细胞破碎技术

革兰氏 阴性细菌 10-13 nm
酵母菌 100-300nm
霉菌 真菌 100-250nm
层次
单层
多层
肽聚糖 (5-10%) 脂蛋白 脂多糖(11-22%) 磷脂 蛋白质
多层
葡聚糖(30-40%) 甘露聚糖(30%) 蛋白质(6-8%) 脂类(8.513.5%)
多层
多聚糖 (80-90%) 脂类 蛋白质

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真菌的细胞壁



真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次 还含有较少量的蛋白质和脂类。 不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同， 其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚 糖构成，少数含纤维素。 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的 强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此， 它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所 以强度有所提高。
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外加酶法
酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根 据细胞的结构和化学组成来选择。 溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的 β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰 氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但 对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合 剂EDTA一起使用。 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主 要成分，所以也能采用溶菌酶， 酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几 丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤 维素酶裂解。
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路线一
路线二
清液－胞外产物
路线一A
本章内容
本章的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
包涵体的纯化方法
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概述
不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行 破碎。
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概述
阀座
阀杆 撞击环 阀杆 压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构简图
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高压匀浆法使用时注意事项



高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa 为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节 温度，使出口温度调节在20℃左右。 可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方 式。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎 的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用 多次循环的操作方法。
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不同机械破碎方法的比较
技术 原理 效果 成本 举例 细胞悬浮液大规 模处理
细胞悬浮液和植 物细胞的大规模 处理 细胞悬浮液小规 模处理
匀浆法 须使细胞通过的小 剧烈 适中 (孔型) 孔，使细胞受到剪 切力而破碎 珠磨破 细胞被玻璃珠或铁 剧烈 便宜 碎法 珠捣碎
超声波 用超声波的空穴作 适中 昂贵 法 用使细胞破碎 研磨法 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 匀浆法 (片型) 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中
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植物次生细胞壁
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生 细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚 (4μm以上)，常有三层组成。 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁 增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规 则，而且存在木质素的沉积。 因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植 物细胞具有很高的机械强度。
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1.高压匀浆法 （High-pressure homogenization）
采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。
细胞悬浮液自高压室针形阀 喷出时，每秒速度高达几百 米，高速喷出的浆液又射到 静止的撞击环上，被迫改变 方向从出口管流出。细胞在 这一系列高速运动过程中经 历了高速剪切、碰撞及压力 骤降，造成细胞破碎。
细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌
型生化物质（产品）的基础。
为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了
Hale Waihona Puke 解各种微生物细胞壁的组成和结构。
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4.1 细胞壁结构对破碎的影响
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
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2）珠磨法 bead mill


珠磨是常用的方法
细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨 剂（直径小于1mm）一起快速 搅拌或研磨，研磨剂、珠子 与细胞之间的互相剪切、碰 撞，使细胞破碎，释放出内 含物。 在工业规模的破碎中，常采 WSK卧式高效全能珠磨机 用高速珠磨机 24

高速珠磨机工作原理
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高压匀浆法-X-挤压器




改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至-25℃ 至-30℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击， 冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。 细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在 冰中的细胞变形所引起的。 主要用于实验室中。 优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉 碎程度低以及活性的保留率高 对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。
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3）超声波破碎



超声波破碎法利用超声波振荡器发射的1525kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介 质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超 声波的声频、声能有关。
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超声波破碎的机理


一般认为在超声波作用下液体发生空化作用 液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的 冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造 成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细 胞破碎。 操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外 部冷却的容器中进行。
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高压匀浆法适用的范围
—大规模细胞破碎的常用方法 ☆高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎； 料液细胞浓度可以很高，20%左右。 ☆不宜使用高压匀浆法。


易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀 浆阀）
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影响高压匀浆器细胞破碎因素
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细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围；
使细胞具有一定的形状和强 度。
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细菌细胞壁结构



破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构， 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存 在的肽键的数量和其交联的程度。 革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大 不同。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种 细胞生产了很多细胞重组的产物。
磨室内放臵玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器 高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃小珠相互搅动； 细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起 在出口处，旋转园盘和出口平 板之间的狭缝很小，可阻挡玻 离小珠，使不被料液带出。 由于操作过程中会产生热量， 故磨室还装有冷却夹套，以冷 却细胞悬浮液和玻璃小珠。
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n
4.2 细胞破碎技术
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细胞破碎方法及其原理
机械破碎 物理破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法 温度差破碎法 压力差破碎法 有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱 自溶法 外加酶制剂法
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化学破碎
酶促破碎
一 机械法
机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding） 超声波破碎法（ultrasonication）
JY92-II D超声波
细胞粉碎机
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超声波破碎的适用范围




超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数 微生物的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破 碎，对酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性 活性物质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大， 但在实验室小规模细胞破碎中常用。

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珠磨机破碎作用方程

破碎作用是相对于时间的一级反应速度 过程，符合下列公式：
ln[1/(1-R)]=Kt
R—破碎率；K—一级反应速度常数；t一 时间。 K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、 玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分 子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不 易分离而给后续操作带来的困难。
主要 肽聚糖(40-90%) 组成 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖(1-4%)
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植物细胞壁的结构

对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生 壁两部分。 初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～ 3μm），富有弹性。 由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半 纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许 多这样的长链形成微纤丝。 它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来 自于微纤丝。
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二
渗透压冲击 冻结和融化 干燥法
其中酶法和化学法溶胞应用最广。