影响黑曲霉产糖化酶和蛋白酶的主要营养因素
黑曲霉发酵产酶研究进展
黑曲霉发酵产酶研究进展张熙;韩双艳【摘要】黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉属真菌中的常见种,它生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素,是美国FDA认证安全菌种(GRAS)之一,也是重要的酶制剂生产菌种.综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展,并展望了其广阔的应用前景.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2016(033)001【总页数】4页(P13-16)【关键词】黑曲霉;酶;发酵产酶【作者】张熙;韩双艳【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q939.97黑曲霉(Aspergillus niger)，属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是丝状真菌的一个常见种，广泛分布于粮食、植物产品和土壤中。
人类运用黑曲霉的历史悠久，早在中国古代，人们就利用黑曲霉制作酱料、酱油、米酒等。
由于黑曲霉生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，被美国FDA认证为安全菌种(GRAS)。
黑曲霉具有很强的外源基因表达能力及高效的蛋白表达、分泌和修饰能力，同时重组子具有很高的遗传稳定性。
随着越来越多的外源蛋白在黑曲霉成功表达，且被证明具有较高的产量和活性，黑曲霉成为了一个重要的酶表达体系，也逐渐成为重要的工业酶制剂生产菌种[1]。
据报道，黑曲霉可生产纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果胶酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等多种酶。
作者综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展，并展望了其广阔的应用前景。
纤维素是地球上分布最广泛的一类碳水化合物，也是最丰富的可再生资源，但因其结构复杂、降解难度大，还未实现有效的转化利用。
纤维素酶由葡聚糖内切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(β-BG)构成[2]，主要用于水解纤维素的β-1,4葡萄糖苷键，使纤维素分解成短链糖。
两种曲霉糖化性子的比较
两种曲酶糖化性质的比较研究在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。
但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。
鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。
黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。
黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。
黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。
根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。
它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。
美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。
我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。
黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。
总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。
米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。
在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。
1 材料与方法1．1材料菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-41．2培养基种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液体深层发酵液）1．3试剂1．33%可溶性淀粉；碘液；0.01MNacl-HAC缓冲液；6NHCL；DNS试剂；葡萄糖标准溶液1．4实验仪器电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司，DK-8D）；721型分光光度计（上海欣茂仪器有限公司，2C409035）；立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂，LDZX-75KB)；恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司，DHP060)；气浴恒温摇床（太仓市实验设备厂，TCYQ）。
酶工程 第三章酶的发酵生产 第三节发酵工艺条件及控制
第三节 发酵工艺条件及控制
无机元素是通过添加无机盐来提供的，一般采用水溶 性的硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐等。有时也使用硝酸盐，在 提供无机氮的同时，提供无机元素。
4．生长因素 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化 合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动 植物生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分；嘌呤 和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分；维生素主要起辅酶作用； 动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分 裂起调节作用。有的细胞能够自己合成各种生长因素，而 有的细胞则缺少合成一种或多种生长因素的能力，需由外 界供给，才能正常生长繁殖，这样的细胞称为营养缺陷型。
第三节 发酵工艺条件及控制
在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵 母膏等，以提供各种必需的生长因素。有时，也加进纯化 的生长因素，以供细胞生长繁殖之需。
现举例几种酶发酵培养基： （1）枯草杆菌BF7658α—淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氧化钙 0.2%，氯化铵0.15%。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米 粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%， 磷酸二氢钾0.03%。 （3）黑曲霉糖化发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%， 麸皮1%（PH4.4—5.0）。
第三节 发酵工艺条件及控制
不同细胞生长繁殖的最适PH有所不同。一般细胞和放 线菌的生长最适PH为中性或微碱性（PH6.5—8.0）；霉菌 和酵母的生长最适PH为偏酸性（PH4.0—6.0）；植物细胞 生长的最适PH为5—6。
不同碳源对黑曲霉产糖化酶活力的影响
于 ４℃，６０００ｒ／ｍｉｎ，离心 １０ｍｉｎ，取上清液即为粗酶液。
１．２．２ 培养方法
１．２．２．１ 斜面培养 将保存的菌种接种到斜面培养基上，于 ３３℃下恒温
培养 ９ ６ ｈ ，备用。
１．２．２．２ 察氏半干体培养基培养 挑取培养好的斜面菌种接种于察氏半干体培养基，
于 ３ ３ ℃下恒温培养，每天摇 ４ 次，使菌体分散。培养 ２ １ ６ ｈ ，备用。
１．２．２．３ 发酵摇瓶培养 把发酵摇瓶培养基装入 ２５０ｍｌ 三角瓶中，装液量为
８０ｍｌ。按 ５％ 接种量把半干体培养基接种于发酵摇瓶培 养基中，于 ３ ３ ℃下恒温摇床培养，转速为 ２ １ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 。
２．２ 不同碳源培养基的细胞生物量 碳源不同，黑曲霉生长状况也不同。在六种碳源
１ ｇ 、Ｋ Ｃ ｌ ０ ． ５ ｇ 、Ｍ ｇ Ｓ Ｏ ４·７ Ｈ ２Ｏ ０ ． ５ ｇ 、Ｆ ｅ Ｓ Ｏ ４·７ Ｈ ２Ｏ ０．０１ｇ、琼脂 ５ｇ、蒸馏水 １ ０ ０ ０ ｍ ｌ ，自然 ｐＨ。
发酵摇瓶培养基：碳源 １０ｇ 、ＮａＮＯ３ ２ｇ 、Ｋ ２ＨＰＯ ４ １ ｇ 、Ｋ Ｃ ｌ ０ ． ５ ｇ 、Ｍ ｇ Ｓ Ｏ ４·７ Ｈ ２Ｏ ０ ． ５ ｇ 、Ｆ ｅ Ｓ Ｏ ４·７ Ｈ ２Ｏ ０．０１ｇ、蒸馏水 １０００ｍｌ，自然 ｐＨ。
糖化酶又称葡萄糖淀粉酶（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ， ＥＣ ３． ２． １． ３ ） ，是一种外切型糖苷酶，从淀粉的非还原性末端依次 水解α－１，４ 糖苷键，水解下一个个葡萄糖单元，工业上 用于将淀粉转化为葡萄糖，因而广泛地用于制药、制 酒及氨基酸、有机酸行业，是最重要的工业酶制剂之 一［ １ － ２ ］ 。黑曲霉是生产糖化酶的重要菌株之一，碳源对 黑曲霉产糖化酶活力有很大影响［３－４］。在筛选高产糖化酶 的黑曲霉菌株及黑曲霉诱变育种中，碳源不仅影响黑曲 霉生长繁殖，也严重影响黑曲霉产糖化酶活力。研究 不同碳源对筛选获得的黑曲霉菌株产糖化酶的影响，对 进一步选育高产黑曲霉菌株及菌株培养条件优化具有重 要的理论及实践意义。
黑曲霉诱变产糖化酶
诱变黑曲霉提高糖化酶的生物合成摘要现今，筛选黑曲霉主要通过物理和化学突变。
用溴化乙錠和甲基磺酸乙脂（EMS）轮流处理亲代菌株。
这株突变菌株M4能产生更多的糖化酶。
简介糖化酶时淀粉工业中最重要的一种酶。
它能将淀粉水解成葡萄糖。
葡萄糖在各种食品行业中是一种必要的合成原料。
糖化酶广泛地应用于酿造，造纸，食品，制药，纺织行业中。
黑曲霉通过液态或固态发酵生产糖化酶中，食物残渣也能被利用到。
同时，食物残渣也能用于葡萄糖和啤酒行业中。
糖化酶是一种微生物的胞外酶，并且，它典型的性质是水解a-1，4和a-1，6糖苷键，通过其他酶作用于淀粉合成糖类。
糖化酶能水解非还原端的a-1，4葡萄糖苷键。
糖化酶能被成倍的生成，通过引起野生菌株突变。
据报道，黑曲霉的突变菌株能更好地生产糖化酶。
这种黑曲霉菌株能被紫外线照射或者化学的方法诸如N-甲基，N-硝基，N-亚硝基胍，硫酸二甲脂，甲基磺酸乙脂，溴化乙錠和亚硝酸来引诱突变，提高糖化酶产量。
突变菌株产糖化酶的特性能更好地影响对生淀粉的处理。
生产糖化酶的突变菌株在r-射线的处理下，亲代菌株的特性被改善并且产物乙醇的产量也被提高了。
这个突变黑曲霉是用联合诱变处理的，它产的糖化酶能将麦芽糊精转变为葡萄糖。
多重的轮流突变对葡萄糖的生成有着很好的影响。
糖化酶的比活度和它的热稳定性被提高。
并且，结果通常是提高葡萄糖产量。
对比几种黑曲霉突变株的酶产量和它们的特性，相比于野生株，突变株能更高水平地生产糖化酶。
但是，不管使用怎样的菌株，对所有糖化酶来说，酶的组成和特性都是类似的。
Britly进行本研究的目的是为了证明以小颗粒的形式增长有利于糖化酶生产，而大颗粒的形式则降低了糖化酶的生产量，导致结果不匹配。
现今研究这些的目的是为了激发菌株的潜能，通过化学或者无力突变来增加糖化酶的产量。
原料和方法改善菌株：黑曲霉能通过紫外线和诱变剂得以改善。
用溴化乙錠和甲基磺酸乙脂轮流处理亲代菌株。
两种诱变剂同时使用。
黑曲霉 糖化酶的生产流程设计方案
糖化酶的生产流程设计方案糖化酶的生产流程设计方案根据题意，某厂期望利用黑曲霉工程菌有氧发酵大量生产糖化酶，年产320吨，一个生产周期约40天，场地可容纳4个发酵罐及其附属设备。
所以，每个发酵罐的工程菌要在每年至少进行9次发酵且每次发酵要达到9吨才能满足题意。
可现有的工程菌TH5只能使每吨发酵液中提取0.04吨糖化酶不能满足生产要求，所以改进现有菌株开始到可销售的产品产出为止的生产流程如下：黑曲霉工程菌TH5改良黑曲霉工程菌TH5筛选优良种子扩大培养发酵罐发酵提炼产品第一步、诱变黑曲霉工程菌，并筛选出优良的、所需黑曲霉工程菌（一）同步培养将黑曲霉菌株接到适合的斜面培养基上，然后在培养基中进行培养。
再将斜面上的菌株进行下列处理。
(二) 黑曲霉菌株悬液制备菌悬液制备取出发菌株转接至缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃～35℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成孢子悬液，在细胞计数板上计数并将其调浓度至106～108个/mL，冷冻保藏备用。
(三) 诱变处理用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。
1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。
取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。
逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为l min、3min、5 min。
照射后，诱变菌液在红灯下稀释涂菌进行初筛。
2．稀释菌悬液按10 倍稀释至10-6，从10-5 和10-6 中各取出0.lmL 加入到培养基平板中，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，恒温培养2～3d。
记录H/C的数值并观察。
3．优良菌株的筛选选出优良的、所需的黑曲霉工程菌株。
第二步、把筛选好的优良的工程菌株进行扩大培养菌种扩大培养的目的就是为每次发酵罐的投料提供相当数量的、代谢旺盛的种子。
黑曲霉固态发酵产糖化酶的研究
黑曲霉生产糖化酶及酶活测定
的有利条件 ，掌握好 茵种特性 ，合理配制 营养 ，控制好发酵条件 ，便可获得 高酶 活力的高产糖化酶。本 实验还运 用
了几 种 酶 活 力 测 定 方 法 ，以 资进 行 优 劣探 讨 。
关键词：黑曲霉；液体通风发酵 ；糖化 酶；酶 活力
中图分类号：Ｑ ３ １ 文献标识码：Ｂ －３
糖化酶是一种糖蛋 白， 通常碳水化合物 占 ４ １ ％， ％．８ 这些碳水化合物主要是半乳糖 、葡萄糖 、葡萄糖胺 和甘
露糖 ，糖化酶残基的排列在其热和酸碱稳定性上有特殊
意义 。
２ ．黑 曲霉形态 、生理 、生态特性
（ ）糖化酶组分多 型性 ２
孢子 头呈 暗黑色 ， 菌丝体由具横隔的分枝 菌丝构成 ，
的制备过程中可能受 葡萄糖 苷酶和蛋 白酶的作用 而成多
型性的酶类 。 （ ）糖化酶的热稳性 ３
工业 用的糖化 酶都是利用它 的热稳性 ，旺环状糊精 － 可提高糖化 酶的热稳性 ，最适温度 范围一般为 ５ ℃ Ｏ
６℃。 ０
糖化 酶是淀粉酶 ，在系统命名法 中属水解酶类 。
２ ．糖化酶的性质 糖 化 酶 （ｇｕ ａ ｌ ｅ）又 名 糖 化 型 淀 粉 酶 ｌｃｍｙａ ｓ
菌丝黑褐 色 ，顶囊球形 ，小梗双层 ，分生孢子球形 ，平 滑或粗糙。一般进行无性生殖 ，其 可育 细胞称足细胞 。 ３ ．黑 曲霉突变株的形态 、生理 、生态、特征 在查 氏培养基上菌落 曲型为炭黑色，有辐射沟纹 ， 从菌落边缘 向中心 ，分化为伸长部位 ，活性部位 ，成熟 部位 ，老化部位几个 区域 即孢子萌发最早 出现于 中心部
２ 酶 活力 测定 ． 酶 活 力 测 定 方 法 （ ）钢 圈法 ：５ ３ 一 ｍｌ ％ 琼 脂 倒 皿 一再加 ５ ｍｌ
黑曲霉AS3.4309产糖化酶培养条件的研究
题目：黑曲霉AS3.4309产糖化酶培养条件的研究学院：生命科学院专业：生物技术姓名：学号：指导教师：毕业设计（论文）时间：2010年3月1 日～6月25日共17 周中文摘要对黑曲霉AS3.4309产糖化酶的培养条件进行了研究。
采用糖化力较强的黑曲霉进行液态培养，在单因素实验的基础上，采用4因素3水平正交实验对其产糖化酶的培养条件进行优化。
结果表明，该菌株产糖化酶的最优培养基组成为：玉米粉15%，玉米浆7%，麸皮5%，豆粕粉2%，(NH4)2SO40.15%；培养条件为：接种量10%，发酵液起始pH4.5，30℃，200r/min，摇瓶培养4d，最高酶活力达到382.734U/ml。
关键词：黑曲霉；糖化酶；发酵AbstractThe liquid fermentation conditions for the glucoamylase production by Aspergillus niger AS3.4309 were studied. Based on single factor test, the glucoamylase production conditions were optimized by L9(34)orthogonal test. The results indicated that the optimal medium contained 12% corn starch,1%corn steep liquor,3%bran,2%soybean flour and 0.15%(NH4)2SO4.The culture conditions were as follows: inoculum size 10%,initial pH 4.5,temperature 30℃,shaker speed 200 r/min and culture time 4d. Under above conditions ,the highest glucoamylase activity reached382.734U/ml.Key words: Aspergillus niger ;glucoamylase ; fermentation目录中文摘要 (2)ABSTRACT ...................................................................................................... 错误!未定义书签。
霉菌在食品制造中的应用
霉菌在食品制造中的应用霉菌在自然界分布很广，也是人类利用最多的微生物类群，绝大数霉菌能把加工原料中的淀粉、糖类等碳水化合物、蛋白质等含氮化合物及其他种类的化合物进行转化。
如在食品工业中可利用霉菌生产豆腐乳、酱油、食醋等发酵食品，生产红曲色素、柠檬酸等食品添加剂，生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等酶制剂。
一、霉菌与淀粉的糖化糖化是指淀粉在糖化剂（曲或酶）的作用下，转化为可发酵性糖即葡萄糖和麦芽糖的过程。
霉菌的糖化是通过其产生的淀粉酶进行的。
通常情况是先进行霉菌培养制曲。
淀粉原料经过蒸煮糊化加入种曲，在一定温度下培养，曲中由霉菌产生的各种酶起作用，将淀粉分解成糖等水解产物。
（一）糖化原理糖质原料只需使用含酵母等微生物的发酵剂便可进行发酵；由于酵母本身不含糖化酶，不能直接利用淀粉，所以含淀粉质的原料还需将淀粉糊化，使之变为糊精、低聚糖和可发酵性糖。
糖化剂中不仅含有能分解淀粉的酶类，而且含有一些能分解原料中脂肪、蛋白质、果胶等的其他酶类。
曲和麦芽是酿酒常用的糖化剂，麦芽是大麦浸泡后发芽而成的制品，西方酿酒糖化剂惯用麦芽；曲是由谷类、麸皮等培养霉菌、乳酸菌等组成的制品。
一些不是利用人工分离选育的微生物而是自然培养的大曲和小曲等，往往具有糖化剂和发酵剂的双重功能。
（二）糖化菌种在生产中利用霉菌作为糖化菌种很多。
根霉属中常用的有日本根霉、米根霉、华根霉等；曲霉属中常用的有黑曲霉、宇佐美曲霉、米曲霉和泡盛曲霉等；毛霉属中常用的有鲁氏毛霉。
红曲属中的一些种也是较好的糖化剂，如紫红曲霉、安氏红曲霉、锈色红曲霉、变红曲霉等。
二、霉菌与发酵豆制品发酵豆制品包括酱油、豆酱、豆豉及各种腐乳等，都是用大豆或大豆制品接种霉菌发酵后制成的。
下面以酱油和腐乳为例来介绍霉菌的发酵作用。
（一）酱油酱油是一种常用的成味调味品，以蛋白质原料和淀粉质原料为主，经微生物发酵而成。
酱油不仅有食盐的咸味、氮基酸钠盐的鲜味、糖及其醇甜物质的甜味、有机酸的酸味等，还有天然的红褐色色素。
黑曲霉淀粉酶酶学性质研究
黑曲霉淀粉酶酶学性质研究作者：徐圣佳刘明启应家振来源：《中国科技纵横》2012年第23期摘要:本实验对黑曲霉JLSP-15淀粉酶的酶学性质进行了研究。
该淀粉酶的最适温度为60℃,其热稳定性较差;最适pH为pH 6.0,在pH4.0-8.0范围内稳定性较好。
Ca2+对淀粉酶活性具有显著促进作用,而Fe3+和Cu2+对其活性具有强烈的抑制作用。
关键词:淀粉酶黑曲霉酶学性质淀粉酶是生物工艺学中最早实现工业生产的酶制剂品种,用途广,产量大。
淀粉酶根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）与β-淀粉酶（EC 3.2.1.2）[1]。
α-淀粉酶是淀粉酶的一种,其作用于淀粉时,可从分子内部切开α-1,4 键而生成糊精和还原糖。
α-淀粉酶作为一种重要的工业酶制剂,被广泛地用于食品,发酵,纺织,造纸业,制药业和化学药品工业等工业,此外还扩展到临床,医学,分析化学等其他领域。
国内早期开发α- 淀粉酶主要来源来自细菌,其安全性与酶学特性限制其在食品工作中的应用。
黑曲霉是美国FDA公布的40多种安全微生物菌种之一,可以产生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。
本研究以实验室分离的黑曲霉JLSP-15为菌种,采用固体发酵（SSF）获得黑曲霉淀粉酶,系统研究了其酶学性质。
1、材料与方法1.1 菌种及固体发酵黑曲霉JLSP-15为本实验室分离、鉴定。
固体发酵培养基:新鲜麸皮9.5g,(NH4)2SO40.3g,KH2PO4 0.05g,(NH4)2SO4 0.15g,加入到250ml三角瓶中,再加入蒸馏水10.0ml,121℃灭菌。
固体发酵条件:向灭菌后的固体发酵培养接入1ml黑曲霉JLSP-15菌种,30℃恒温培养60h。
1.2 淀粉酶酶活测定方法在培养后的三角瓶中按1:20ml加入0.9%生理盐水,常温静置6h,然后过滤,滤液即为粗酶液。
淀粉酶活性测定采用DNS法[2,3]。
淀粉酶活力单位(U)定义为:在最适反应条件下,以每1min生成1μmol还原糖（以D-葡萄糖）所需的酶量作为一个酶活力单位。
山西老陈醋高产糖化酶霉菌的筛选、鉴定及产酶条件优化
山西老陈醋素有“天下第一醋”的盛誉[1]，以其“酸醇 厚、味清香、回味绵、质浓稠、色紫檀和久贮不变质”的特色 深受广大消费者喜爱[2]。大曲中因含蛋白酶、糖化酶、纤维 素酶等几十种酶类与霉菌、酵母菌等微生物而素有“曲是 醋中骨”之称，其在山西老陈醋的酿造中起到重要的作用。 大曲 中的 霉 菌 在生 长代 谢 过程 中会 产 生 丰 富 的 酶 系 ，尤 其是糖化酶，是食醋酿造过程中的重要糖化剂。除了糖化 酶，霉菌也会产生一定的蛋白酶，分解原料中的蛋白质生 成各种氨基酸和多肽，此类物质的含量是成品食醋质量优 劣的一个标准[3]。纤维素酶则可使食醋酿造原料中的纤维 素转化为可发酵性的糖，从而增加了原料中可利用的碳源， 还可以破坏原料中的细胞壁结构促进淀粉的溶出，这有利
WANG Jiali1, LANG Fanfan2, CHEN Xufeng3, WANG Rufu1, XU Nv1*
75 mold strains were isolated from Shanxi mature vinegar Daqu, the molds with high-yield saccharifying enzyme were screened and identi-
51.75 kDa and pH 3.99, respectively. The optimal enzyme production conditions for the
186 were bran 4%, ammonium sulfate 0.5%, initial
pH 7.0, inoculum 8%, liquid loading volume 100 ml/250 ml, rotation speed 145 r/min and fermentation time 7 d. Under the optimal conditions, the
黑曲霉发酵生产糖化酶的工艺流程
黑曲霉发酵生产糖化酶的工艺流程English Answer:Black Aspergillus Fermentation for the Production of Cellulase.Process Flow Diagram:1. Strain Selection and Preparation: Select a suitable strain of Black Aspergillus for cellulase production. Prepare the inoculum by culturing the strain in a suitable growth medium.2. Substrate Preparation: Prepare a substrate containing cellulosic materials, such as agricultural residues (e.g., corn stover, wheat straw), or industrial byproducts (e.g., paper pulp, wood chips).3. Fermentation: Inoculate the prepared substrate with the Black Aspergillus inoculum. Conduct fermentation underoptimal conditions for cellulase production, including temperature, pH, aeration, and agitation.4. Enzymatic Extraction: After fermentation, extract the cellulase enzymes from the fermented substrate using suitable extraction techniques, such as mechanical disruption, solvent extraction, or enzymatic hydrolysis.5. Enzyme Purification: Optionally, purify the extracted cellulases to improve their activity and specificity. This can be achieved through techniques such as chromatography, precipitation, or membrane filtration.6. Formulation and Application: Formulate the cellulase enzymes into a suitable product form for specific applications, such as in the paper and pulp industry, biofuel production, or textile manufacturing.Factors Influencing Cellulase Production:Substrate Composition: The composition and structure of the cellulosic substrate significantly impact cellulaseproduction. Factors such as crystallinity, surface area, and availability of cellulose and hemicellulose influence the enzyme's accessibility and efficiency.Fermentation Parameters: Optimal fermentation conditions, including temperature, pH, aeration, and agitation, are crucial for maximizing cellulase production.Strain Selection: The choice of Black Aspergillus strain plays a significant role in determining the yield and activity of cellulases produced.Nutrient Optimization: Providing essential nutrients, such as nitrogen, phosphorus, and vitamins, during fermentation supports cell growth and enzyme production.Enzyme Induction: The presence of inducers in the fermentation medium can induce higher cellulase production by Black Aspergillus. Inducers can be cellulosic materials themselves or other compounds that stimulate enzyme synthesis.Applications of Cellulases from Black Aspergillus:Pulp and Paper Industry: Cellulases are used in the pulp and paper industry to improve paper quality, brightness, and yield by breaking down cellulose fibers.Biofuel Production: Cellulases play a crucial role in the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass for biofuel production.Textile Manufacturing: Cellulases are used in the textile industry to improve fabric quality, reduce dyeing costs, and enhance the feel and appearance of fabrics.Food Industry: Cellulases are employed in the food industry to improve the nutritional value and digestibility of plant-based foods.中文回答：黑曲霉发酵生产糖化酶的工艺流程。
发酵食品生产技术单选题100道及答案解析
发酵食品生产技术单选题100道及答案解析1. 发酵食品中常用的微生物不包括（）A. 酵母菌B. 乳酸菌C. 霉菌D. 大肠杆菌答案：D解析：大肠杆菌一般不是发酵食品生产中常用的微生物，而酵母菌、乳酸菌和霉菌在发酵食品中应用广泛。
2. 下列属于发酵食品的是（）A. 炒青菜B. 煮鸡蛋C. 酸奶D. 炸薯条答案：C解析：酸奶是通过乳酸菌发酵制成的，属于发酵食品。
炒青菜、煮鸡蛋、炸薯条都没有经过发酵过程。
3. 发酵过程中控制温度的主要目的是（）A. 加快反应速度B. 抑制杂菌生长C. 保证微生物活性D. 以上都是答案：D解析：控制温度在发酵过程中既能加快反应速度，又能抑制杂菌生长，还能保证微生物的活性。
4. 制作泡菜利用的微生物主要是（）A. 醋酸菌B. 酵母菌C. 乳酸菌D. 霉菌答案：C解析：制作泡菜主要利用乳酸菌的发酵作用。
5. 发酵食品生产中，调整pH 值的作用是（）A. 促进微生物生长B. 抑制微生物生长C. 影响代谢产物生成D. 以上都是答案：D解析：调整pH 值可以促进或抑制微生物生长，同时也会影响代谢产物的生成。
6. 啤酒发酵中使用的主要微生物是（）A. 乳酸菌B. 醋酸菌C. 酵母菌D. 霉菌答案：C解析：啤酒发酵主要依靠酵母菌。
7. 发酵食品生产中，接种量的大小会影响（）A. 发酵速度B. 产品质量C. 微生物生长D. 以上都是答案：D解析：接种量的大小会对发酵速度、产品质量以及微生物生长都产生影响。
8. 酱油发酵过程中，主要的发酵阶段是（）A. 前期B. 中期C. 后期D. 整个过程答案：B解析：酱油发酵过程中，中期是主要的发酵阶段。
9. 发酵食品生产中，通风的目的是（）A. 提供氧气B. 排除二氧化碳C. 控制温度D. 以上都是答案：D解析：通风可以提供氧气，排除二氧化碳，同时也有助于控制温度。
10. 面包发酵使用的酵母属于（）A. 酿酒酵母B. 假丝酵母C. 毕赤酵母D. 以上都不是答案：A解析：面包发酵通常使用酿酒酵母。
霉菌在环境保护中的应用探析
目录【摘要】 (2)一、霉菌的分类及相关特性介绍 (2)二、利用霉菌的历史回顾 (9)三、当前环境问题及霉菌在环境保护中的应用和负面影响 (10)四、霉菌在环境保护中应用的前景展望 (20)五、结论 (20)六、参考文献 (21)霉菌在环境保护中的应用探析【摘要】随着人类社会的发展，人们在追求更高生活水平的同时，环境问题也变得日益突出。
人们在处理各种环境问题时，除了应用传统的物理、化学方法外，近年来新近引入了微生物方法。
通过近些年来的试验，事实证明利用微生物方法在处理某些特殊条件下的环境问题具有物理、化学方法不可比拟的优点。
霉菌作为一种微生物，其在环境保护中具有重要意义。
本文将从以下几个方面讨论霉菌：○1霉菌的分类及相关特性介绍；○2利用霉菌的历史回顾；○3当前环境问题及霉菌在环境保护中的应用和负面影响；○4霉菌在环境保护中应用的前景展望。
通过以上内容的介绍，我们将对霉菌在环境中的应用有一个初步的认识和了解。
一、霉菌的分类及相关特性介绍霉菌（mold）广泛分布于自然界，与人类生活及生产关系密切。
霉菌是由分枝的和不分枝的菌丝交织形成的菌丝体。
整个菌丝又分为两部分：即营养菌丝和气生菌丝。
营养菌丝伸入培养基内或匍匐蔓生在培养基的表面，摄取营养和排除废物。
气生菌丝在培养基上方的空气中，由气生菌丝长出分孢子梗和分生孢子。
霉菌菌丝直径约3~10μm，在显微镜下放大100倍可清晰看见，放大400倍细胞内部结构也可看见。
霉菌的繁殖方式，借助于有性孢子和无性孢子繁殖也可借助于菌丝的片段繁殖，由它的顶端延伸分枝而生成新的菌丝体霉菌分为腐生和寄生。
霉菌的菌落呈圆形、绒毛状、絮状或者蜘蛛网状。
比其他微生物的菌落都大，长得很快，可蔓延至整个平板。
不同霉菌的孢子有不同的形状、结构和颜色，可是各种霉菌菌落呈现不用结构和色泽。
霉菌可水溶性色素和非水溶性色素。
水溶性色素可溶于培养基中使菌落背面呈现不同颜色。
霉菌菌落疏松，与培养基结合不紧，用接种环很容易挑取。
酶工程-重点整理总结
第一章绪论1、何为酶工程，试述其主要内容和任务。
答：（1）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
（2）主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
（3）主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方式使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2、酶有哪些显著的催化特性？答：（1）酶催化作用的专一性强（①绝对转移性：一种酶只能催化一种第五进行一种反应；②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应）；（2）酶催化作用的效率高（107~1013倍）；（3）酶催化作用条件温和。
3、简述影响酶催化作用的主要因素。
答：（1）底物浓度的影响：决定酶催化作用的主要因素。
酶催化反应速度随底物浓度增加现增加在逐步趋向平衡再反而下降。
（2）酶浓度的影响：底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。
（3）温度的影响：适宜温度范围内，酶能进行催化反应，最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。
一般60°C以上易失活，5°C以下活性极低，Taq聚合酶95°C下仍稳定。
（4）PH的影响：适宜PH范围内，酶才能显示其催化活性，最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。
（5）抑制剂的影响：在抑制剂的影响下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能，有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。
（6）激活剂的影响：在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶生成有催化活性的酶。
如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金属离子和Cl等无机负离子。
第二章微生物发酵产酶1、试述酶生物合成的基本过程。
答：（1）RNA的生物合成—转录：转录的起始、RNA链的延伸、RNA链合成的终止、RNA前体的加工；（2）蛋白质的生物合成—翻译：氨基酸活化生成氨酰-tRNA、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止、蛋白质前体的加工。
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影响黑曲霉产糖化酶和蛋白酶的主要营养因素
肖 雷 , 冷云伟 , 陶秀祥 , 刘炯天 , 王璐璐
(中国矿业大学 化工学院 , 江苏 徐州 221116)
摘要 : 考察了培养基的配比 、部分简单碳源对黑曲霉 A S31 350 产糖化酶 、蛋白酶和孢子收获量 的影响. 结果表明 :在选择的 2 种有机氮源中 ,豆粕可被黑曲霉较好地利用. 在麸皮与豆粕的质量 比为 5 ∶5 ,30 ℃培养 72 h 时 ,糖化酶活力最高为 1 185 U/ g ,蛋白酶活力差异不显著. 在分别添 加葡萄糖 01 5 % ,蔗糖 01 75 %时 ,黑曲霉产糖化酶酶活力达到最高 ;对添加淀粉来说 ,随着淀粉浓 度的增高而糖化酶活力逐渐增大. 蛋白酶活力和孢子收获量与碳源的种类 、浓度以及菌体的生长 情况密切相关. 关键词 : 黑曲霉 ; 糖化酶 ; 蛋白酶 ; 营养成分 中图分类号 : TQ 925 文献标识码 : A 文章编号 :100021964 (2009) 0120144204
孢子收获量/ (109 个 ·g - 1)
81 06
81 90
121 83
由表 1 可见 ,第 1 组糖化酶活力显著高于第 2 组和第 3 组 ( P < 01 05) ,而第 3 组氮源过多 ,蛋白 酶活力低[11] ,但差异不显著 ( P > 01 05) . 第 3 组的 孢子收获量要明显高与前两组 ( P < 01 05) ,说明碳 源偏少 ,氮源过多有利于孢子的产生 ,但不利于酶 活力的提高 ;对比 1 ,2 两组 ,第 1 组的糖化酶活力 比第 2 组高 20 % ,而蛋白酶活力和孢子收获量差 异不大 ,因此确定最适的培养基配比为第 1 组 ,即 麦麸 :豆粕为 5 ∶5.
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14 6 中 国 矿 业 大 学 学 报 第 38 卷
图 1 玉米蛋白和豆粕对菌体产酶的影响 Fig. 1 Effect of co rn gluten mealand soybean meal
o n enzyme activity p roduced by aspergillus niger
从图 1 可以看出 ,选用玉米蛋白和豆粕作为有
机氮源时黑曲霉的糖化酶活性差异不显著 ( P >
国矿业大学生物工程实验室保存. 11 2 实验材料
麦麸 (徐州沛县敬安) ,豆粕 (徐州铜山新区东 宝粮油有限公司) , 玉米蛋白 (鲁洲生物科技有限 公司) ,硫酸铜 、葡萄糖 (分析纯) 、醋酸钠 、可溶性淀 粉等试剂均为国产. 11 3 黑曲霉培养
培养方法 :将麦麸 、水 、豆粕按一定比例混合 → 蒸煮灭菌 →接种 →培养 →两次翻曲 →成曲 →检测.
了黑曲霉的生长. 综合以上产酶分析 ,用豆粕比较
合适.
选取培养基比例为麦麸 ∶豆粕 = 5 ∶5 ,4 ∶6 ,3
∶7 进行研究. 测定结果 (以干曲计) 见表 1.
表 1 不同培养基配比对黑曲霉产 糖化酶 、蛋白酶的影响
Table 1 Effect of different culture medium proportions
接种 :待熟料冷却后 ,在无菌条件下将制备好 的孢子悬浮液以 10 %的接种量接种到固体培养基 中.
恒温培养 :将三角瓶放置于 30 ℃水浴恒温培 养箱中培养 3 d ,并进行定时观察. 在曲培养到 8～ 12 h 时菌丝开始生长 ,容易出现结块现象 ,要进行 第 1 次翻曲. 继续培养 4～8 h 后又要进行第 2 次 翻曲. 11 4 分析方法
的营养因素对于提高原料利用率和产品的品质有 着重要的意义. 本实验以黑曲霉 (A S31 350) 作为发 酵菌株 ,通过不同营养因子的选取来确定黑曲霉固 体发酵的产酶条件[527] ,得出碳源和氮源对黑曲霉 产酶的影响 ,为多酶体系的建立和这些酶的高效应 用提供理论和实践依据.
1 材料与方法
11 1 菌 种 黑曲霉 ( A spergillus niger) 31 350 菌株 ,由中
( School of Chemical Engineering and Technology , China U niversity of Mining & Technology , Xuzho u , Jiangsu 221116 , China)
Abstract : The effect s of so me medium co mpo nent s , including cult ure medium p roportio ns and several simple carbo n so urces , o n p rotease and glucoamylase activit y of aspergillus niger were investigated. The result s show t hat amo ng t wo kinds of organic nit rogen so urces soybean meal co uld be used efficiently by aspergillus niger , t he optimal co nditio ns of cult ure medium for en2 zyme secretio n was t he mass ratio of wheat bran and soybean meal of 5 ∶5 and t he glucoamy2 lase activit y of 1 185 U/ g , when t he cultivating co nditio n was 20 g medium in 250 mL flask and incubatio n temperat ure of 30 ℃for 72 ho urs. The p rotease activit y had no o bvio us difference amo ng t he t hree samples. The glucoamylase activit y was mo st when t he gluco se of 01 5 % and sucro se of 01 75 % were added in t he basic medium respectively. The glucoamylase activit y in2 creased wit h t he increasing of starch co ncent ratio n. The p rotease activit y and spore yield were clo sely correlated wit h t he kind , co ncent ratio n of carbo n so urces and growt h of aspergillus ni2 ger . Key words : aspergillus niger ; glucoamylase ; p rotease ; nut rient s
Effect s of Main Nut rient s o n Glucoamylase and Protease Activit y Produced by Aspergillus Niger
XIAO Lei , L EN G Yun2wei , TAO Xiu2xiang , L IU J io ng2tian , WAN G L u2lu
糖化酶活力测定参见文献 [ 8 ] ,斐林试剂快速 法.
蛋白酶活力测定参见文献[ 9 ] ,甲醛法测定. 孢子数测定 : 采用血球板计数法.
2 结果与讨论
21 1 培养基配比对黑曲霉产糖化酶 、蛋白酶的影 响
玉米蛋白作为玉米淀粉加工工厂的副产物 ,其
蛋白质含量达到 60 %以上 ,可以使用玉米蛋白作 为黑曲霉培养的氮源物质[10] . 通过添加豆粕或玉 米蛋白 ,研究不同有机氮源对黑曲霉产糖化酶 、蛋 白酶和孢子收获量的影响 (见图 1) . 实验组号第 1 组为麦麸 ∶豆粕 = 4 ∶6 ;第 2 组为麦麸 ∶豆粕 = 3 ∶7 ;第 3 组为麦麸 ∶玉米蛋白 = 4 ∶6 ;第 4 组为麦 麸 ∶玉米蛋白 = 3 ∶7.
on enzyme activity produced by aspergillus niger
项目
5 ∶5
4 ∶6
3 ∶7
(第 1 组) (第 2 组) (第 3 组)
糖化酶活力/ ( U ×100 ·g - 1) 111 85
91 86
81 36
蛋白酶活力/ ( U ×10 源自g - 1)211 779 221 581 201 370
生长和产物的合成. 所以选择合适的葡萄糖添加量 对于微生物的生长和产酶能力的提高都有很大的 意义.
选取麦麸 ∶豆粕 = 5 ∶5 的基本培养基 , 添加 一定浓度的葡萄糖. 测定结果 (以干曲计) 见图 3.
培养基的制备 :称取麦麸和豆粕按一定比例混 合 , 每瓶曲的基本培养基总重量为 20 g ,并加入一 定水量 ,保证物料和水的比例为 1 ∶11 2 ,灭菌备 用.
孢子悬浮液的制备 :将斜面试管加入一定量的 无菌水. 把孢子刮下 ,倒入无菌的三角烧瓶内 ,振荡 分散孢子 ,然后用无菌水调整孢子浓度到 51 0 ×l07 个/ mL ,备用.
收稿日期 : 2008205206 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 (863) 项目 (2006AA102314) ;徐州市社会发展基金项目 (xz06063) 作者简介 : 肖 雷 (19752) ,男 ,江苏省徐州市人 ,博士研究生 ,从事微生物发酵和生物质能源利用方面的研究. E2mail : zlei4703 @163. co m Tel : 0516283591073