭菌：将分装包扎的培养基放入 高压蒸汽灭菌锅中进行高压蒸汽霉菌， 用0.075MPa灭菌30分钟。（使用高 压蒸汽灭菌锅要注意放完冷气。灭菌 结束后等到气压降到“0”时才能打 开放气阀。）
培养基 制备
2
精确称取蔗糖30g、磷酸二氢钾4.5g、 硫酸铵2.5g、蛋白胨10g、碳酸钙 2g、酵母膏5g和琼脂20g，然后在 1000ml水中充分溶解。
道中的游离氧，造成肠道
2
低氧，促进有益厌氧菌生
长，间接抑制其它致病菌
生长。
4.
枯草芽孢杆菌菌体自身合成α -
4
淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤
维素酶等酶类，在消化道中与
动物体(人体)内的消化酶类一
同发挥作用。
3.
3
刺激动物(人体)免疫器官
的生长发育，激活T、B
淋巴细胞，提高免疫球
蛋白和抗体水平，增强
细胞免疫和体液免疫功
能，提高群体免疫力。
生物科学 进入人体，能100%到达大小肠，抑
制致病菌，促进有益厌氧菌生长，并产生 乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑 制其它致病菌生长。提高免疫球蛋白和抗 体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能， 提高群体免疫力。合成α -淀粉酶、蛋白酶、 脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与 动物体(人体)内的消化酶类一同发挥作用。
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
——土壤中微生物的分离纯 化、培养观察及保藏
实验流程
土 壤 分样 离品 纯中 化微 生 物 的
细菌 酵母菌 放线菌 霉菌
形态结构观察
生理生化反应
nisin效价测定
生长曲线测定
菌
种
形态观察
保
直接计数
藏
死活细胞鉴定
形态结构观察
土壤中微生物的分离、纯化 和培养
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖 产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后 者在强碱环境下，被空气中的氧气氧化为二乙酰，二 乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+） 反应。
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 1
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 2
细菌细胞的生理生化反应
其基本原理是选择适合于微生物生长的培养条件如营养成分酸碱度温度和氧等或加入某种抑制剂在平板上培养微生物当平板上长出单菌落后挑取得到纯种的微生物土壤中微生物的分离纯化培养观察及保藏试剂与器材1材料含大肠杆菌枯草芽孢杆菌乳酸乳球菌黑曲霉根霉青霉和放线菌的土壤样品牛肉膏蛋白胨培养基斜面液体半固体马丁氏培养基查氏培养基等2试剂10酚4水琼脂3器材盛9ml无菌水的试管盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶涂布器无菌吸管接种环酒精灯无菌培养皿显微镜细胞计数板等
细菌的革兰氏染色
试剂与器材
1、材料
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
2、试剂
结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红等。
3、器材
显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（内 装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。
Procedures of Gram Staining
产酶益生素
• 技术创新性之一：优越的菌株产酶性能
• 产酶是产酶益生素的基本特征。这八株有益菌在动 物肠道内可代谢产生中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋 白酶；α-淀粉酶、糖苷酶；脂肪酶；NSP酶等多种消化 酶类和非淀 粉多糖酶类，可以提高蛋白质和能量的消化吸收利用率 达5％左右。 1.产酶益生素中的枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn）N9-1-35，其产中性蛋白 酶的能力由起始菌株的45个国际单位，到2007年的 1000个国际单位，目前则达到1500个国际单位，快速 产酶期提前4小时。产酶性能可以提高动物对饲料尤其 是蛋白的消化能力，提高饲料转化率。
•
• • • •
+ 产酶益生素的主导成分及含量：
经过十年的连续选育和反复试验，产酶益生素最终确定了2株枯草芽孢杆 菌、1株地衣芽孢杆菌、4株乳酸菌和1株丁酸梭菌为主导成分的菌种组成。 活菌总数：浓缩精品为1.5×109CFU/克 非浓缩品为2.0×108CFU/克 由以上八株有益菌及其代谢产物组成，在机体代谢可产生多种消化酶，B 族维生素、有机酸和抗菌物质，还可生成多种未知促生长因子等。
产酶益生素 仔猪专用
仔猪专用型：适用于乳猪、仔 猪等哺乳动物的 幼龄阶段。 添加比例：0.2-0.4% 包装规格：25kg/桶 20kg/袋 本品适用于预混料厂、全价 料厂、规模养猪场。
产酶益生素 精品
• • • • • 精 品 型：适用于各种动 物 添加比例：0.01-0.02% 包装规格：桶装25kg(内 销) 桶装20Kg(外销) 本品适用于大型饲料厂、 预混料厂、大型养殖集团。 • • • • •
菌酶协同发酵生产蛋白饲料的研究进展及应用
菌酶协同发酵生产蛋白饲料的研究进展及应用。
随着我国蛋白资源短缺问题的出现，寻找其他原料弥补优质蛋白资源匮乏成为目前需要解决的问题。
我国非常规饲料原料来源广泛，富含维生素、蛋白质等营养成分，但存在抗营养因子和有毒物质且适口性差以及营养成分不平衡、差异大等缺点。
菌酶协同发酵是在微生物发酵工艺的处理下添加一定量的酶进行协同发酵，兼具酶解法和微生物发酵法的优点，能将原料中的抗营养因子降解，调节饲料苦味，改善饲料适口性，弥补单一微生物发酵产酶不足和酶解口味不佳等问题，促进动物采食，提高饲料转化率和营养价值。
因此，菌酶协同发酵饲料原料生产蛋白饲料能够充分利用我国非常规饲料资源，有效缓解我国蛋白饲料不足的压力，促进养殖业发展。
1菌酶协同发酵生产蛋白饲料的研究1.1菌酶协同发酵常用的菌种和酶菌酶协同发酵常用的菌种主要包括芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌以及霉菌。
芽孢杆菌类主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和蜡质芽孢杆菌等，能降解抗营养因子和有毒物质，分泌纤维素酶和蛋白酶将纤维素和大分子蛋白降解，调节动物肠道健康。
酵母菌类主要有酿酒酵母、产阮假丝酵母和啤酒酵母等，能使发酵饲料产生酒香味，改善饲料适口性，提升饲料风味，且因其本身是菌体蛋白，可增加蛋白产量，增加饲料利用率。
乳酸菌类主要有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸杆菌和乳酸片球菌等，能产生多种有机酸和细菌素进而降低饲料pH值，抑制有害菌生长，提升饲料营养品质，促进动物采食，增强动物免疫力。
霉菌类主要有米曲霉、根霉、木霉、黑曲霉和青霉等，霉菌类菌株能分泌胞外酶，如蛋白酶、半纤维素酶和纤维素酶等来分解原料中的淀粉和蛋白来提升发酵效果和增加饲料利用率。
常用酶主要是非淀粉多糖酶和蛋白酶。
非淀粉多糖酶主要是纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和甘露糖酶等，可将饲料原料中的纤维破坏使营养物质得以释放，且可将原料中碳水化合物分解为葡萄糖和氨基酸等小分子物质为菌群提供能源，促进动物吸收消化。
枯草芽孢杆菌高产中性蛋白酶发酵条件的优化
枯草芽孢杆菌高产中性蛋白酶发酵条件的优化刘颖;张彬彬;孙冰玉;刘琳琳;邹丽宏;石彦国【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2014(035)013【摘要】通过单因素试验和正交试验对枯草芽孢杆菌10075菌株发酵产中性蛋白酶的培养基组分及培养条件进行优化,达到提高菌株中性蛋白酶产量的目的.结果表明,发酵培养基的最佳组分:添加麦芽糖8.0％、蛋白胨4.0％、MgSO4 0.08％;最适发酵条件为发酵温度37℃、初始pH 7.0、发酵时间42 h,酶活力由最初的98.36 U/mL提高到353.45 U/mL.【总页数】5页(P166-170)【作者】刘颖;张彬彬;孙冰玉;刘琳琳;邹丽宏;石彦国【作者单位】哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076【正文语种】中文【中图分类】Q939.97;TS201.3【相关文献】1.枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化 [J], 李洪康;李由然;李赢;顾正华;丁重阳;石贵阳;张梁2.枯草芽孢杆菌ZC 1发酵产中性蛋白酶的条件优化 [J], 黄达明;宋庆春;管国强;张志才;李倩3.枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化 [J], LIU Wenlong;WANG Xingji;WANG Kefen;WANG Shuai4.枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶发酵条件优化 [J], 卢超;陈景鲜;王国霞;陈刚;李春阁;王会鱼5.蜡样芽孢杆菌高产新型中性蛋白酶发酵条件的优化 [J], 于平;吴赟婷;杨柳贞;贺敏;胡淳玉;刘航;易明花因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定方案
枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定方案3班第3组周三15:30-17:00周四08:30-09:50组长：刘晨阳组员：吕宛容，韩晴，董春燕，邢爽，高倩倩，薛琳琳，邵宇婷，吴子侥枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定一、目的要求1、掌握分离、纯化枯草芽胞杆菌的方法。
2、掌握如何鉴别所得菌是否为枯草芽胞杆菌的方法。
二、实验原理芽孢杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽胞0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽胞形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。
其分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于其能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
其菌落变化很大，芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
芽孢杆菌能产生芽孢，芽孢具有较强的抗高温能力在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离纯化及生理生化鉴定得到芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的研究进展
枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的研究进展张晓燕;国立东;刘晓艳【摘要】Neutral protease is widely used in food, medicine, feeds and other fields due to their mild conditions. As a probiotic bacterium in the intestinal tract, Bacillus subtilis has strong protease activity and gets a lot of attention. The characteristics and application of neutral protease of B. subtilis, the ways to improve the activity of neutral protease of B. subtilis and the separation and purification of neutral protease from B. subtilis were reviewed. Subsequently, the current existing problems were analyzed and prospected, aiming to provide reference for further study of protease production byB. subtilis.%中性蛋白酶因作用条件温和广泛应用于食品、医药以及饲料等领域.枯草芽孢杆菌为肠道益生菌,且具有较强的蛋白酶活性而受到极大关注.该文对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的特性与应用、提高枯草芽孢杆菌中性蛋白酶活力的途径以及枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的分离纯化方法进行了综述,并对存在的问题进行了分析与展望,旨在为枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的深入研究提供参考.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)004【总页数】4页(P12-15)【关键词】枯草芽孢杆菌;中性蛋白酶;酶活;研究进展【作者】张晓燕;国立东;刘晓艳【作者单位】黑龙江中医药大学药学院,黑龙江哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学药学院,黑龙江哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学药学院,黑龙江哈尔滨 150040【正文语种】中文【中图分类】TS201.3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类革兰氏阳性、好氧型细菌,具有单层的细胞外膜,细胞壁不含内毒素,菌体呈污白色或微黄色,表面粗糙能够形成孢子,无荚膜,周生鞭毛,能运动。
枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化
枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化LIU Wenlong;WANG Xingji;WANG Kefen;WANG Shuai【摘要】选用玉米粉、豆饼粉、KH2 PO4及Na2 HPO4为基础配方,通过单因素实验对枯草芽孢杆菌发酵产中性蛋白酶的培养基组分及培养条件进行优化.确定了优化的发酵培养基为:20 g·L-1甘油,30 g·L-1豆饼粉,2 mmol·L-1氯化钙,0.3 g·L-1 KH2 PO4,4 g·L-1 Na2 HPO4;优化的发酵条件为:温度30℃,接种量5％.调控发酵培养基pH值7.0控制发酵,发酵周期40 h,最终的酶活达到7344 U·mL-1.进行甘油补料流加实验,培养温度30℃,发酵过程控制pH值7.0,调整转速和风量控制溶氧30％～35％,接入5％种子,经过40 h发酵,最终酶活达到10654 U·mL-1,较未补料提高了45％.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2019(036)001【总页数】6页(P47-52)【关键词】枯草芽孢杆菌;中性蛋白酶;液体发酵;酶活性【作者】LIU Wenlong;WANG Xingji;WANG Kefen;WANG Shuai【作者单位】;;;【正文语种】中文蛋白酶是一类在生理及商业上都有非常重要地位的水解酶类，能催化肽键水解成氨基酸或短肽，其销售量约占酶制剂市场的一半以上[1]。
按蛋白酶作用的最适pH值可分为酸性、中性和碱性蛋白酶。
中性蛋白酶是最早被应用的蛋白酶之一，能在中性pH值范围内将大分子蛋白质水解成相对分子量在5 000以下的多肽[2]，普遍存在于细菌和真菌中，在pH值7～8时活性最大[3]。
目前，中性蛋白酶高产菌株主要通过自然界筛选、人工诱变和分子生物学改造获得[4-8]。
近年来，国外研究侧重于基因结构特性研究、定点突变改变蛋白酶的特性、稳定性的提高、与医学相关的蛋白酶的分离鉴定、蛋白酶的应用等[9-12]。
脱脂羊脑蛋白水解多肽的分离纯化及抗氧化活性
脱脂羊脑蛋白水解多肽的分离纯化及抗氧化活性常飞;杨雪果;肖士成;蒋鹏飞;黄慧娜;段旭昌【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2016(037)001【摘要】为制备羊脑蛋白抗氧化肽,本实验对脱脂羊脑蛋白含量及氨基酸组成进行了分析;采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶不同酶解时间的酶解液分子质量进行了分析;采用交联葡聚糖凝胶Sephadex G-25和Sephadex G-15对羊脑酶解产物进行了逐级分离纯化,以羟自由基(·OH)和亚硝酸根离子清除能力为指标对分离组分进行抗氧活性评价,并对纯化后的组分抗氧化活性进行了测定.结果表明,脱脂羊脑粉中蛋白含量为60.55％,在测定的17种氨基酸中,谷氨酸和天冬氨酸这两种酸性氨基酸含量最高,且含有7种必需氨基酸;羊脑蛋白经酶解后,分子质量集中在10kD以下;经Sephadex G-25纯化后,得到了6个组分,其中组分F4的抗氧化活性最强,组分F4经SephadexG-15纯化后,得到3个组分,其中组分F4-2的抗氧化活性最强,组分F4-2对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、·OH、超氧阴离子自由基(O2-·)、亚硝酸根离子的半数抑制率IC50分别为1.64、 2.47、 7.98、 5.14mg/mL.【总页数】7页(P33-39)【作者】常飞;杨雪果;肖士成;蒋鹏飞;黄慧娜;段旭昌【作者单位】西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100;西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100;陕西杨陵华兴羊产业科技发展有限公司,陕西杨凌 712100;西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100;西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100【正文语种】中文【中图分类】TS209【相关文献】1.脱脂羊脑蛋白酶解条件优化及酶解产物体外抗氧化活性 [J], 常飞;杨雪果;肖士成;段旭昌2.芝麻蛋白水解工艺优化及芝麻多肽组分抗氧化活性的研究 [J], 邵元龙;董英3.动物蛋白水解酶法制备南极磷虾多肽及其抗氧化活性 [J], 朱俊向;于丁一;宋玉凤;许丹4.脱脂牦牛乳硬质干酪成熟期间水溶性多肽的抗氧化活性 [J], 豆佳毓; 梁琪; 张炎5.鸡卵清蛋白水解物中分离纯化出具有清除DPPH·自由基的多肽的研究 [J], 成静;于兰;杨国燕;唐良艳;季金林;陈栋梁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定
枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定一、目的：掌握芽孢杆菌属常见种的分离，鉴定方法和技术。
将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。
二、原理：芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。
，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
三、材料和器皿：显微镜、培养皿（12个）、试管（12个）、三角瓶（5个）、烧杯、移液管（）、涂布棒（6个）、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、v.p.实验培养基、肉汤琼脂培养基孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇四、操作步骤菌种的分离和纯化（1）土壤的采集：取土壤表层5~10厘米下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋中带回实验室分离。
（2）平板的制备：融化三角瓶中的牛肉膏蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒入6个平板上。
（3）稀释分离法：秤取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15分钟，而后静止5分钟。
吸取上层液0.5ml加入到含有4.5ml的无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后分别吸取10-2和10-3土壤悬浊液个0.1ml滴加到上述牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每种稀释2皿，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1~2天。
（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取2个单菌落中部分菌落，然后在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是否是芽孢杆菌纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，置37℃培养1~2天备用。
菌种的鉴定1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）（1）单个菌种的形态（2）菌种形态的观察2.革兰氏染色3.芽孢染色4.菌体大小测验5.枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定一、淀粉水解一、原理许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将淀粉培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产酶分析
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产酶分析一、概述1.枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。
在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
2.地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌，种属芽孢杆菌科细菌为革兰氏阳性杆菌；细胞大小：0．8μm×（1．5～3．5）μm；细胞形态及特点：细胞形态和排列呈杆状、单生。
细胞内无聚-β-羟基丁酸盐（PHB）颗粒，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。
在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm。
本菌有动力。
可调整菌群失调达到治疗目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。
能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。
二、产酶的种类1.枯草芽孢杆菌代谢产酶种类枯草芽孢杆菌产生多种酶和其他代谢产物，主要由以下几个方面：●枯草芽孢杆菌菌体在生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；●枯草芽孢杆菌能迅速消耗消化道内环境中的游离氧，形成肠道低氧环境，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌的生长；●枯草芽孢杆菌能刺激动物免疫器官的生长发育，激活淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；●枯草芽孢杆菌菌体能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等，在消化道中与内源酶共同发挥作用，提高饲料消化率；枯草芽孢杆菌能合成多种维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。
发酵综合实验 实验报告
目录摘要.................................... 错误！未定义书签。
1 引言 (4)2材料与方法 ............................ 错误！未定义书签。
3 结果与讨论............................ 错误！未定义书签。
4 总结.................................. 错误！未定义书签。
5 心得体会.............................. 错误！未定义书签。
参考文献................................ 错误！未定义书签。
蛋白酶的发酵工艺研究摘要中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可用于皮革脱毛、软化、畜禽血液蛋白质水解、果酒、啤酒和饮料的澄清以及医学治疗等应用领域中。
本文对一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌（AS1.398）的发酵条件进行了研究，考察不同因素条件下对产酶的影响。
通过摇瓶培养研究碳源浓度，不同接种量对蛋白酶产量的影响。
利用酪蛋白培养基的平板实验观察蛋白酶的性质。
利用发酵罐培养观察时间对产酶的影响.结果表明:豆饼粉3.0g/100ml，玉米粉4.0g/100ml，麸皮粉2.5g/100ml，磷酸氢二钠0.4g/100ml，磷酸二氢钾0.03g/100ml，pH 7.2-7.4为最适宜培养基组分。
并且发酵罐培养的产酶活性高于摇瓶培养。
关键词：中性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；摇瓶培养；发酵罐The Fermentation Process Research of Protease Abstract Neutral protease is the first to be discovered and widely used in industrial production of the protease preparation ,which can be used for leather hair removal, softening, animal blood protein hydrolysis, wine, beer and beverage clarification, and in applications such as medical treatment.The fermentation conditions of a Bacillus Subtilis （AS1.398） which can produce neutral protease were studied in this paper. Under the condition of different factors to examine the influence of enzyme production.This study discussed concentration of carbon source, different inoculum on protease yield by shake flask. Casein petri dishes has been used in the observation of the nature of the protease. Fermentation tanks culture was used for observing time's effection on the production of enzymes. the results showed that soybean meal 3.0g/100ml, corn flour 4.0g/100ml,wheat bran powder 2.5g/100ml,disodium hydrogen phosphate 0.4g/100ml,potassium dihydrogen phosphate 0.03g/100ml, pH 7.2-7.4 was the most appropriate medium composition. Enzyme production activity of Fermentation tanks culture was higher than shaking culture. Keywords: Neutral protease；Bacillus subtilis；Shaking culture；Fermentation1 引言1.1 自然界中有大量产泌外蛋白酶微生物，其中以微生物的产酶活性最优。
土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选
土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选2021023123刘倩倩一、实验目的1.掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。
2.了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。
根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。
二、实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中。
选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。
利用稀释涂布法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。
然后，进行初筛与纯化，利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。
再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。
三、实验材料（1）选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。
配方：牛肉膏 5.0g蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 可溶性淀粉 10.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml调整pH至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。
（2）溶液或试剂牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化钠 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 琼脂 5g碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。
（3）仪器或其他用品平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。
枯草芽孢杆菌蛋白酶最佳使用条件
枯草芽孢杆菌蛋白酶最佳使用条件1. 初识枯草芽孢杆菌蛋白酶说到枯草芽孢杆菌蛋白酶，可能大家第一反应是“这是什么鬼？”其实啊，枯草芽孢杆菌蛋白酶，它是一种由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生产的酶，主要用来分解蛋白质。
听起来是不是很厉害？就像是食物界的小超人一样，能把各种蛋白质“搞定”。
说白了，它的工作就是帮助我们将那些难以消化的蛋白质分解成更简单的氨基酸。
这样一来，无论是我们吃的牛排还是鸡肉，经过它的“手术”，就能变得更容易被消化吸收了。
2. 最佳使用条件2.1 温度：适可而止温度对蛋白酶的活性可是至关重要的。
你就想象一下，蛋白酶就像是你早上起床的那一杯热咖啡，太热了喝不下去，太凉了也没味道。
一般来说，枯草芽孢杆菌蛋白酶在50℃左右的温度下工作得最好。
这个温度不仅能让它发挥最大的效果，而且也不会让它“受不了”，没事儿咬牙坚持。
在这种温度下，它就像是打了鸡血一样，效率高得不得了。
不过，也不要过分追求高温，这样蛋白酶可能会“过热”变得不稳定，甚至失去活性。
2.2 pH值：酸碱平衡谈到pH值，那可真是复杂的一个话题。
简单来说，枯草芽孢杆菌蛋白酶最喜欢的是中性到微碱性的环境，大约在pH 7到pH 9之间。
你可以把它想象成一个喜欢“平淡”生活的家伙，既不喜欢酸酸的环境，也不喜欢太碱的环境。
就像是生活在一个平衡的世界里，大家都友好相处，工作才能高效。
要是pH值变得过于酸性或者碱性，它的工作效率可能会大打折扣，甚至可能“罢工”。
3. 应用场景：从食品到工业3.1 食品领域枯草芽孢杆菌蛋白酶在食品行业里那可是个明星。
特别是在奶制品加工中，它的作用尤为突出。
比如在制作奶酪时，它能帮助将牛奶中的蛋白质分解，生成奶酪所需的凝乳。
说得更形象一点，这就像是给牛奶来一次“大改造”，让它变身成美味的奶酪。
还有在蛋白质饮料的生产中，它同样能发挥重要作用，帮助提升饮料的口感和营养价值。
可以说，没有它，许多我们喜爱的食品可能都不那么完美了。
中性蛋白酶
中性蛋白酶介绍
中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经深层发酵提炼而成的固体酶制剂，在中性条件下能将大分子的蛋白质水解成氨基酸等产物，可直接用于啤酒、食品、饲料、化妆品、营养保健品及相关行业的蛋白质分解。
中性蛋白酶特性
外观：黄褐色粉末
温度：适应范围 37-59℃，最适温度 40-45℃
气味：无异味
pH值适应范围 6.8-8.0
执行标准 QB1805.3-93
中性蛋白酶规格
中性蛋白酶为固体酶活力为50000 U/g、100000U/g.
酶活力单位定义：反应温度40℃，pH4.6条件下，在1h内水解1mg淀粉所需要的酶量。
中性蛋白酶的应用
1.动物蛋白分解：使用该酶可以降低鱼类、肉类等动物体的粘度，促使蛋白质分解为肽类和氨基酸。
2.植物蛋白分解：可用于豆奶，速溶豆粉生产。
3.动物血液处理：使用该酶处理血液中的红细胞，可以得到脱色的、可溶性的血水解物，用作代血浆或加到食品中去。
4.饲料上的应用：可将酶制剂加入饲料后，使物料在酶的作用下得到一定的降解。
中性蛋白酶包装及存储
本产品为1kg/铝箔袋、25kg/袋，也可根据客户需要更换包装。
中性蛋白酶应存放于阴凉干燥处，避免阳光直射。
本产品含有活性物质，在低温下（25℃以下，但不能冷冻）贮存时，其活性可保持相当长时间。
中性蛋白酶供应地
中性蛋白酶联系方式。
枯草芽孢杆菌发酵鱼粉产蛋白酶及其酶解效果
枯草芽孢杆菌发酵鱼粉产蛋白酶及其酶解效果卢珍华【摘要】为开发以鱼粉为原料的优质饲料蛋白源以及相关保健食品,开展了用不同鱼粉为氮源发酵枯草芽孢杆菌生产蛋白酶及其酶解效果的研究,比较了不同菌种的发酵效果,确定了最佳发酵时间.通过蛋白酶活性测定和氨基态氮含量测定分析了不同菌种的产酶能力和酶活性大小及其酶解效果.结果表明,用罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵商业化的工业菌种枯草芽孢杆菌产生的酶活性显著高于鲢鱼鱼粉（P 〈0.05）,发酵后上清液中的氨基态氮含量也显著高于鲢鱼鱼粉（P〈0.05）,即工业化的枯草芽孢杆菌对不同鱼粉的发酵效果不同,罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵效果显著优于鲢鱼鱼粉.%To get higher enzymatic activity of proteases produced by Bacillus subtilis by fermentation,different fish meals were used as nitrogen sources.The effects of fermentation time,as well as the difference between commercial and field strains on enzymatic activity were compared.The content of amino nitrogen in the broth of fermentation was also determined.The results suggested that commercial strain showed a better performance in the fermentation with the fish meal of tilapia and codfish compared to silver carp.During the fermentation of Bacillus subtilis using tilapia and codfish meal as nitrogen sources,higher enzymatic activity and content of amino nitrogen were observed.【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(017)004【总页数】4页(P265-268)【关键词】枯草芽孢杆菌;鱼粉;蛋白酶;氨基态氮【作者】卢珍华【作者单位】集美大学生物工程学院,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】Q51微生物蛋白酶均为胞外酶，与动植物源蛋白酶相比，它具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单快速的特点，具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，同时易于实现工业化生产［1］.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是生产碱性蛋白酶的传统菌株，具有产蛋白酶量大，耐高温、高碱等特点，因此，对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点［2］.鱼粉是动物饲料中优质的蛋白质来源，同时，随着生物技术的发展，越来越多的以鱼粉为基础的酶解发酵产物如寡肽等被证明不仅发挥营养作用［3］，而且具有提高免疫力，改善动物胃肠道菌群结构等功能.并且极有可能作为保健食品的功能因子应用于保健食品，改善人的免疫力或辅助治疗高血压、糖尿病等［4］.本文通过比较不同来源枯草芽孢杆菌及其不同发酵条件下不同鱼粉的发酵效果，以探索获得高效蛋白酶及其酶解产物的途径.枯草芽孢杆菌由集美大学生物工程学院发酵实验室提供，有工业菌种和非工业菌种2种.种子培养基(质量分数):牛肉膏1.0%，葡萄糖1.5%，NaCl 0.5%，pH=7.2，121℃蒸气灭菌20 min;发酵培养基 (1000 mL):牛肉膏0.1 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉1.0 g，葡萄糖0.5 g，氮源分别选择加工处理过的鳕鱼(Gadoux macrocephalus)、干燥的罗非鱼(Tilapia mossambica)、新鲜未干燥的鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)鱼粉各6 g，水，pH=7.2，121℃蒸气灭菌20 min.7200紫外可见分光光度计 (上海第三分析仪器厂);HH.B11型恒温培养箱 (上海跃进医疗器械厂);HQ45B型恒温摇床 (上海科学院武汉科学仪器厂);SP－DJ系列垂直净化工作台 (上海浦东伟普净化设备厂);WH－1漩涡混合器 (上海沪西分析仪器厂);PHS－2C精密酸度计 (上海雷磁仪器厂).从甘油管中取出保存的菌种，以划线形式接种于含氯霉素的固体培养基平板上，在37℃培养箱中培养约24 h.从平板上挑取单菌落接种于种子培养液内，37℃培养6 h.然后以10%接种量转接到含有50 mL培养液的250 mL三角瓶中，37℃培养. 取发酵液于4000 r/min离心20 min，取上清液，采用Folin酚法测定蛋白酶活力［5］.酶活力单位定义为:在55℃、pH=10.0条件下，1 min水解干酪素产生1 μg酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位，以U表示.样品的酶活力/(U·mL－1)=4AKn/10=2AKn/5.式中:A为样品平行实验的平均吸光度值;K为吸光常数，取134;n为稀释倍数.样品液5 mL，加蒸馏水30 mL，用0.1 mol/L的NaOH溶液中和至pH=7.5，加入中性甲醛溶液10 mL摇匀，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至pH=9.2，根据消耗NaOH溶液毫升数计算氨基态氮含量.利用单因素方差分析法分析不同菌种、不同时间及不同氮源的发酵效果，差异显著则进行多重比较，应用SPSS17.0软件进行分析.以鳕鱼鱼粉为主要氮源，比较工业菌种和非工业菌种发酵后蛋白酶的活力，其结果如图1所示.工业菌种发酵44、52、60 h取样的蛋白酶活力显著高于非工业菌种(P＜0.05).以鳕鱼鱼粉为氮源，工业菌种发酵，考察发酵时间与发酵产物蛋白酶活力的关系，其结果如图2所示.由图2可见，酶活力在发酵52～56 h达到最大，显著高于发酵48 h或60 h(P＜0.05).工业菌种发酵55 h，考察对加工处理过的鳕鱼鱼粉、干燥的罗非鱼鱼粉及新鲜未干燥的鲢鱼鱼粉的发酵效果，分别测定酶活力及发酵上清液中的氨基态氮.结果表明，枯草芽孢杆菌对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵中酶活力显著高于鲢鱼鱼粉(P＜0.05)(见图3);枯草芽孢杆菌对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵后上清液中的氨基态氮含量显著高于鲢鱼鱼粉(P＜0.05)(见图4).说明，工业化的枯草芽孢杆菌在本实验条件下，对不同鱼粉的发酵效果不同，对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉的发酵效果显著优于鲢鱼鱼粉.研究表明，工业化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶的能力显著优于天然菌株，而工业化的枯草芽孢杆菌对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉的发酵效果显著优于鲢鱼鱼粉.鱼粉是以蛋白质为主要成分的混合物，除氮源外的其他成分如碳源、添加剂等都对枯草芽孢杆菌的产酶能力有重要影响.发酵效果的主要表征即寡肽和氨基态氮的形成取决于微生物蛋白酶的产生效率及不同蛋白质基质的特性［6－7］，其中，在微生物发酵过程中，氮源的主要作用是作为微生物细胞物质和含氮代谢物的氮素来源的营养物质，氮源作为枯草芽孢杆菌发酵培养基的一个主要因素，在芽胞的形成上发挥着重要作用［8］.不同的蛋白质基质是影响发酵效果的主要因素［9］，不同豆类蛋白质的发酵研究表明，大豆和经油榨工艺后的豆饼豆粕产寡肽和氨基态氮的能力显著高于其他豆类及其副产品［10－11］.本研究表明，罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉以及鲢鱼鱼粉作为不同的氮源，经工业化的枯草芽孢杆菌发酵后，罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉相对鲢鱼鱼粉表现较高的酶活力(P＜0.05)，上清液中的氨基态氮也显著高于鲢鱼鱼粉(P＜0.05).本研究还比较了不同菌株的发酵效果，工业化的菌株发酵效果显著优于自然菌株.相关研究报道了几株经基因重组技术改造的工业化菌株表达高活性的蛋白酶，显著提高了蛋白酶的活性和产量，利用该菌种进行的发酵试验表明，寡肽和氨基态氮均显著提高［12－13］.本研究明确了枯草芽孢杆菌对不同鱼粉的发酵效果，为以鱼粉为原料的生物技术饲料和功能保健食品的开发奠定了理论基础，后续的研究需要明确发酵产物中寡肽含量及其基本结构，明确发酵产物的主要营养及保健功能.【相关文献】［1］ SAEKI K，OZAKI K，KOBAYASHI T，et al.Detergent alkaline proteases:enzymatic 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武汉工商学院酶工程技术实训论文学院：环境与生物工程学院专业：生物工程年级：2014级学生：学号: 指导教师：职称：题目：枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化2017年6月18日目录摘要 (1)关键词 (1)Abstract (1)Keywords (1)1 中性蛋白酶 (2)1.1 中性蛋白酶的来源 (2)1.2 中性蛋白酶的意义 (2)1.3 枯草芽孢杆菌 (2)1.4 枯草芽孢杆菌的产酶特征 (2)1.5 枯草芽胞杆菌的形态特征 (3)1.6 研究目的 (3)2 实验材料与方法 (3)2.1 仪器设备和耗材 (3)2.1.1 仪器 (3)2.1.2 耗材 (3)2.2 枯草芽孢杆菌的筛选 (4)2.3 粗酶液的制备 (4)2.4 酶的分离纯化 (4)2.4.1 硫酸铵饱和度的选择 (4)2.4.2 蛋白酶活力测定 (5)2.4.3 透析及层析 (5)2.4.4 蛋白酶性质的测定 (5)3 结果与分析 (6)3.1 蛋白酶活力测定 (6)3.2 透析除盐 (7)3.3 柱层析分析 (7)3.4 酶作用的最适 pH (8)3.5 金属离子对酶活的影响 (9)3.6 化学试剂对酶活的影响 (9)4 结论与讨论 (10)参考文献 (11)枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化摘要中性蛋白酶作为一种生物催化剂已广泛用于食品、酿造、医药、纺织、制革等行业,本文对枯草芽孢杆菌的发酵产酶的提取质量条件进行了研究。
利用硫酸铵分级盐析，葡聚糖层析纯化后蛋白酶总活力为38694U，蛋白酶比活力为4960.8U/mg。
该酶的活力受到EDTA、异丙醇、乙醇抑制。
钙离子、镁离子对该酶有较好的保护作用关键词：枯草芽孢杆菌；中性蛋白酶；葡聚糖层析；分级盐析Extraction quality analysis of producing neutralprotease from Bacillus subtilisAbstractNeutral protease as a biological catalyst has widely for food, and brewing, and medicine, and textile, and leather, industry, will enzyme technology application to seafood condiment, hydrolyzed of production in the, can formed enzyme method processing of unique advantages, makes fermentation products production cycle greatly shortened, and improve protein using, for, I on Bacillus subtilis spore Bacillus (Bacillus Substilis) of fermentation produced enzyme of extraction quality conditions for has research.Keywords:Bacillus subtilis; neutral protease; Dextran chromatography;fractionation; salting out1中性蛋白酶1.1中性蛋白酶的来源蛋白酶是一类催化蛋白质肽键，生成蛋白胨、蛋白肽及氨基酸等产物的水解酶，其广泛分布于自然界的植物、动物和微生物中。
例如木瓜蛋白酶主要来自于植物木瓜，胰蛋白酶来自动物的胰腺，来自微生物的蛋白酶没有特定名称，例如有来自AS1.398枯草芽孢杆菌的蛋白酶，有来自宇佐美曲霉的蛋白酶等等，其中微生物来源的蛋白酶数量与种类最多，也最具研究、开发与生产价值。
随着水解条件之一的pH值的升高，蛋白酶分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，这也同时划分了它们应用的领域有所不同。
1.2中性蛋白酶的意义中性蛋白酶是指最适作用pＨ介于6.0～7.5之间的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。
中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于生产的，由于其具有催化反应速度快，无工业污染，催化反应条件适应性宽等性质和优点，被广泛地应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业错误!未找到引用源。
~[2]。
生产中性蛋白酶可以从动植物组织中提取，以植物作为蛋白酶的来源会受到一些诸如气候条件、可利用土地面积的大小等因素的影响，而以动物作为蛋白酶的来源，其产量的大小主要依赖于可被屠宰牲畜的数量。
由于从植物和动物中生产蛋白酶具有局限性，为了满足当今世界市场的需要，人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上。
本试验所采用的产中性蛋白酶菌株为枯草芽孢杆菌错误!未找到引用源。
1.3枯草芽孢杆菌枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产a-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
1.4枯草芽孢杆菌的产酶特征利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
1.5枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。
有芽孢0.6×1～1.5μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
1.6研究目的本次课题研究了枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的分离提取过程中的因素影响。
2实验材料与方法2.1仪器设备和耗材2.1.1仪器全温振荡培养箱（HZQ-Q 东联电子有限公司）、全温振荡培养箱（HZQ-Q 东联电子有限公司）、超净工作台（SW-CJ-IF 杭州净化设备公司）、电热压力蒸汽灭菌锅（LDZX-40SBI 上海申安医疗器械厂）、pH测量仪（PHSJ-4A 上海精密仪器厂）、DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱（上海宝曼生物科技有限公司）、SephadexG-100离子交换柱（上海宝曼生物科技有限公司）、低温离心机（LG10-2.4A 北京医用离心机厂）、电子分析天平（FC204 上海精密仪器厂）、100ml锥形瓶、接种铲、小刀、棉塞、报纸、橡皮筋、拇指管、移液枪、500ml烧杯、培养皿。
2.1.2耗材（1）固体培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂粉20.0g、水1000mL、121Mpa灭菌20min，备用。
（2）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中加入最终质量浓度1.5%的牛奶。
脱脂奶粉用水溶解后应单独灭菌（0.06Mpa,30min）,铺平板前再与加热融化的肉汤蛋白胨培养基混合。
（按照1:1混合）（3）液体培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、、水1000mL、121Mpa灭菌20min，备用。
（4）发酵培养基玉米粉4%，黄豆饼粉3%，磷酸二氢钠0.4%，磷酸二氢钾0.03%,3mol/L氢氧化钠，调节PH到9.0,0.1Mpa灭菌20min。
250ml三角瓶的装瓶量为50ml。
注意事项：玉米粉和黄豆粉不溶于水，培养基的配置过程中加热煮沸、PH调节及分装到三角瓶等环节注意用玻璃棒不断搅拌，保证培养基均匀一致。
筛选培养基：牛肉膏0.3g，NaCl 0.5g，酪素1.0g，琼脂2.0g，水100mL，pH7.6~8.0，0.1MPa 灭菌30min[1]。
2.2枯草芽孢杆菌的筛选培养：把活化后的枯草芽孢杆菌液在拇指管中分别稀释10-5、10-6、10-7三个浓度，分别用移液枪吸取10μL到平板上，并用涂布棒涂均匀。
放在37℃的恒温培养箱中培养24h。
初筛：挑选出能在牛奶筛选培养基上产生水解圈的单菌落接种到斜面培养基上，放入冰箱冷藏。
复筛：从冰箱中取出初筛得到的菌株,转接试管斜面活化,37℃下恒温培养24h.各取1环，接种到装液量为20mL基础培养基的50mL三角瓶中,在37℃条件下摇床培养24h.分别取各菌株发酵液10μL滴加在牛奶筛选平板中的滤纸片上(直径为12mm),然后将培养皿放入37℃的培养箱中培养24h ,取出后测量水解圈直径与菌落直径.重复此过程3次,取平均值,选取水解圈直径与菌落直径差值最大的菌落为实验菌种，接种到斜面培养基上备用错误!未找到引用源。
2.3粗酶液的制备将斜面30℃摇床培养48h后，按照2%接种量接入发酵培养基中，30℃、180r/min摇床培养于30℃培养48h。
将发酵液8000r/min冷冻4℃离心后取上清。
即为粗酶液，放入冰箱备用错误!未找到引用源。
2.4酶的分离纯化2.4.1硫酸铵饱和度的选择我们采用盐析法或有机溶液沉淀法来浓缩酶液，同时对酶有提纯作用。
取7只25ml锥形瓶分别加入处理好的酶液20ml，根据硫酸铵溶液饱和度计算表[5]，在粗酶液添加硫酸铵，分别使终浓度分别为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。
摇匀在4℃条件下静置过夜，等蛋白析出后用冷冻离心机12000r/min 离心20min ，经缓冲液透析后测上清液活力绘制硫酸铵盐析曲线错误!未找到引用源。
表 2-1硫酸铵盐析标准曲线L -酪氨酸浓度0 10 20 30 40 50 60 吸光度A 0 0.050 0.123 0.192 0.261 0.331 0.4062.4.2 蛋白酶活力测定 按部颁行业标准QB1805.3-93，采用Folin 法则测定错误!未找到引用源。
1ml 酶液在一定温度和pH 条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸的量为一个酶活力单位，以U 表示。
2.4.3 透析及层析收集盐析沉淀，用缓冲溶液稀释，然后在透析袋中低温透析，不断更换缓冲液，透析过程在低温下进行，一方面防止样品降解或变性，一方面也可以防止微生物的生长。
每隔10h 换一次溶剂，新的溶剂也要冷却。
避免样品变性。
用处理好的葡聚糖凝胶层析柱层析，并用凝胶处理液洗脱，绘制层析曲线，根据曲线收集各个峰，检测峰蛋白有无蛋白酶活性。