菌种制作及保藏

菌种制作及保藏
菌种:是指经人工培养并可供进一步繁殖或栽培使用的食用菌纯菌丝体
我国食用菌菌种生产目前采用母种、原种、栽培种的三级繁育程序
无论制作哪一级菌种，关键应强调无菌操作.
一、接种设备
用于分离和扩大培养各级菌种的专业设备和工具。
（一）接种室：4～8㎡
（二）接种箱：长143㎝、宽86㎝、高159㎝
（三）超净工作台
接种室及接种设备
1．接种室 接种室是用于接种的无菌操作室
2．接种箱 接种箱是一种由木质箱体及可以启闭的玻璃窗构成的接种装置制作筒便，造价低廉，由于体积较小，相同条件下空气消毒的效果优于接种室。
3．超净工作台 超净工作台是一种通过过滤除去空气中的尘埃使空气净化的装置
（四）接种工具
有接种针、接种环、接种钩、接种锄、接种铲、接种耙、接种刀、镊子、接种器等。
（五）酒精灯
（六）培养设备：培养室、培养箱
三、灭菌设备
1．蒸汽灭菌设备
蒸汽灭菌设备是利用其产生的湿热蒸汽进行灭菌的设备。根据所产生的蒸汽压力及工作性能可分为如下两类：
(1)高压蒸汽灭菌锅
高压蒸汽灭菌锅
是利用锅内高压
高温蒸汽进行灭菌
的设备。
一、培养基的种类
培养基：是采用人工方法，将食用菌所需要的各种营养物质按照一定比例配制而成的营养基质。
（一）按照培养基的物理性状分
1、液体培养基
2、固体培养基
3、固化培养基：加了凝固剂
（二）按照营养物质种类分
1、天然培养基
2、合成培养基
3、半合成培养基
二、培养基配制的一般原则
第一：含有菌丝生长发育所必须的营养物质，如水、碳源、氮源、无机盐、维生素等；
第二：具有一定的生长环境，包括适宜的pH值和渗透压等；
第三：必须经过严格的灭菌。
三、常用培养基及配制方法
（一）母种培养基：试管培养基；常用的物质有马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂和维生素B1。
母种培养基常用配方：
1、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂18-20克、水1000毫升、pH自然。
2、完全培养基：硫酸镁0.5克、磷酸氢二钾1克、葡萄糖20克、磷酸二氢钾0.46克、蛋白胨2克、琼脂15克、水1000毫升。
3、麦芽膏酵母膏培养基：麦芽浸膏20克、酵母膏2克、琼脂20克、水1000毫升。
4、稻草浸汁培养基：干稻草200克、蔗糖20克、硫酸铵3克、琼脂18-20克、水1000毫升。
5、普通标准培养基：葡萄糖20克、酵母浸膏2克、蛋白胨10克、琼脂18-20克、磷酸二氢钾1克、硫酸镁0.5克、pH6.5-7.0、水1000毫升。
母种培养基配制的原则
1、营养成分及比例

适合该食用菌的生长发育；
2、酸碱度、氧化还原电位适宜；
3、有一定的pH缓冲能力。
母种培养基配制的方法：称量→调配→加入琼脂溶解→加入配方中其他营养物质→pH测定与调整→过滤分装→加棉塞、包扎→灭菌→摆斜面。
（二）原种和栽培种培养基
1、培养基配方
（1）木屑培养基：阔叶树木屑（竹屑）78%、麸皮或米糠20%、糖1%、石膏粉1%。适用于木腐菌的原种、栽培种的培养，如香菇、平菇、木耳、金针菇、猴头、灵芝生产。
（2）棉籽壳培养基：棉籽壳78%、麸皮20%、蔗糖1%、石膏粉1%。适用于金针菇、平菇、凤尾菇、草菇、银耳、木耳、猴头。
（3）甘蔗渣培养基：甘蔗渣75%、麸皮或米糠24%、石膏粉1%。用于平菇、凤尾菇、金针菇、草菇、木耳、白灵菇。
（4）谷粒培养基：以小麦、高粱、玉米等为主料制作的培养基。
①麦粒10㎏、石膏粉或蘑菇专用肥0.05㎏、生石灰0.1㎏、菌糠1～2㎏。适用于多种菌生产，特别是双胞蘑菇。
注意点：用煮熟但不帐破种皮的麦粒，将菌糠、专用肥、石灰等料加水拌匀，含水量调至60%～65%，然后与麦粒混合均匀即可。
②小麦98%、碳酸钙2%。除银耳外，其它木生菌、粪草菌均适合。
③稻草50%、棉籽壳40%、麸皮8%、石膏粉2%。适用于平菇、凤尾菇。
（5）粪草培养基：干稻草63%、干牛粪25%、玉米粉4%、过磷酸钙3%、大豆粉3%、硫酸镁2%。用于蘑菇、草菇。
注意点：将稻草切成3㎝长的小段，浸透捞起，沥干不滴水；将各种原料均匀混合，堆制20天，中间翻堆3～4次（6）木块木条培养基：木条10㎏、蔗糖0.1㎏、麸皮或米糠2㎏、碳酸钙0.05㎏。适用于多种木腐菌的原种、栽培种的培养。
注意点：将木条在1%的蔗糖水中浸泡12～24小时或煮沸30分钟，捞出后与其它料拌匀，装瓶即可。
2、原种和栽培种培养基的制备
（1）称料和拌料
（2）装瓶或装袋
（3）灭菌
一、概念
1、 灭菌 ：在一定范围内彻底杀灭物料及其容器中的一切微生物。
2、消毒： 用物理或化学的方法，消灭物体表面或环境中一部分微生物的措施。也称简易非彻底的灭菌。在医学上泛指对病原微生物的杀灭。
3、杀菌：用物理或化学的方法杀死致病菌、产毒菌等的过程。
4、 防腐：采取一定的措施，使对象保存更长的 时间。
(一)、常用的灭菌方法有物理灭菌和化学灭菌两大类。
1、物理灭菌： 指用高热、辐射、过滤等物理手灭除微生物的方法。
在食用菌科学研究和生产中，对培养基、工作衣等常用高压蒸气灭菌；金属接种工具采用灼烧灭菌；玻璃器皿采用干热灭菌。而对一些不耐温、体

积庞大的培养基和物品，常采用射线和紫外线等辐射灭菌。
对热不稳定的生化药品如酶制剂、维生素的水溶液等，则采用过滤除菌。
2、化学灭菌 ： 是采用酸、碱、酚、醇、重金属、氧化还原剂、表面活性剂、染化学药品，器皿进行浸泡灭菌对空间进行熏蒸灭菌。
(二)、 培养基灭菌法：用热力或其他方法，使培养基达到无菌状态的方法。 经过灭菌的培养基，要求养分不受破坏，并彻底灭菌。 这就要根据其物理形态、容器和设备的不同，选用相应的方法灭菌。
1、固体培养基：可采用高压蒸汽或常压蒸汽灭菌。
2、固化培养基：应采用高压蒸汽灭菌。
3、液体培养基：瓶装液体培养基的灭菌方法与固化类型培养基相同；发酵罐的液体培养基是采用通高压蒸汽在罐内直接灭菌；含热不稳定物质的液体培养基，可采用过滤除菌法。
（三）消毒剂：具有杀菌能力的化学药物叫做消毒剂，亦称杀菌剂。食用菌生产中常用的消毒剂如下：
消毒法的举 例：对饮水煮沸消毒，可在几分钟内杀死不耐高温的微生物营养体；对牛奶、酒类的巴氏消毒在60～70℃下浸烫30分钟，能杀死大部分致病微生物，而不会使养分受到严重破坏，还可提高产品质量和延长保藏时间；对蘑菇培养料后期的巴氏消毒，在60～62℃下维持4—7小时，不仅能杀死培养料中大部分有害的虫卵和杂菌，而且可提高蘑菇对培养料的选择性。
接种：将接种物移至培养基上的过程。
生产上叫下种或播种。
（一）母种的接种与培养
1、接种：也叫转管。从试管到试管。
2、培养；将接种好的试管放在温箱内，于25℃左右的温度条件下培养。一般3天后，应检查菌丝生长情况或有无杂菌，培养7～15天母种菌丝就长好了
(二)原种的接种与培养
1、原种的接种：从试管到原种瓶。
2、培养：培养室培养，菌丝长满后即为原种。
平菇原种在25℃下，培养25～35天，草菇原种在32℃下，培养一周即可长好。
注意点：头3～5天内直立放置，当菌丝吃料后倒卧叠放，并适时转动，这样可保持水分均匀，使菌丝生长一致。
培养好的原种菌丝浓白、健壮、纯净，有一定的清香味。
培养好的原种必须在3个月内使用。
（三）栽培种的接种与培养
1、栽培种的接种：是将原种移接到栽培种培养基上，待菌丝长满培养基即为栽培种。一般1瓶原种可扩接50～80瓶或25袋左右栽培种。
2、栽培种的培养：一般在25℃条件下培养，经30～40天栽培种即可长满菌丝，供栽培使用。
注意点：若袋内长有原基，说明菌种老化；若有黄、绿、黑等色斑，说明菌种污染，不可使用。
三

、菌种质量鉴定
要求按菌种质量标准进行。
质量检验：菌种质量的优劣是食
用菌生产成败的关键，必须通过鉴定后方可投入生产。
菌种鉴定必须从形态、生理、栽培和经济效益等方面进行综合评价。
生产上认为最可靠的方法是进行目测和镜检，通过实际观察，主要鉴定菌种的种性、菌丝状态、杂菌、害虫、积水和菌丝自溶等六项检验项目，检验结果全部符合质量标准的，为合格品。若其中有一项或多项不符合质量标准者，为劣等品或不合格品。
出售的菌种必须贴有菌种质量合格标签，注明菌种种类、级别、品种、生产单位和接种日期。
菌种变异退化的表现：
如果香菇双核菌丝生产缓慢，
有人称为角形菌落；
在木屑培养基表面菌丝白色浓密，但生产缓慢形成扇形菌落，
这也是菌种变异退化的表现，这些菌种均不能应用于生产。老化菌种或其他不能应用于生产的菌种：如菌丝生产缓慢。菌丝不浓白而稀疏，如适当延长培养时间仍是稀疏菌丝，这可能是培养料缺氮等营养源，亦不是健壮良好的菌丝。
如菌种出现脱壁、萎缩，为老化菌种，不能应用于生产
菌种质量应注意如下指标：1．呼吸强度 香菇用来产生能量（ATP）的主要方式是呼吸，呼吸作用强，说明菌种生长旺盛，反之说明菌种生活力衰落。因此，可用呼吸强度来间接判断菌种质量好坏。
菌种的呼吸强度通常可采用瓦勃检压计测定氧与二氧化碳排出量来测量；也可以用测量溶液中氧张力的仪器测定。2. 酶的活性：香菇在生长发育中约有30多种酶参与，比较重要的酶有：
（1）木质素酶与虫漆酶 香菇系白腐菌，主要利用纤维素、半纤维素及木质素等作为营养源。因此，香菇分泌胞外酶、纤维素酶可分解木材为纤维素， 把纤维素连续降解为β-葡萄糖。
木质素酶与虫漆酶：石川（1981）发现，香菇菌丝生长初期，虫漆酶活性高，随后减弱。子实体形成时，虫漆酶活性急剧减弱，而木质素酶活性迅速增强。
这说明木质素酶与虫漆酶对香菇菌丝生长发育有很大作用，可作为指示菌种活力强弱的主要酶测定。（2）多酚氧化酶：多酚氧化酶是主要的酶，多酚氧化酶与菌种质量、菇的产量相关，它参与菇体色素形成，并能强化细胞壁，调节生长发育。
石川（1981）发现，菇木与木屑培养基中的香菇菌丝初期多酚氧化酶活性高，而后逐渐减弱。出菇前，多酚氧化酶活性减弱，产菇结束后，酶原来活性逐渐恢复。这说明多酚氧化酶是香菇活力的重要标记。（3）纤维素酶与半纤维素酶：香菇菌丝的纤维素酶与半纤维素酶是胞外酶，对于分解

纤维素类物质以满足香菇菌丝的营养需要是非常重要的。
香菇菌丝的纤维素酶与半纤维素酶活性强弱，可视为菌种质量
的好坏的标准之一。
香菇
菌丝白色，棉絮状，初始较细，色较淡，后逐步粗壮变白，有伸向空间的气生菌丝，平伏生长的速度不等，一般每天生长0.7—1.0厘米，长满管后各品种爬壁能力不同，一般都有爬壁现象，菌丝在琼脂培养基上生长一般不使培养基变色。通常中、高温品种在电冰箱中保存，可在试管内生长子实体，培养最适温度24℃。
香菇菌种必须符合下列条件：总之，用于栽培的香菇菌种，首先应具有优良的的遗传性状；其次，必须符合
纯（菌种体是所选菌株的纯培养）
香（ 菌种体具有鲜香菇特有的香味）
白（ 菌丝色白，木屑培养基呈均匀的黄白色）
壮（再生力强，移植后菌丝吃料较快）
润（菌种体呈块状，不松散，含水量适宜）等项质量标准。
二/三级种目测指标：
.合格的菌种：
菌丝体布满培养基，培养基变色均匀；
菌种体水分适当，而且容器中无积液；
没有杂菌，没有异常的颜色或者气味；
没有拮抗线；
容器没有破损；
有合格的标识。
菌种保藏，包含两方面的内容：
一是菌种的保持，即保持成活和不受污染：
二是菌种的贮存，使其在相当长的时间内稳定的遗传潜力。
菌种的保藏方法：1、缺氧法：真空、矿物油保存
2、干燥法：PDA中琼脂用量从2%加至3%，滤纸真空干燥
3、饥饿法：滤纸、无菌水配孢子液
4、低温法(4℃)，但草菇例外( 10-15 ℃)
一、衰退
1、衰老：自然现象
2、退化：优良性状的丢失
二、复壮技术
(一)、采用组织分离方法 这种方法简便易行，周期短，生产上易于采用。
(二)、在菌种保藏传代中，经常改变培养基成分，或在原有的培养基中添加酵母膏、麦芽汁、氨基酸类物质和维生素等。
(三)、采用菌丝体复壮的方法 即在转管时，除去表面菌膜，挑取健壮菌丝体顶端部分，进行纯化培养，以提高菌种的生活力，并保持优良菌种的特性。