时间分辨荧光免疫层析技术简介

设计形式：
• 测向流层析 • 垂直流层析（渗滤法）
免疫层析技术原理
侧向流层析
• 固定相：固定有检测线和控制线的纤维层析材料（NC膜） • 流动相：测试液 • 移动：毛细作用 • 结合：游离态待测物在固相捕获线处发生特异性免疫反应
图1 典型侧向流免疫层析试纸条构造（来源：Merck Estapor）
时间分辨荧光免疫层析技术简介
主要内容
1
免疫层析技术原理
2
免工疫作问标题记机材解决料方介案绍
3
时间分辨荧光分析法
4
应用实例
免疫层析技术原理
免疫层析技术是建立在层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一 项新兴免疫检测技术。
发展阶段：
• 初期：定性检测 • 新阶段：半定量、定量检测（信号放大、信号转换）
• 荧光寿命(Fluorescence lifetime)：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的 时间。
• 荧光猝灭(Fluorescence quenching)：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、 某些硝基化合物、重氮化合物、重金属、卤素阴离子等）的作用下，激发态分子的电子不能 回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射，从而导致荧光减弱甚至消退的现象。引 起荧光猝灭的物质称为猝灭剂，常用于消除不需要的荧光。
表1 几种常见的荧光物质
荧光物质
最大吸收光谱
异硫氰酸荧光素 (FITC)
490～495nm
四乙基罗丹明 (RB200) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素
570～575nm 550nm 490-560nm 354nm
Alexa Fluor、CF Dye等新一代荧光染料系列 多种区段供选
技术特点
•荧光分析的光电接收器与激发光不在同一直线上，激发光不能直达光电接收器，从而大幅 提高了光学分析的灵敏度。 •镧系元素荧光发射波长与激发波长差异巨大，发射波峰窄，可较大避免普通紫外-可见光 分析法中杂色光的影响。 •镧系元素特有的超长时间荧光寿命，使检测在关闭激发光源的情况下进行，可很好地解决 激发光及散射光干扰。
免疫层析技术原理
反应模式：
• 竞争法（小分子 如药物、毒素）
• 夹心法（大分子 如激素、菌体）
图2 免疫层析竞争法及夹心法反应原理图（来源：网络）
免层析标记材料
标记材料分类：
胶体金
胶体金
• 标记方法简单
• 金颗粒粒径1~100nm，与 不同分子量的蛋白质结合比 例不同
• 特异性强，适用范围广，可 做多合一检测
铕（Eu3+）螯合物
340nm
最大发射光谱 520～530nm（黄绿色） 595～600nm（橙红色） 620nm（橙红色） 595nm（红色） 430nm（蓝色）
613nm
普通荧光材料
优点：
不足：
• 普通荧光微球成本较低 • 光源与光电接收器不在同一直线
上，激发光不直达检测器，荧光 信号可量化范围大，提高分析灵 敏度
不足：
• 镧系离子螯合物荧光亮度较低，需结合纳米微球或解离-增强技术放大信号
图7 消除样品荧光干扰原理及镧系元素的Stokes位移示意图（来源：Perkin Elmer）
上转换磷光材料
上转换磷光材料(Up-converting Phosphor, UCP)：又称稀土元素晶体合成材料，是 由两种不同镧系元素离子（分别作为光吸收子和发射子）掺杂入亚微米尺寸的陶瓷颗粒 中，构成的一类能在红外光（波长>780nm）的激发下，发射可见光（波长475nm670nm）的材料。 UCP作为标记物应用于生物领域，与普通荧光颗粒相比具有无淬灭、无背景、高敏感性、 高稳定性等特点。
图9 核-壳型量子点结构示意及不同发射光的量子点（来源：网络）
时间分辨荧光分析法
技术简介
时间分辨荧光免疫检测技术(TRFIA)是上世纪80年代提出的一种较为新型的检测手段，采 用镧系元素及其荧光配合物作为标记物，与化学发光、电化学发光免疫检测技术并称为三 大超灵敏检测技术，在医学临床检测、生物学科研检测方面有较广泛的应用。
• 物理吸附的结合方式易受 pH值、离子强度等的影响
• 结果可视（消线法、比色法 目测判读），对照比色卡或 借助仪器可实现半定量检测
图3 胶体金检测试纸卡及读数仪（来源：勤邦生物）
纳米微粒
二氧化硅微球
• 粒径均一 100nm~10μm • 理化性质稳定、抗紫外线、球形性好 • 密度较大、有一定本底、易吸附色素离子
• 1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA的时间分辨 荧光免疫分析，即FIAgen；
• 2003年，我国多位专家联合攻关的课题“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配 套研究” （由第二军医大学海医系防原医学教研室韩玲、陈杞教授领衔的课题组，联 合上海新波生物技术有限公司、解放军总医院和中国医学科学院放射医学研究所共同完 成） ，荣获2003年度国家科技进步二等奖。
图8 普通荧光与上转换发光原理对比动画（来源：网络）
量子点
量子点(Quantum Dots, QDs)：粒径1-10nm的半导体纳米晶，由于电子和空穴被量子 限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激发后可发射荧光。常见的 有单核量子点(CdSe, CdTe, CdS)和核-壳型量子点 (CdSe/ZnS, CdSe/ZnS)。 优点：发射光颜色与粒径大小相关联，可多色标记；荧光单色性好、亮度高，适用于高灵 敏度检测；吸收光谱宽且连续，单一光源可同时激发不同波长的量子点；荧光稳定性好， 试剂无需避光即可长期室温保存，适用于测定结果的追溯；比表面积大，节约原料成本 不足：不同批次产品粒径需严格控制。
• Cyber Fluor系统：
FIAgen技术以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物，通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量分析。由于 BCPDA 的可检测性不够理想，FIAgen 需要利用生物素-亲合素信号放大来弥补BCPDA 检测灵敏度的不足。
• 基于纳米微球的时间分辨荧光技术：
Nano-TRFIA是一种全新的时间分辨荧光检测手段，它结合了镧族元素荧光的长寿命和纳米微球的信号放大效应， 将镧族元素Eu3+及其配合物共同掺杂在纳米及微球上，经过表面活化后，将抗体标记于标记物表面，形成复合 物，将该复合物用于免疫检测，可极大地提高灵敏度，并获得较为宽阔的线性范围，其实际性能不低于DELIFA技 术。
TRFIA应用
产品列表
• 上海新波生物科技 – Anytest系列、EasyCuta 1260（技术专利、医学检验试剂及仪器） • 上海微测生物科技 – Eu/Sm TRF Nano Particles（荧光微球及技术配套） • 上海西宝生物科技 – EasyComp Fluorescent Particles （荧光微球） • 广州丰华生物工程 – 泰莱-I、泰莱-II（医学检验试剂及仪器） • 广州达瑞抗体工程 （医学检验试剂） • 上海甄准生物科技 （荧光微球） • 上海优你生物科技 （技术专利、食安检测试剂及仪器） • 美国-芬兰 Perkin Elmer-Wallac – Victor 2 （仪器） • 法国-英国 HORIBA Jobin Yvon-IBH – FluoroMax （仪器）
DELFIA技术采用了异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端 可与蛋白质的-NH2 连接。在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈 酸性）作用下，DTTA-Eu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的配体螯合﹑进入胶束的疏水内 核，使Eu3+荧光得以成千万倍地放大。
时间分辨荧光分析法
材料特性
三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐(Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy)等，区别于普通高分子荧光物质， 它们的荧光光谱具有以下特性：
•荧光寿命长
镧系元素螯合物：60~900us 普通荧光基团：1~100us 样本中蛋白质荧光：1~10us（易猝灭）
•Stokes位移大
铕：激发340nm、发射613nm（约290nm） 传统荧光素：Stokes位移较小（30~60nm）
• 不同材料需匹配不同光路系统
• 超微量分析中激发光及散射光可 干扰结果
• 部分天然样本中存在本底干扰
• 显色多样，可满足多合一检测
• 荧光易淬灭，长期保存不稳定
图 6 荧光光度计光路革新设计（来源：ESEQuant）
时间分辨荧光材料
优点：
• 荧光寿命长（Eu3+ 730μs，普通荧光基团 1-100μs，样本中蛋白质荧光 1-10μs） • Stokes位移大，显著降低杂色光影响（Eu3+ 约290nm，传统荧光素 30-60nm） • 发射光谱带窄，荧光特异性强（Eu3+ 615±5nm）
TRFIA应用
食品行业对毒素、药残、非法添加剂的检测要求
• 操作简便、速度快、成本低 • 定性、半定量、定量分析 • 判定准确、灵敏度高 • 抗干扰力强，对复杂样本变异小 • 试剂稳定，便于运输及保存 • 环境友好
（部分条目：对比相应技术已成熟的医学检验试剂及配套设备更具挑战性的技术难点）
•荧光特异性强
发射光谱带很窄：615±5nm
图10 普通荧光物质与稀土离子荧光光谱对比
时间分辨荧光分析法
图2 Eu离子图荧11光光Eu谱离S子to荧ck光s位光移谱Stocks位移 图3 四种稀土图元12素四荧种光稀寿土命元对素比荧图光寿命对比图
时间分辨荧光分析法
目前，根据信号增强技术的不同，TRFIA可分为三种类型：解离再增强技术(DELFIA)、 Cyber Fluor系统(FIAgen)，以及基于纳米微球的TRFIA(Nano-TRFIA)。 • 解离再增强技术：