4 流感病毒标本采集、运输、分离检测及注意事项
流感病毒实验室检测流程
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流感病毒实验室检测流程
流感病毒实验室检测流程简述如下：
→样本采集：采集患者咽拭子、鼻咽拭子或呼吸道分泌物
→标本处理：使用病毒保存液，保持样本活性，低温运送
→实验室接收：记录信息，安全条件下接收样本
→核酸提取：从样本中提取RNA
→RT-PCR检测：逆转录聚合酶链反应，检测流感病毒核酸
→结果分析：观察PCR产物，判断阴阳性
→病毒分离培养：必要时，于生物安全柜中进行鸡胚或细胞培养→病毒鉴定：通过HA试验、基因测序等确定病毒类型和亚型→出具报告：记录检测结果，及时报告给临床医生
→生物安全：全程严格遵守生物安全操作规程。
1。
病原微生物标本送检注意事项
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发现的问题
2、标本无防漏措施。
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发现的问题
2、标本无防漏措施
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发现的问题
2、标本无防漏措施
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发现的问题
3、样品运输外包装不符 合要求
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包装要求
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A类感染性物质的包装与标签
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B类感染性物质的包装与标签9
简易运输筒
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3
检测项目
流感、禽流感：核酸检测 手足口：核酸检测 麻风疹：核酸检测、IgG定量（IgM由县市
区疾控中心检测） 布病：确证试验（试管凝集试验）
初筛试验（虎红平板凝集实验由县 市区疾控中心完成）
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布病检测方法
虎红平板凝集试验（RBPT)
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布病检测方法
试管凝集试验（SAT）
6
布病检测方法
7、标本送检不及时
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发现的问题
8、标本采集送检时间过于集中
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发现的问题
8、样本采集送检时间过于集中
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标本送检注意事项
1、标本运输箱符合生物安全要求 2、标本标识清楚（冻存后送检标本） 3、密封、防漏（病毒采样管） 4、低温冷藏运输（包装、时间） 5、送检单填写规范（信息填写详细工整）
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标本送检注意事项
6、保证送检标本质量（病毒保存液大于4ml， 血清大于1ml)
7、送检及时（手足口25日前送检当月和上月 最后一周采集标本，麻疹采样后3天内送到）
8、送检前及时沟通 9、忌黄冈市疾控中心人员带样
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谢谢！
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7
样品受理常见问题
1、样品送检程序不符合规范 2、样品外包装不符合规范 3、标本量不足 4、标本无送检单、流调表 5、标本信息不全
流感病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程
流感病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程1. 引言流感病毒核酸检测是一种常用的检测方法，可以用于流感的早期诊断和监测。
本文档旨在提供流感病毒核酸检测标本采集、送检和处理的详细流程，以确保准确、及时和安全的检测结果。
2. 标本采集标本采集是流感病毒核酸检测的第一步，正确的采集方法对于后续检测结果至关重要。
以下是标本采集的步骤：1. 选择合适的采集时间：流感病毒在病程初期时最容易检测到，因此最好在症状开始后的48小时内采集标本。
2. 选择合适的采集方法：常见的标本采集方法包括咽拭子采集、鼻拭子采集和咳痰样本采集。
根据临床需要和采集者的经验选择合适的采集方法。
3. 采集过程：采集者应使用无菌手套，并根据操作要求进行准确的采集。
在采集过程中，要避免其他污染源的接触，确保标本的纯净度。
4. 标本保存和运输：采集后，标本应立即储存于适当的中，并在规定的时间内送往实验室进行处理。
3. 送检送检是将采集的标本送往实验室进行核酸检测的步骤。
以下是送检的流程：1. 填写申请单：在送检前，检测人员应填写标本的相关信息，如姓名、性别、年龄等，并注明流感病毒核酸检测的要求。
2. 标本包装：将已采集的标本放入密封袋中，确保袋子密封良好，避免标本在运输过程中的泄漏。
3. 运输方式：根据实验室的要求，选择适当的运输方式。
一般情况下，标本应使用专用的运送盒，采取冷链运输以确保标本的质量。
4. 相关文件：将申请单和相关的送检文件一同放入密封袋中，以便实验室对标本的追踪和管理。
4. 处理流程实验室收到标本后，需要进行一系列处理步骤以获得准确的核酸检测结果。
以下是处理流程的主要步骤：1. 样本接收：实验室收到标本后，应及时确认标本的完整性和相关信息的准确性，并记录相关数据。
2. 样本处理：对标本进行必要的预处理，如离心、去除细胞和红细胞沉淀等，以提取标本中的核酸。
3. 核酸提取：使用合适的提取试剂和方法，从标本中提取核酸。
在提取过程中，应采取相关措施以防止实验室内的交叉污染。
人禽流感标本采集、运送、处理及保存的操作规程
人禽流感标本的采集、运送、处理及保存操作规程一、目的规范人禽流感标本的采集、运送、处理及保存操作。
二、适用范围本操作规程适用于人禽流感标本的采集、运送、处理及保存。
三、简介人禽流感检测过程中，采集的标本包括鼻咽拭子、漱口液、血液等。
本实验室一般用鼻咽拭子或漱口液进行病毒分离与分子生物学检测，血清用于人禽流感抗体检测，采集血液部位一般位于前臂肘静脉。
四、器材1、用于血液收集的基本耗材包括：医用（5ml和10ml）一次性注射器、一次性乳胶手套、止血带、碘酒、无菌拭子、血清储藏管、标本标签、创可贴、可封口塑料袋、标本采集表格、带有冰袋的冰壶、棉拭子、污物桶、笔、试管架。
2、用于鼻咽拭子、漱口液等收集的基本耗材包括：一次性乳胶手套、防护服、十二层口罩（或N95口罩）、采样无菌棉签、采样液（螺口塑料管装）、可封口塑料袋、带有冰袋的冰壶、污物桶、样品登记表、笔、试管架。
附：血清保存管：2 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）；鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）；尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；记号笔：油性，防水。
五、人禽流感标本采集操作规程（一）标本采集要求1．采样人员须以无菌操作采集各类标本。
采集标本所使用的容器、采样液等均应无菌。
编制：福建省疾控中心病毒性疾病防治科审核：沈晓娜批准：严延生2. 每份标本必须标明标本编号、标本种类及采集日期。
采集单位应指定专人负责标本的登记、收集和管理，并认真填写“人禽流感标本采集登记表。
”3.所有标本的收集、运输和保藏都应装在有螺旋盖的塑料管中，以防止开、关标本管时产生气溶胶，并用两层清洁塑料袋包裹严实。
4.采集的标本应立即送当地疾病预防控制机构，同时附上标本送检单。
如不能立即送交，可置-20℃以下冰箱短暂保存（24小时之内）。
（二）标本采集种类与方法标本采集的时间、位置及质量对能否分离到病毒或提取到有活性的RNA至关重要，而标本保存与运输不当，也会影响病毒的分离。
流感病毒采集规范
附件5：流感监测实验技术操作规范一、流感监测临床标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输（一）、流感临床标本的采集病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的质量，及其保存运输等环节。
多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。
采样液常用的采样液有以下五种：普通肉汤、pH7.4～7.6的Hank's、Eagle's、水解乳蛋白液或不加抗菌素的生理盐水（漱喉液）。
为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中需加入抗菌素，加入庆大霉素，其终浓度为0.1mg/ml,和抗真菌药物，其终浓度为2mg/ml。
加入抗菌素以后重新调节pH值为7.4，配制好以后，分装每个采样管4ml,-20℃冻存。
采样方法有以下几种：1)鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
以另一拭子拭另侧鼻孔。
将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。
2)咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。
注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
3)鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。
先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液5ml涮洗收集器3次。
4)漱口液：用10ml生理盐水漱喉。
漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动。
然后，用平皿或烧杯收集洗液5)鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。
然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。
重复此过程洗两侧鼻孔。
（二）、临床标本运送新鲜的临床采集标本应在4℃条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室。
未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。
标本送至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，24小时内能进行接种的可置于4℃保存，如未能接种应置-70℃或以下保存。
流感监测样本采集有关事项
标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的
塑料管里，拧紧； 每袋装一份标本；
将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；
在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。
同时填写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记 表”，用另一塑料袋密封； 然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的 材料。同一患者2份以上的密封标本，可以放在同 一个塑料袋内再次做密封。所有容器必须有生物 危险标识。
标本采集种类包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子。标 本采集后放入含3-4ml采样液的采样管中。
临床样本收集的注意事项
• 要做好自我保护，操作要细心，严防标本间交叉
污染
• 采集禽流感疑似度 • 标本采集后应迅速至于冰上或者4 ℃以下保存，
因为流感病毒对热很敏感
暴发疫情标本采集
采集发病3天内流感样病例的鼻、咽、咽鼻拭子标 本，必要时可采集急性期（发病7天内）和恢复期 （发病2-4周）双份血清标本。每一起暴发疫情至少 采集10份咽、鼻拭子标本（如果现症病例在10例以 下的，应全部采样）。 不能明确病原的可增加采样批次和数量。 标本运输：4℃条件下，于24小时内运送至流感监 测网络实验室 。
临床标本处理
鼻、咽拭子：为带有聚丙烯纤维的拭子标本，应 先将带有聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取 出。 鼻咽抽取液：用干净灭菌的毛细吸管在无菌条件 下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，置4℃ 待其自然沉淀5～10min，取上清。上清液可直 接接种或低温保存。 组织标本的处理：取肺组织标本放至平皿中，用 灭菌生理盐水清洗肺组织2～3遍，研磨成组织悬 液，配置成10％～20％的组织悬液，2000rpm离 心10min，加入抗菌素，取上清直接接种。 如原始采样液中未加入抗菌素，应在标本接种前 补加，庆大霉素终浓度为10mg/mL，青/链霉素 （终浓度:青霉素G 100U/mL,硫酸链霉素 100μg/mL），混匀后置4℃过夜或作用2h后进行 接种。
传染病标本采集,运送与实验室检测注意事项
传染病标本采集,运送与实验室检测注意事项下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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临床病毒学检测标本采集、保存、运输制度1
临床病毒学检测标本采集、保存、运输制度临床检测标本包括：体液、血液、分泌物、排泄物及组织等。
能否发现一未知病原，在很大程度上取决于是否能正确、及时收集标本。
标本采集、运输和保存的各环节都至关重要，对于检测结果的准确性及有效性影响极大。
在常规检测中这些样本可能产生病毒颗粒气溶胶而造成交叉感染，为了防止检验人员的交叉感染，医学实验室安全管理及标本的采集、运送、检测和处理的安全性是十分重要的环节。
一、标本的容器运输容器、消毒标本容器、运输媒体、特殊测试的采集和运输的整套工具要严格要求。
只有用合适的容器采集和运输的标本才能用于测试。
标本容器必须认真加固以防泄漏。
超过保质期的容器也不能用于采集和运输。
必须在洁净的环境中培养。
放在适当倾斜的琼脂或运输媒体上。
用旋紧的试管，不要侧旋。
病毒分离接种标本必须冷藏。
不能使用琼脂培养基和混合培养。
把倾斜管或病毒放在能密封的塑料袋中。
按要求来放置和运输以上物品。
根据原始容器的尺寸来选择传染性标本运输容器。
二、贴标签未经合适标明的传染性疾病标本不能用于检测。
标本必须写上病人的名字和一个惟一的识别号码。
如果使用独立的分类标签，标签要贴紧以防在运输过程中遗失。
在贴标签的过程中不能影响标本的染色。
每个切片都要贴上标签（仅在放切片的容器上贴标签是不行的），并且必须贴在接种标本切片的同一侧面。
三、检测申请单传染病标本必须具有一个测试申请单或电子申请单。
必须注明标本的来源。
对于标本的处理来说患者的资料，采集的时间和地点，临床病史，症状和诊断，抗生素的疗程，和任何可能的微生物记录。
如果一种微生物送去鉴定，可能含有的其他微生物也必须指出。
四、运输运输的时候单纯追求速度是不对的。
迅速处理使病原体的生活能力的损失降到最低，并保证菌丛有足够的数量用于精确鉴定。
五、检验报告一旦得到精确数据就可得到初步结果。
最终结果一般在培养完成的时候得到。
如果需要的话，只要一出现任何阳性，显著的染色或培养（如：血液，CSF，无菌的体液）就可把初步结果告知医生或实验室。
流感病毒核酸检测—标本运输
流感病毒核酸检测—标本运输
概述
本文档旨在介绍流感病毒核酸检测标本的正确运输方法。
标本运输的合理性和规范性对于确保检测结果的准确性至关重要。
标本选择
在进行流感病毒核酸检测标本运输前，应首先选择合适的标本类型。
一般而言，下呼吸道标本（如咽拭子、鼻拭子、痰液等）是流感病毒核酸检测的常用标本。
标本采集
标本采集过程中，务必注意以下要点：
- 使用无菌采集工具进行标本采集；
- 遵循相关标本采集操作规范，确保采集到足够的标本量；
- 避免标本污染，确保标本的纯净度。
标本包装
在标本运输过程中，正确的包装是保证标本完整性和安全性的关键。
- 使用合适的，如密封的塑料袋或标本收集管；
- 标记标本信息，包括患者姓名、采集日期和时间等；
- 在包装中添加吸收剂，以保持标本的湿润状态。
标本运输
标本运输的目的是确保标本在运输过程中的稳定性和安全性。
- 使用适当的运输，如特制冷藏盒或冰袋；
- 保持适当的温度，根据标本类型选择合适的运输温度，如冷藏运输或干冰运输；
- 注意防止标本的震动和碰撞，减少标本破损的风险。
运输信息记录
在标本运输过程中，记录运输信息是非常重要的。
- 记录标本的运输起始时间和截止时间；
- 记录标本的运输温度，确保温度要符合标本运输要求；
- 记录每个运输阶段的标本位置，以便跟踪运输进展。
结束语
流感病毒核酸检测标本的正确运输过程对于确保检测结果的准
确性至关重要。
请在进行标本运输时，遵循本文档所述的正确方法，确保标本完整性和安全性，并记录相关信息以便跟踪运输进展。
流感病毒临床标本的采集方法运输保存
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
八、临床标本的的处理原则
临床标本处理后，将原始标本分为三 份:一份（40％）用于鸡胚接种，一份 （30％）用于MDCK细胞接种，一份 （30％）保存待复核用。对于病毒分离 阳性的标本－70℃保存6个月
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
七、临床标本的处理方法
• 含聚丙烯纤维的拭子的采集标本:先将含聚丙烯纤 维的拭子在管壁反复挤压后取出
• 鼻洗液标本:充分振荡标本管，将粘液打碎。置4℃ 待其自然沉淀5～10分钟，取上清5 ml。上清液可 直接接种或低温保存
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• 鼻咽吸取液：用干净灭菌过的毛细吸管，在无 菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液， 同样置4℃待其自然沉淀5～10分钟，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存
• 采样液应包含有一定量的蛋白质和抗菌素
• 标本采集后应立即放入适当的采样液中低 温保存
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
Eagel`s基础培养基
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
采样液抗生素含量
抗生素名称 庆大霉素 抗真菌素
终浓度 0.1mg/ml 2Ug/ml
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
六、临床标本的处理原则
• 新鲜的标本送至实验室后，病毒分离标本应 尽快进行接种分离，24小时内能进行接种的 可置于4℃保存，如未能接种应置-70℃或以下 保存
• 冻存的标本送到实验室后，24小时内能进行 病毒分离的，可以放置4℃保存。如未能分离 的标本应置-70℃或以下保存
流感病毒的分离技术操作规范
流感病毒的分离技术操作规范病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。
目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。
通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。
另外由于“O”相毒株的重现，MDCK细胞对“O”相毒株的敏感性远高于鸡胚，所以MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。
但是目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。
具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK 细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。
若同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下温度保存的原始标本进行鸡胚双腔接种（羊膜腔和尿囊腔），进行病毒分离。
（一）实验室生物安全级别和生物安全规定1. 流感病毒分离实验室生物安全级别：季节性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二级；高致病性禽流感病毒生物安全三级。
2. 流感病毒分离实验室生物安全规定应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。
（二）流感病毒的细胞分离标准操作规程（所列试剂生产厂家及货号仅供参考）1. 试验材料（1）刚75-90％成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶（2）TPCK处理胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）（SIGMA T8802）（3）HEPES缓冲液,1M母液（4）D-MEM培养基（高糖，含有L-谷氨酰胺），Hank's 液（5）青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G，10,000µg/mL硫酸链霉素)（6）牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液（GIBCO Cat No 15260）（7）处理好的临床标本0.5mL（标本处理参见附件1第一部分）（8）无菌移液管：1mL和10mL2. 培养基和试剂的准备（建议：经常检查试剂的有效期）（1）500mLD-MEM液中加入：a) 青、链霉素母液5mL(终浓度达：100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素)b) 牛血清白蛋白组分V12.5mL(终浓度:0.25％)c) H EPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)d) 加入7.5%NaHCO310-15mL（终浓度：2-3%)（2）病毒生长液：再向上述培养液中每500mL加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的浓度为2µg/mL。
流感病毒的分离培养与鉴定
流感病毒的分离培养与鉴定一．实验目的1.掌握临床呼吸道病毒感染标本的采集、处理及送检原则。
2.掌握病毒滴度测定—红细胞凝集试验原理。
3.熟悉流感病毒的分离培养---鸡胚尿囊腔接种技术。
4.熟悉鸡胚尿囊液收集方法；红细胞凝集试验操作方法、结果观察及病毒滴度判定。
二．实验原理1.病毒分离是流感诊断最常用和最可靠的方法之一,流感监测最主要的目的为:及时发现并抓住有意义的流感病毒新变种,尤其大流行株，用于诊断试剂的制备、疫苗的生产及疫情预报，因此,在流感诊断中任何方法都不能完全替代病毒分离这一方法，通常多用鸡胚来分离流感病毒。
2.3.血球凝集试验原理：某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集多种哺乳类动物和鸟类的红细胞,出现红细胞凝集现象，简称血凝现象。
这是由于流感病毒表面的血凝素是糖蛋白成分，红细胞表面有糖蛋白的受体,流感病毒血凝素结合在红细胞表面的糖蛋白受体上,从而发生红细胞凝集。
三．实验步骤1.标本采集→杀灭杂菌→接种→鉴定病毒类型2.培养：(1)取孵育10~12d鸡胚,在检卵灯下画出气室界线,于胚胎附近无大血管处画出标记作为注射入口。
(2)将卵置于卵架上,消毒标记处,用无菌剪刀尖在标记处打一小孔。
(3用灭菌注射器吸取流感病毒液0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射。
(4)注射后,用无菌胶布封孔,置35度温箱孵育。
(5)每日在灯下检视鸡胚情况(若鸡胚在接种后24h内死亡为非特异性死亡,应弃之)。
3.鉴定：(1)取小试管9支（或采用塑料凹孔板）,于第一管加入生理盐水0.9毫升,其余各管均加入0.25毫升。
(2)于第一管注入羊水或尿囊液0.1毫升，充分混匀,吸出0.75毫升,于第二管注入0.25毫升,其余0.25毫升弃入消毒液中(切不可乱弃）。
从第2管起对倍稀释至第8管。
(3)各管加入0.5%鸡RBC 0. 25m1，摇匀后室温静置60分钟。
30分、45分、60分各观察结果一次,以阴性对照红细胞沉积结果为准。
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在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填 写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记表”，用另一 塑料袋密封；
将装标本的密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以 柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者 2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密 封。所有容器必须有生物危险标识。
感病毒对热很敏感 • 标本管标识明确：医院名称，标本号，患者姓名，性别，
采样日期 • 标本采集后尽量在24小时内送到实验室进行病毒分离。
24小时内未能进行病毒分离的标本应放-70 ℃或以下
血清学标本注意事项
• 血清学最好采集急性期和恢复期的双份血清塑料管里， 拧紧；
膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部
的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育
不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
流感病毒操作要求生物安全规程
禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床 标本和已知标准病毒
禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同 动物的标本
国家流感中心 张烨
标本种类
临床标本
鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物、漱口液等
血清标本
病人的急性期和恢复期血清双份血清
临床样本的选择
采样对象：流感样病例（没有服用过抗病毒药物 ）、人禽流感待 查病例
流感样病例:发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者， 而缺乏其它的实验室确定诊断依据
采集时间：病人发病后的头三天
RT-PCR 组成成分
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
94 温 度 72 （℃）
55
22
1
2
3
高温变性低温退火 适温延伸
DNA 2
形
成变 条性 单 链 DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保 存
鉴定方法
血清学方法
红细胞凝集及凝集抑制试验 神经氨酸酶活性及抑制试验
其它方法
核酸检测 快速检测试剂盒
流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结 合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构， 许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。 因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当 血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制 凝集现象出现
临床标本处理后，将原始标本分为三份，一份（40 ％）用于鸡胚接种，一份（30％）用于MDCK细胞 接种，一份（30％）保存待复核用。对于病毒分离 阳性的标本－70℃保存6个月
鼻咽拭子 或含漱液
快速诊断
病毒分离
样本采集
分型鉴定
双份血清
血凝抑制试验 或中和试验
2020/5/6
14
标本接种注意
最好24小时内进行病毒分离
采样液的要求
• 采样液应包含有一定量的蛋白质和抗菌素 • 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hank’s液，Eagel’s细胞液
采集后应立即放入适当的采样液中低温保存
采样液的抗生素含量
抗生素名称 庆大霉素 抗真菌素
终浓度 0.1mg/ml 2Ug/ml
临床标本的采集法
鼻拭子 咽拭子 鼻咽吸取物 漱口液
病毒分离标本实验室的保存条件
24小时内进行病毒分离，4℃保存 24 ～ 48小时内不能进行病毒分离的－70℃或以下保存
常采用鸡胚和MDCK细胞分离方法
流感病毒分离：生物安全二级实验室 禽流感病毒分离：生物安全三级实验室
正常细胞
病变细胞
细胞分离流感病毒 选择敏感MDCK细胞 细胞70～90％成片 TPCK－胰酶 7.5%BSA
鸡胚分离流感病毒 9日龄SPF鸡胚 尿囊腔和羊膜腔接种： 季节型流感病毒尿囊腔和羊膜腔接种分离病毒 人禽流感病毒尿囊腔分离病毒
不同胰酶TCID50检测结果
MCDK细胞代数 21代 46代
TPCK-胰酶 8.75 9
普通胰酶 3.5 3.5
MDCK细胞敏感性试验结果
MDCK细胞TCID50检测结果
MDCK细胞代数 19代 21代 35代 41代 45代
TCID50 9 9 9.5 9 9
使用TPCT-胰酶, A/北京/西城/156/2006(H3N2) C4
用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带
或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊
• 使用的试剂可靠无误 • 红细胞悬液浓度是否合适 • 处理后的血清有无残余非特异性凝集素 • 选用标准抗血清是否准确 • 读取HA试验的结果是否正确 • 4个血凝单位是否准确 • 红细胞阴性对照 • 待鉴定病毒确保没有被细菌污染 • 稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确
实验方法 病毒组织培养（病毒分离） 血清学检测 IF 或 EIA
若采集的是鼻咽拭子，同一时间采集的标本可放入同 一管内
注意：采集禽流感疑似病人标本 最好是下呼吸道吸取物
临床样本收集的注意事项
• 操作要细心，严防标本间交叉污染，要做好自我保护 • 采集禽流感疑似病人的标本，最好采集下呼吸道吸取物 • 采集标本要有一定力度 • 标本采集后应迅速至于冰上或者4 ℃以下保存，因为流
RT-PCR方法
荧光定量RT-PCR方法
优缺点
肯定 至少约5-7天
可靠 耗时
敏感性波动在40-100%，特 异性在86-99% 敏感特异，检出病毒的最小 量为0.01-0.1 TCID 50
敏感特异，检出病毒的最小 量为0.006-0.02 TCID 50 ， 可定量分析
➢RT-PCR ➢Real-Time PCR ➢NASBA ➢MDD
流感病毒临床标本的运送要求
新鲜的临床采集标本
应在4℃条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室; 未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存
冻存的临床采集标本
应在冻存的条件下，低温送至实验室
❖含聚丙烯纤维的拭子的采集标本:先将含聚丙烯纤维的拭子在 管壁反复挤压后取出
❖鼻腔或咽部洗液的标本:充分振荡标本管，将粘液打碎。置4℃ 待其自然沉淀5～10分钟，取上清5 ml。上清液可直接接种或 低温保存