酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）

概念：

1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？

pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？

各种SD培养基：

1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml) （？

“四缺”）

酵母氮源（YNB）：6.7g ;

-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;

葡萄糖 20g (即2%)

2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)

酵母氮源（YNB）：6.7g ;

-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）

葡萄糖 20g. (即2%)

3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）

酵母氮源（YNB）：6.7g ;

-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;

葡萄糖 20g (即2%)

4)SD/-leu (1000 ml)

酵母氮源（YNB）：6.7g ;

-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）

葡萄糖 20g (即2%)

5)SD/-trp (1000 ml)

酵母氮源（YNB）：6.7g ;

-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）

葡萄糖 20g (即2%)

注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。

实际配制的方法是：

1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃

以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（过滤即可使用）

2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（大约加10M NaOH

200ul即可），之后补水至950 ml。

3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。

YPD培养基(1000 ml)

20 g/L 蛋白胨

10 g/L 酵母提取物

20 g/L 琼脂（只有制作平板才用）

20 g/L 葡萄糖 (即2%)

1x YPDA培养基(1000 ml)

20 g/L 蛋白胨

10 g/L 酵母提取物

0.03 g/L 腺嘌呤（即终浓度为0.003％）腺嘌呤可以耐受高温

20 g/L 葡萄糖 (即2%)

实际配制的方法是：

1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃

以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml

腺嘌呤溶液加入。（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压）

3.（蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，

121℃高压15min。

注意：

◆高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可。

◆可以在YPDA中加入20 g/L的琼脂，以配成平板。

◆需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15 mg/L。（kanamycin可以20℃贮存一个月，

加入到平板中去可以4℃贮存一个月。）

PEG/LiAc溶液（即配即用）

用下列贮存液来配制

50% PEG 3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。

10X TE buffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。

10X LiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。

最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例）

终浓度为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质

PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEG

TE buffer 1X 1 ml of 10X TE

LiAc 1X 1 ml of 10X LiAc

无菌1x TE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释）

10x TE buffer :0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5(高压)

10x LiAc ： 1 M 用稀醋酸调节PH至7.5 高压

For β-galactosidase 滤膜实验

Z buffer溶液：

Na2HPO4•7H2O 16.1 g/L （如换Na2HPO4•14H2O 则20.739 g/L）NaH2PO4•H2O 5.50 g/L （如换NaH2PO4•2H2O 则 6. 21g/L）

KCl 0.75 g/L

MgSO4•7H2O 0.246 g/L

最后调PH至7.0，高压，室温下可以贮存1年

X-gal 溶液：

X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20 mg/ml.，–20°C避光保存

Z buffer/X-gal 溶液：

100 ml Z buffer

0.27 ml β-mercaptoethanol （β-巯基乙醇）

1.67 ml X-gal 贮存液

ONPG 溶液：（即配即用）

ONPG溶于Z buffer中，终浓度4 mg/ml，调PH至7.0.

注意：

1.ONPG需要1～2h才能溶解

2.每次用之前新鲜制备。

带有β-巯基乙醇的Z buffer

将0.27 mlβ-巯基乙醇加入100 ml Z buffer中即可

为了转化成功的小提示：

1.用一个1～3周龄（直径2～3mm）的菌落去接种液体培养基。如果菌落直径＜2mm，就用多几个菌落去接种。（也要大力涡旋使细胞团分散开来。）

2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。

3.当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞。

4.为了提高转化效率，要在1小时内准备酵母感受态细胞。如果有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低。

5.当进行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量必须过度，而AD质粒的量要不足。