免疫组化实验步骤及配方

免疫组化实验的详细步骤

免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。

准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。

免疫组化实验步骤及配方

免疫组化步骤1. 多聚甲醛灌流取材,多聚甲醛后固定,30%多聚糖溶液沉糖;2. 冰冻切片1d-14d 脊髓>=20μm;14d-28d>=10μm;DRGd=10μm3. 0.01MPBS 洗10min ×3次;4. 1NHCL 暴露抗原30min ；5. 去离子水洗,0.01MPBST 洗10min ×3次；6. 3%双氧水0.01MPBS 配制洗10min,灭活内源性HRP ；7. 0.01MPBST 洗10min ×3次；8. 5%-10%血清封闭30min0.01MPBST 配制；9. 一抗过夜,一抗用PBST 稀释；10.0.01MPBS 洗10min ×3次,二抗3孵育小时； 11.0.01MPBS 洗10min ×3次,HRP-亲和素3小时； 12. 0.01MPBS 洗10min ×3次,DAB 显色12-18min.免疫组化常用试剂配制1. 0.1MPB:14.5gNa 2HPO 4·12H 2O500mLH 2O1.5gNaH 2PO 4·2H 2O2. 0.1MPBS:500mL0.1MPB45gNaCl3. 0.01MPBST:100mL0.01MPBS10滴TritonX-1004.INHCL:盐酸：水=1：105.4%多聚甲醛：13.6gKH 2PO 43.6gNaOH40g 多聚甲醛1000mLH 2O注：1.需要60°C 加热溶解,过滤使用；2.多聚甲醛每次比需要多称10g,以弥补后面过滤的损失；3.现将多聚甲醛溶于1000mL 水中,然后一边加热搅拌一边缓慢加入多聚甲醛的助溶剂NaOH,待NaOH 和多聚甲醛都完全溶解后再加入KH 2PO 4,溶后过滤备用.6.DAB 液：以0..1MPB 配制,DAB 浓度0.05%,H 2O 2浓度0.03%.注：1.H 2O 2临用时再加；2.用DAB 染后用0.01MPB 洗.7.30%蔗糖：150g 蔗糖500mL4%多聚甲醛注：可同时沉糖后固定.8.封闭液：10%山羊血清做免疫荧光时另加0.1%BSA.。

免疫组化法实验操作步骤

免疫组化染色实验操作流程实验目的：观察标记物在细胞中的表达及分布。

一、病例资料和实验分组标本：经10% 福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4µm厚切片编号备用。

二、试剂及免疫组化方法2.1 实验试剂：xx两步法免疫组画试剂盒和DAB显色试剂盒进行组化染色。

抗体1,抗体2。

二甲苯、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇、30% H2O2、羊血清、Triton液、中性树脂等。

2.2 仪器(1)10µl、100µl、200µl、1000µl可调微量加样枪（2）4℃冰箱(3)光学显微镜(4)恒温水浴锅(5)恒温烤箱(6)电热蒸馏水器(7)LEICA显微镜及VISITRON照相系统(8)其他：量筒、电炉、高压锅、染缸、湿盒、脱蜡架、冲洗球、免疫组化笔等。

2.3 主要试剂的配置（1）0.01M PBS(PH7.4)缓冲液NaCl9.0 g磷酸氢二钠 2.901 g磷酸二氢钠0.296 g加入1000ml容量瓶，加ddH2O至1000ml定容。

充分混合（2）0.01mol/L柠檬酸盐溶液（PH 6.0）A液：0.1M柠檬酸溶液(4℃保存)29.01g柠檬酸1000mlddH2OB液：0.1M柠檬酸钠溶液(4℃保存)29.41g柠檬酸钠1000mlddH2O缓冲液现用现配（1000ml 0.01 mol/L）A液（18ml）+B液(82ml)900mldH2O充分混合，调整PH 6.0，充分混合，调整PH 6.0（3）3% H2O230% H2O2：甲醇=1：9(4)0.1%Triton的配制Triton原液0.1 ml0.01PBS液99.9ml4℃保存备用。

（5）5%羊血清的配制（1ml）羊血清50µl0.1%Triton 950µl4℃保存。

2.4 免疫组化方法(1)石蜡切片60℃烤箱烤片30min.(2)石蜡切片常规脱蜡二甲苯Ι15min -- 二甲苯Ⅱ15min -- 无水乙醇Ι15min -- 无水乙醇Ⅱ5min -- 无水乙醇Ⅲ5min -- 95%乙醇5min -- 90%乙醇5min -- 80%乙醇5min -- 70%乙醇5min -- 蒸馏水冲洗3min，浸泡待用（浸泡在什么溶液中？）。

免疫组化步骤

取组织：1.心脏灌注将小鼠在肋弓下缘剪开，夹住胸骨角，向上翻开，暴露胸腹膜，从右向左剪开胸腹膜，暴露心脏，剪开右心耳（在心尖靠右一点）插入针管，先打入10ml水，再注入10%甲醛约10ml，（可重复一次），至肝脏发白，四肢有抽搐为成功。

2.取脑取脑后放入4%多聚甲醛中，固定保存24h3.梯度脱水(不是必须步骤，但做的效果可能更好，但标本脱片是否与之有关系？)将脑放入5%蔗糖 48h----2.5%蔗糖 48h----1%蔗糖48h后放入4%多聚甲醛中，固定保存，制成切片。

4. 自制蜡块三步法，sp试剂盒，需要摸浓度，还有PBS自己配免疫组化1.常规石蜡切片，石蜡脱水60℃烤片30min脱蜡：二甲苯Ⅰ 5min二甲苯Ⅱ 10min无水乙醇—95%酒精Ⅰ—95%酒精Ⅱ—80%酒精各5sPBS液洗3次，每次5min2.抗原修复①枸橼酸盐微波修复（冷却与小火之间） 13min 室温冷却至常温②枸橼酸盐微波修复（冷却与小火之间） 2 x 10min（10min后加少许冷枸橼酸）室温冷却至常温（此步作为①未作出时的办法，最大可以尝试到3x 10min）③枸橼酸盐微波修复（高火） 4 x 6min 室温冷却至常温（此步作为①②均未作出时的办法）3. 3%H2O2 10min（买30%的回来自己稀释）PBS液洗3次，每次3min4.封闭用正常山羊血清工作液室温孵育20min5.一抗 4℃过夜，第二天将过夜片放入37℃温箱孵育1hPBS液洗3次，每次3min6.生物素化二抗工作液37℃温箱孵育 30minPBS液洗3次，每次3min7.辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃温箱孵育 30minPBS液洗3次，每次3min8.DAB显色（此步最重要，一定要摸出最佳显色时间，要浪费三张片子，一张显过了，一张未显出来，一张介于二者之间）9.自来水终止显色10.苏木素染色2min，自来水冲洗（8次以上，不能怕麻烦），盐酸酒精分化，自来水冲洗（6次以上），PBS返蓝20min（PBS要预热15min）11.脱水，透明（80%酒精—95%酒精Ⅱ—95%酒精Ⅰ—无水乙醇—二甲苯Ⅱ—二甲苯Ⅰ各5秒，就是将脱蜡反过来了）12.树胶封片（就滴很少，用手按压可以顺便将气泡压出，滴多了，树胶容易翻上盖玻片，那就麻烦了）注：95%酒精Ⅱ95%酒精Ⅰ二甲苯Ⅱ二甲苯Ⅰ都有卖的PBS自己配很划算（下页是配制方法）A液：0.1mol/L磷酸二氢钾：磷酸二氢钾（KH2PO4，MW136.09）1.361g，加双蒸水至100ml。

免疫组化步骤

免疫组化步骤1 切片脱蜡至水二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min、100%Ⅰ中5min、100%Ⅱ中4min、95%Ⅰ中4min、95%酒精Ⅱ中4min、85%酒精中4min、75%酒精中4min、蒸馏水4min*3（配制3%H2Ｏ2-甲醇溶液）；2 封闭将切片浸入3%HＯ2-甲醇溶液（1.5ml +48.5ml）中于37℃温箱中盖盖封闭30min；23 PBS（PH=7.4）浸泡3 min*3次，吸干周围水分，蜡笔圈住组织（保持组织湿润）；（解冻胰酶）4 抗原修复滴加0.25%的胰酶，放入湿盒，于37℃温箱中修复20min；5 PBS（PH=7.4）浸泡3 min*3次，吸干周围水分；6 封闭洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，滴加5%正常小牛血清（PBS稀释），放入湿盒，置于37℃温箱中封闭30min；7 一抗孵育吸去封闭液（勿洗），滴加按适当比例稀释的一抗后放入湿盒，4℃过夜（阴性对照用PBS替代一抗）；8 切片回温次日，将湿盒从冰箱中拿出室温回温40min；9 冲洗 PBS冲洗5min*3次；（配二抗）10 二抗孵育洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，滴加二抗，放入湿盒于37℃温箱中孵育1.5h-2h；11冲洗 PBS冲洗5min*3次；12 水洗将切片在蒸馏水中放2min；13 显色洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在组织上滴加DAB底物反应液，湿盒中避光显色（0.25ml buffer+12.5ul A+12.5ul B）；<1min14 水洗将切片在蒸馏水中放1-2min*3次；15复染切片经Mayer’s苏木素染液复染20-60s；16水冲流动自来水冲洗约3min；17脱水 100%酒精脱水5min*3次；18二甲苯透明、封片试剂配制1 PBS氯化钠8g +氯化钾0.2g+十二水合磷酸氢二钠3.63g+磷酸二氢钾0.24g，于1000ml蒸馏水中混匀；2 柠檬酸磷酸盐缓冲液0.1M 柠檬酸/枸橼酸：21.01g柠檬酸加入1000ml蒸馏水中0.1M柠檬酸钠/枸橼酸钠：29.41g枸橼酸钠加入1000ml蒸馏水中3 0.01M PH=5.0的柠檬酸磷酸盐缓冲液配制：9ml0.1M 柠檬酸/枸橼酸+41ml0.1M柠檬酸钠/枸橼酸钠，加入到450ml蒸馏水中混匀。

免疫组化(IHC)实验具体步骤及说明

免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明一、试剂和溶液乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液: 0.01M 的柠檬酸钠缓冲液：58.82g 柠檬酸三钠及7.56g 柠檬酸溶于200ml 纯水，调pH 至6.0，纯水1:100 稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9 稀释10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB 显色试剂盒：Cat. KT1002a 抗体稀释液：3%BSA-PBS 0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0-95.5%乙醇苏木素：苏木精2g 溶于250ml 无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml 纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠0.2g 和冰醋酸20ml二、实验步骤1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。

细胞免疫组化实验步骤

细胞免疫组化实验步骤细胞免疫组化实验步骤：1）脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。

而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。

PBS洗3次，3 min/次。

2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗3次，3 min/次。

3）抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。

这里常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。

（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。

PBS洗3次，3 min/次。

4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。

此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。

5）孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃1-2h。

PBS洗3次，3 min/次。

（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）6）孵育二抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的二抗20ul，37℃1-2h，PBS洗3次，3 min/次。

7）切片显色：用DAB-H2O2显色10min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。

8）复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用Mayer苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。

免疫组化操作过程精简版

二步法（无生物素PV6000系列），试剂A: 3% H2O2试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml （根据一抗宿主而定）免疫组化染色步骤1. 石蜡切片脱蜡和水化二甲苯1涮洗一下，二甲苯2中放置15min，接着在三个二甲苯中涮洗（脱蜡彻底表现为组织玻片透明光滑），之后2个100%乙醇，2个95%乙醇，1个85%乙醇中涮洗（时间不严格2min），蒸馏水涮洗2次（时间自己把握）。

2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。

高压修复：修复液于高压锅内加热煮沸后关火，待放入组织玻片后等高压锅放气后，中小火煮沸2.5min。

自来水冷却10min左右，蒸馏水洗2次。

3. 每张切片于3%H2O2中室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶的活性。

组化笔圈出组织，TBS（pH 7.4）冲洗4次，第一次短时涮洗，后三次每次时间3-5min。

若用胃蛋白酶修复，37℃10min。

4. 甩去TBS液，每张切片加1滴或50μl一抗（完全覆盖组织），室温（22℃左右）下孵育55min或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。

5. 蒸馏水涮洗2次，TBS(pH7.4)洗3-4次(时间不定)。

甩去TBS液，每张切片加1滴或50μl酶二抗聚合物(试剂B)，室温下孵25min。

（书上37℃30min）6. 蒸馏水涮洗2次，TBS(pH7.4)洗3-4次(时间不定)。

甩去TBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB，显微镜下观察10-15min （胞核胞质染色均一）。

7. 自来水中涮洗2次（棕黄色），放置于苏木素中复染1-2min，自来水中涮洗，之后可用0.1%HCl分化（75%乙醇配制）；温蒸馏水（40-50℃）放置2-3min返蓝(介于紫色和蓝色之间)。

8.梯度酒精脱水80%、95%×2、100%×2时间适当延长（2-3min）。

免疫组化操作步骤

免疫组化操作流程试剂准备1. PBS缓冲液（pH7.2～7.4）： NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。

即抗原修复液3.PBST: PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。

操作流程免疫组织化学染色SP法：1. 脱蜡、水化：脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。

从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟；无水乙醇中浸泡3分钟；95%乙醇中浸泡3分钟；70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）；50%乙醇中浸泡3分钟；自来水中浸泡3分钟；梯度脱蜡2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片）高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。

电磁炉1000W 2min。

3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。

5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。

目的为阻断内源性过氧化物酶)；6. PBST洗3次各3分钟(过三缸)7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。

用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。

免疫组化详细步骤

免疫组化步骤取组织、固定、制片(脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体一、取组织二、固定三、制片1、脱水透明的酒精梯度和时间70％酒精20min 80%酒精1h90%酒精1h 95％酒精Ⅰ2h95％酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min二甲苯酒精1：1 15min 二甲苯Ⅰ25min二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min2、浸蜡:石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h3、包埋四、切片烤片用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时五、脱蜡至水六、抗原修复配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸(不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却八、将玻片放置于塑料板上，滴加3％的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液,每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min十一、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB（二氨基联苯胺)，室温孵育2～10分钟，显微镜观察十三、苏木精复染:苏木精复染5min，水洗3min，0。

1%HCl浸提两次,水洗3min，反蓝液数秒，水洗十四、脱水透明：70％酒精3min、80％酒精3min、90％酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min十五、封片。

免疫组化过程

免疫组化的准备工作一．免疫组化用的液体的配置1．PBS的配置（PH7.2~7.6）蒸馏水4000ml氯化钠Nacl 36g磷酸氢二钠Na2HPO4.12H2O 24g磷酸二氢钠NaH2PO4.2H2O 1.6g2．0.01柠檬酸盐缓冲液的配置蒸馏水1000ml枸橼酸三钠C6H5Na3O7. 2H2O 3g枸橼酸C6H8O7.H2O 0.4g3．苏木素免疫组化实验方法实验步骤石腊切片：40℃过夜，60℃烤片1小时1．常规脱蜡至水：二甲苯（1）、（2）各10min，100%酒精（1）、（2）各5min，95%、85%、蒸馏水（1）、（2）各5min；2．抗原修复：枸橼酸缓冲液(Ph6.0)微波炉高火加热至沸，取出，放入玻片，低火维持30min；3．室温放置自然冷却，PBS冲洗5min*3次；4．3%过氧化氢in甲醇溶液，避光室温10min，去除内源性过氧化物酶；5．PBS冲洗5min*3次；6. 封闭：10%正常二抗血清37℃15min，甩干不洗；7．滴加稀释一抗（可先用1：100浓度），然后4℃过夜。

用PBS替代一抗作为阴性对照，约12-16小时；8．次日取出，室温放置10min，PBS洗5min*3次；9．滴加二抗，37℃30min；10．PBS洗5min*3次；11. 滴加HRP标记的链霉亲和素，37℃15min；12. PBS洗5min*3次；13.DAB显色：DAB按试剂说明书配置，镜下观察，至目的组织出现棕黄色阳性颗粒而周围组织无非特意显色时，蒸馏水终止；14．苏木素复染细胞核1-2分钟，1%盐酸乙醇分化数秒，镜下控制，自来水返蓝10min; 15．脱水、透明：85% 、95%、100%酒精（1）、（2）各2min,二甲苯（1）、（2）各5min,中性树胶封片。

石腊切片：40℃过夜，60℃烤片1小时1．常规脱蜡至水：二甲苯（1）、（2）各10min，100%酒精（1）、（2）各5min，95%、85%、蒸馏水（1）、（2）各5min；2．抗原修复：枸橼酸缓冲液(Ph6.0) 微波炉高火加热至沸，取出，放入玻片，低火维持30min；室温放置自然冷却，PBS冲洗5min*3次；3．3%过氧化氢in甲醇溶液，避光室温10min，去除内源性过氧化物酶；PBS冲洗5min*3次；4．封闭：10%正常二抗血清37℃15min，甩干不洗；5．滴加稀释一抗（可先用1：100浓度），然后4℃过夜。

蛋白实验技术——免疫组化实验步骤

蛋白实验技术——免疫组化实验步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种常用的分子生物学研究手段，用于检测和定位特定蛋白质在组织或细胞中的表达和分布情况。

以下是免疫组化实验的常见步骤：1.材料准备：-组织样本：一般使用福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。

-抗体：根据要检测的蛋白质选择特异性和高亲和力的一抗。

还需选取对该抗体特异性有所了解的阴性对照抗体作为对照。

-二抗：选择特异性与一抗结合的二抗，二抗常标记有荧光素、酶或金颗粒等。

-染色剂：包括染色素、转化底物和显色剂等。

2.样本处理：-脱蜡：将石蜡包埋的组织切片放置在58-60℃热箱中，反复浸泡于甲醇和乙醇中将石蜡脱除。

-抗原修复：使用热蒸汽或酶解剂等方法，将福尔马林固定的组织切片中的抗原开放，以方便抗体与抗原结合。

-除脂：用乙醚或甲醚等化学溶剂洗涤，去除脂肪质的干扰。

3.抗体处理：-阻断剂处理：使用阻断剂（如牛血清蛋白）阻断切片中非特异性结合位点。

-一抗处理：将选择的抗体稀释于阻断液中，加到组织切片上，保持温度和湿度有利于抗原结合。

-二抗处理：根据实验需要，选择将一抗特异性结合的二抗标记，加到组织切片上。

二抗的选择需要根据实验所用的检测方法进行确定。

4.检测与显色：-荧光染色：使用激光产生的特定波长的光源，观察组织中特异性荧光的发光。

-酶联免疫组化：在二抗的标记中常使用辣根过氧化物酶（HRP），添加辣根过氧化氢-二甲基氨基甲酸酯（DAB）进行染色反应。

-光镜观察：使用透射光镜观察染色的结果。

通过比较阳性对照和阴性对照组织切片，可以确定染色结果的特异性。

5.结果分析：-显微镜下观察：根据阳性对照组织切片和实验组织切片的染色情况进行观察和比较。

-计算和分析：可以根据染色结果的强度和程度进行定量研究，使用图像分析软件进行图像处理和数据分析。

此外，免疫组化实验还需要注意以下几点：-尽可能使用正常组织作为阳性对照，使用未加抗体或添加非特异性免疫血清的组织作为阴性对照，以确保实验结果的准确性。

免疫组化入门实验操作

免疫组化入门实验操作1.一、实验目的:2.了解免疫组化基本原理。

3.了解免疫组化实验操作及注意事项。

4.免疫组化结果判定。

通过实验, 让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项, 对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。

要求学生通过查阅文献, 在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。

二、实验原理:三、实验材料:一抗: CD5.CK8、Ki671.二抗: MaxVision32.其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB.孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶, 孵育盒。

3.四、实验步骤:4.脱蜡水化5.二甲苯5min, 二甲苯5min, 二甲苯5min, 无水乙醇2min, 无水乙醇2min, 95%酒精2min, 85%酒精2min, 自来水冲洗。

6.抗原修复7.高压锅中加入1200mL柠檬酸修复液, 电磁炉煮沸后放入切片, 扣紧锅盖,功率调至800W, 至压力阀均匀喷气后计时 1.5min, 移开高压锅室温冷却10min, 自来水冷却。

8.过氧化物酶阻断9.修复结束后, 流水冲洗干净, 除去自来水, 在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体, 滴加50 μL（一滴）过氧化物酶阻断剂, 室温孵育10min, PBS冲洗3×3min。

10.一抗11.甩去PBS, 纸巾擦干组织3mm外的残留液体, 每张切片加50 μL（一滴）相应一抗, 室温下孵育60分钟, PBS冲洗3×3min。

12.二抗13.甩去PBS, 纸巾擦干组织3mm外的残留液体, 每张切片加50 μL（一滴）MaxVisionTM试剂, 室温下孵育30分钟, PBS冲洗3×3min。

14.DAB15.甩去PBS液, 纸巾擦干组织3mm外的残留液体, 每张切片加50 μL（一滴）新鲜配制的DAB, 显色5分钟, 自来水冲洗。

16.苏木素复染17.每张切片滴加50 μL（一滴）苏木素, 20-30秒后自来水冲洗30s以上, 或浸泡于PBS中30s以上再自来水冲洗。

免疫组化实验报告

免疫组化实验报告一、实验目的本次免疫组化实验旨在通过特定的抗体标记和显色技术，检测组织样本中特定蛋白质的表达情况，从而为疾病的诊断、预后评估和治疗方案的制定提供重要的依据。

二、实验材料与方法（一）实验材料1、组织样本：本次实验所使用的组织样本为手术切除或活检获取的病理组织，包括肿瘤组织、正常组织等。

2、抗体：选用了针对目标蛋白质的特异性一抗和相应的二抗，一抗的来源和稀释比例根据实验要求进行选择。

3、显色试剂：如 DAB（3,3'二氨基联苯胺）显色试剂盒。

4、其他试剂：包括 PBS 缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、过氧化氢溶液、血清封闭液等。

（二）实验方法1、组织切片制备将获取的组织样本进行固定、脱水、包埋等处理，制成石蜡切片。

切片厚度一般为 4 5 微米，然后将切片贴附在载玻片上。

2、脱蜡和水化将切片放入二甲苯中进行脱蜡处理，依次经过高浓度到低浓度的乙醇进行水化。

3、抗原修复采用热修复或酶修复的方法，使抗原表位暴露，以提高抗体的结合效率。

4、灭活内源性过氧化物酶切片浸泡在过氧化氢溶液中，以消除内源性过氧化物酶的活性，避免非特异性显色。

5、血清封闭用适当比例的血清封闭非特异性结合位点，减少背景染色。

6、一抗孵育将切片与稀释后的一抗在适当温度下孵育一定时间，使一抗与目标蛋白质结合。

7、二抗孵育去除一抗后，加入与一抗对应的二抗，继续孵育。

8、 DAB 显色加入 DAB 显色试剂，在显微镜下观察显色情况，控制显色时间，以获得最佳的显色效果。

9、复染用苏木精对细胞核进行复染，使细胞结构更清晰。

10、脱水、透明和封片依次经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明，最后用中性树胶封片。

三、实验结果（一）阳性对照阳性对照组织样本显示出明显的特异性染色，表明实验所用的抗体和显色系统工作正常。

（二）实验组1、肿瘤组织在肿瘤组织中，观察到目标蛋白质在肿瘤细胞中的表达情况，包括表达强度（强阳性、弱阳性或阴性）和表达模式（弥漫性、局灶性等）。

免疫组化试验步骤

免疫组化试验步骤1.标本的制备2.抗原复性与预处理标本制备后，需要对其进行脱蜡或脱冻处理以使抗体能够与抗原结合。

对于石蜡包埋样本，可以使用脱蜡液将蜡去除。

对于冷冻固定标本，可以将其浸泡在PBS等缓冲液中进行脱冻处理。

3.抗体选择与标记选择适当的一抗体来检测目标抗原。

一抗体可以来自动物源（如小鼠、兔子等），也可以是人源单克隆抗体。

一抗体通常需要与标记物结合以便于检测。

常用的标记物有酵素（如辣根过氧化物酶(HRP)）、荧光标记物（如荧光蛋白、荧光染料）、金标记物等。

标记后的抗体通过特异性抗原与其结合。

4.抗原检测将标记后的抗体加入标本中，使其与目标抗原结合。

可以选择直接检测法或间接检测法。

直接检测法中，标记的一抗体直接与目标抗原结合。

间接检测法中，先加入与目标抗原特异性结合的一抗体，再加入与一抗体特异性结合的二抗体。

二抗体同样需要进行标记。

5.可视化根据标记物的不同，可以采用不同的可视化方法。

对于酶标记物，可以通过酶底物的显色反应来观察染色结果。

对于荧光标记物，可以使用荧光显微镜观察荧光信号。

对于金标记物，可以利用金溶液的特异性反应观察金颗粒的形成。

6.分析与结果解读观察标本中的染色结果，并通过显微镜或图像分析系统获取图像。

对于定性分析，可以通过比较标本中目标抗原的染色强度与阴性对照进行评估。

对于定量分析，可以使用图像分析软件对染色强度进行定量分析。

7.结果解释与报告根据染色结果，结合临床资料和病理学知识进行结果解释，并将结果记录在报告中。

报告应清晰准确地描述染色结果，包括阳性与阴性反应的程度和分布等信息。

总结起来，免疫组化试验的步骤包括标本制备、抗原复性与预处理、抗体选择与标记、抗原检测、可视化、分析与结果解读以及结果解释与报告。

通过这些步骤，可以对组织和细胞中的目标抗原进行定性和定量分析，为生物医学研究和临床诊断提供重要的信息。

免疫组化操作规程及操作流程

免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。

三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。

2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。

3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。

配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。

免疫组化试验方法

免疫组化试验方法（编辑整理：雷小灿2013/10/15）一、主要步骤一）溶液试剂的配制二）石蜡切片的免疫组化处理三）冰冻切片的免疫组化处理四）免疫组化试验步骤二、具体实验操作步骤一）溶液试剂的配制1．1×PBS：Na2HPO412.32g, NaH2PO41.12g, NaCl 3.4g, 溶于400mlDEPC 水，定容至500ml，高压灭菌。

PBST即1L PBS加1ml Tween-20即可。

2．3%甲醇双氧水：吸取10ml 30%的双氧水，加入90ml 100%纯甲醇，即为3%甲醇双氧水檬酸溶于1000ml的蒸馏水中。

3．pH6.0柠檬酸钠抗原修复液：A液：0.1M 柠檬酸缓冲液：称取21.01g 柠酸钠溶于1000ml的蒸馏水中。

B液：0.1M 柠檬酸钠缓冲液：称取29.41g 柠檬酸溶于1000ml的蒸馏水中。

工作液：取9ml A液和41ml B液，加入450ml蒸馏水中，pH值即为6.0。

4．苏木精染液：I 铵钒30g，蒸馏水400ml，II 苏木素4g，纯乙醇25ml，III 甘油100ml，甲醇100ml。

（亦可购买使用）配法：1）将铵钒直言播种捣碎，溶于400ml蒸馏水中，加温至40~50℃。

2）将苏木素溶解于纯乙醇中，充分振摇使其完全溶解。

3）I与II混合导入玻璃瓶中，臵于光线充足处，一周后过滤。

4）将甘油和甲醇加入到过滤好的I和II混合液中，盖好瓶塞，外包黑纸，臵于室温较低处使其成熟，成熟后的苏木精为紫黑，成熟时间约为1~2月。

5. 不同浓度酒精的配制：用蒸馏水和纯酒精配制70%酒精，85% 酒精，90% 酒精，95%酒精，100%酒精，100%酒精：二甲苯=1:1，二甲苯。

二）石蜡切片的免疫组化处理1.脱蜡之前防脱：取APES 2ml加入到98ml纯丙酮中混匀，之后将切片放入进去，作用2min，之后于纯丙酮中洗去APES，风干即可进行脱蜡。

注：1. 切片在APES中作用90s时开始移至纯丙酮中作用30s。

免疫组化实验步骤

免疫组化实验步骤1.血样制备：-采集血液样本，离心分离血浆或血清。

-用PBS洗涤血浆或血清，去除杂质。

2.组织固定：-采集待检组织样本，用缓冲福迪液进行固定。

常用的福迪液包括4%的甲醛和10%的中性缓冲福迪液。

-将组织固定在玻片上，通常通过石蜡包埋来保护组织样本。

3.切片：-使用旋转式或电动切片机将固定的组织切割成5-10μm厚的切片。

-将切片放置在带有去福迪剂密封的玻片上，然后进行脱脂和重水处理。

4.抗原恢复：-将切片浸泡在适当的抗原恢复缓冲液中，以恢复切片中的抗原结构。

-常用的抗原恢复方法包括热敏感抗原恢复、酶消化抗原恢复和酸碱抗原恢复等。

5.阻断非特异性结合位点：-使用适当浓度的蛋白抑制剂（如牛血清蛋白）在切片上进行阻断，防止非特异性结合。

-将切片在室温下孵育一段时间，以使蛋白抑制剂有效阻断非特异性结合。

6.抗体染色：-添加特定的初级抗体到切片上，与待检测的特定抗原结合。

-孵育切片，使初级抗体与抗原结合。

-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的抗体。

7.信号放大：-添加合适的二级抗体到切片上，与初级抗体结合。

二级抗体可标记有荧光染料、酶或金粒等。

-孵育切片，使二级抗体与初级抗体结合。

-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的二级抗体。

8.检测与成像：-根据二级抗体标记的方式，使用合适的检测方法进行信号放大。

-如果使用荧光标记的二级抗体，可以利用荧光显微镜观察和拍摄图像。

-如果使用酶标记的二级抗体，可以使用底物和显色试剂进行检测和成像。

9.结果分析：-观察并分析免疫组化染色结果，评估抗原的定位和表达情况。

-可以使用计算机图像分析系统进行定量分析和比较。

10.结论和报告：-根据实验结果，得出结论并撰写实验报告。

-将实验结果与已知文献资料进行对比和解释，讨论可能的研究价值和应用前景。

注意事项：-实验过程中需严格遵守无菌操作规范，以避免交叉污染和误差。

-选用合适的正对照和阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。

免疫组化实验步骤及配方

免疫组化实验步骤及配方免疫组化实验是一种用于检测和定位特定蛋白质在细胞、组织或器官中表达的技术。

免疫组化实验包括一系列步骤，如抗原修复、非特异性结合抑制、免疫原和次级抗体处理、显色/荧光染色等。

下面将详细介绍免疫组化实验的步骤及配方。

1.抗原修复：抗原修复是为了恢复因组织固定而引起的抗原性损失。

一般使用高温或酶解方法进行抗原修复。

-高温方法：将组织切片置于高温缓冲液中加热，一般在95°C下加热15-20分钟。

-酶解方法：如胰酶消化、蛋白酶消化等。

例如，可以使用0.1%胰酶在37°C下进行酶解。

2.非特异性结合抑制：非特异性结合抑制是为了防止免疫试剂（如次级抗体）与非特异性蛋白结合，从而降低假阳性结果。

一般使用正常动物血清或胶体等进行非特异性结合抑制。

-正常动物血清：根据动物源种类（如小鼠、兔子等）选择相应的正常动物血清。

-胶体：如牛血清蛋白、牛血清白蛋白等。

可以在最终稀释液中加入1-2%的胶体。

3.免疫原处理：免疫原处理是为了增强目标抗原与抗体的结合效率，一般通过与次级抗体或酵素结合。

根据具体实验需求，可以选择荧光标记、酶标记或金标记等不同的方式进行免疫原处理。

-荧光标记：如荧光素等。

-酶标记：如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。

-金标记：如胶体金、纳米金等。

4.次级抗体处理：次级抗体处理是为了增强免疫原与目标抗原之间的结合效应。

一般使用来自其他物种的抗体作为次级抗体。

根据不同实验需求，可以选择与荧光标记、酶标记或金标记结合的次级抗体。

-荧光标记：如青蒿素标记的抗兔荧光标记抗体等。

-酶标记：如HRP标记抗体、AP标记抗体等。

-金标记：如碳标记抗体、金标记抗体等。

5.显色/荧光染色：显色/荧光染色是为了可视化目标抗原的分布和定位。

根据不同的免疫标记试剂，可以选择适当的染色方法。

-显色：如DAB（3,3'-二氨基联苯）染色。

-荧光染色：根据使用的荧光标记试剂选择相应的染色方法，如DAPI 染色、FITC染色等。

免疫组化详细配方及步骤

免疫组化详细配方及步骤
免疫组化液体配制
1.封闭液（0.3％H2O2溶液）：
2. 洗涤液（0.1M磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2－7.4））现在洗液改用蒸馏水
3.柠檬酸抗原修复液(pH6.0)
A液
免疫组化步骤
1．石蜡切片常规脱蜡至水。

2．切片浸入0.3％H2O2封闭液置于摇床封闭15分钟，蒸馏水摇洗3min×3遍；
3．抗原修复：
A：高压修复(有时易掉片)：加热修复液至沸腾后降功率至800瓦，
将切片放入加盖,至喷气开始计时2分半后停止加热。

置空气或水浴中缓慢冷却40分钟，温度降至室温左右时开锅洗涤，蒸馏水摇洗3min×3遍；
B：酶抗原修复，切片蜡笔划圈，滴加酶消化液50-100ul。

37℃消化60分钟（掌握时间）后蒸馏水摇洗3min×3遍。

4．滴加稀释后的一抗50-100ul（依据组织大小计算），湿盒37℃1小时，或4度过夜。

5. 蒸馏水洗涤3min×3遍。

；
6. 滴加二抗复合物，每张切片50-100ul，室温60分钟。

7. 蒸馏水摇洗3min×3遍，等待显色；
8. DAB配制：B液和C液按50：1混合配制后，加到玻片组织上显色，显微镜下观察至阳性结果出现而背景尚未着色时及时中止显色，蒸馏水反复冲洗（勿直接冲洗组织，防止脱片）；
10．苏木素复染15min后冲洗，盐酸酒精分化至淡蓝色后冲洗，温水反蓝5min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

注意：操作中的任何一个步骤不应出现切片表面干燥的现象，否则容易出现阴阳脸或者假阴性。