几种常用特殊染色操作过程中的要点

1.氧化（KMnO4）：使网状纤维内羟基转变为醛基。<选择性> 2.漂白（H2C2O4）：棕色变为无色。 3.媒染（铁明矾）：增加网状纤维对银氨液的选择性。 4.浸银（氢氧化银氨）：银氨液中Ag（NH3）2+被组织吸附后与醛基结合。 5.还原（甲醛）：与网状纤维结合的银氨配位化合物还原成黑色的金属 银。
2
四、淀粉样物 刚果红法（甲醇刚果红、碱性刚果红）、甲基紫法 五、色素 含铁血黄素（Perls）、黑色素（Masson-Fontana）铜（罗 丹明、红氨酸） 六、糖类物质 糖原（PAS）、黏液物质（AB-PAS、AB） 七、脂内物质 中性脂肪（苏丹Ⅲ、Ⅳ、油红O）
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八、神经组织 尼氏体（硫瑾、甲苯胺蓝）、神经髓鞘（变色酸2R、砂罗 铬花青） 九、肝脏穿刺 Masson、网状纤维、含铁血黄素、PAS、铜等。 十、肾脏穿刺组织 Masson、六胺银、PAS、刚果红等
几种常用特殊染色操作要点
徐开军 云南省第三人民医院病理科
目前常用特殊染色包括几类：
一、病原微生物： 真菌（PAS、GMS）、抗酸杆菌（苯酚碱性品红）、幽门螺 杆菌（W-S、硼酸亚甲蓝、碱性品红）、乙肝病毒（地衣红、 维多利亚蓝） 二、结缔组织： 胶原纤维（VG、Masson）、网状纤维（氢氧化银氨法）、 弹力纤维（维多利亚蓝、醛品红品红）、 三、肌组织： 横纹肌（PTAH）、早期心肌病变（变色酸亮绿、HBFP）
<棕色瓶、密封保存>
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染液配制中的注意事项
1.配制染液玻璃容器必须清洁干净，最好采用重铬酸钾清洁液浸 泡过夜，沥干洗液后再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2-3次。 2.高锰酸钾浓度不宜超过1%（氧化速度过快后自身易被氧化）。如 用酸性高锰酸钾（加强氧化、增强染色力）氧化，会减弱银氨液对 细胞核的着染，需复染胞核。若采用无色的氧化剂（高碘酸）则 无需漂白的过程。 3.切片厚度在3-4um（过厚易造成脱片）。 4.配制氢氧化银氨液：硝酸银采用较高纯度级（GR/AR），密封、 棕色瓶存储;氢氧化钾干燥密封保存，切勿使其潮解；氢氧化铵 使用后密封，保持浓度，定期及时更换。
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5.苯酚碱性品红有时易出现沉淀，染色时注意吸取上清液进行滴 染。 6.陈旧病变中的结核杆菌，染色时着色减弱，有时甚至不能显示， 染色前先用高碘酸加以氧化可以恢复这些菌的着色性。
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（六）染色结果
抗酸杆菌（结核杆菌和麻风杆菌）—红色 胞核—淡蓝色
结核杆菌
麻风杆菌
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结合组织学形态特征以及阳性对照情况来判别。
时可使用更长时间）
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（六）染色流程
1、切片常规脱蜡至水。 2、0.25%高锰酸钾液氧化5min。自来水稍洗。 3、2%草酸液漂白1-2min。自来水充分洗，蒸馏水洗。 4、2%硫酸铁铵液媒染5min。自来水数秒，蒸馏水稍洗。 5、Gomori银氨液作用30s-5min。蒸馏水稍洗。 6、4%甲醛液还原几秒-3min。自来水洗。 7、常规脱水透明，中性树胶封固。
正
电
荷
的
Ag
（
NH3
）
+ 2
（二氨合银离子）和带有负电荷的NO3-、CO32-、CH3COO-、OH-等。
3.背景复染不同：VG复染、核固红、不复染。
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（三）网状纤维染色原理
经氧化，网状纤维表面被覆糖蛋白中己糖毗邻的羟基转变为醛基，银 氨液（二氨合银离子<Ag（NH3）2+>）被组织吸附后并与醛基结合，经甲醛 还原、水洗后剩余的银离子还原为黑色的金属银而沉淀。
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3.高锰酸钾氧化时间不可过长，过长容易影响组织细胞形态的观 察。 4.原法中甲醛还原后用0.2%氯化金调色、5%硫代硫酸钠固定及VG 液复染，实际工作中可省略。（不进行复染结果对比同样清晰） 5.根据诊断的需要，可进行与其他（如+Masson）染色套染。
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（七）染色结果
网状纤维—黑色 胶原纤维—黄色至棕黄色 胞核—褐色
（二）网状纤维染色方法的选择
染色方法有十余种：
（Gomori、Gordon-Sweet、James、Foot、改良Lillie）
不同点：
1.所用氧化剂/浓度（KMnO4/高碘酸；0.25%、0.5%）不同。 2.所用银氨液（氢氧化银氨、硝酸银氨、碳酸银氨等）不同。每
种
银
氨
液
都
处
于
离
子
状
态
，
离
解
成
带
1.染色方法 高碘酸-无色品红法（PAS）、六胺银法（GMS）、阿尔新蓝 法（AB（pH2.5）-新生隐球菌） 2.方法的实用性： PAS法（结果对比鲜明、操作简单、染液易保存） GMS法（结果对比鲜明、操作繁琐、染液复杂） AB法（应用于新生隐球菌的鉴别诊断）
1.化学试剂的选择： 苯酚：无色；碱性品红：质量优质。 2.染液的配制（染色成功的一半）： 染液的配制是关键因素 3.对照的设立： 阳性对照设立、保证结果的准确可靠 3.镜下的仔细观察： 尤为关键（有时常常存在几条杆菌）
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三、真菌染色 ——高碘酸-无色品红法（PAS法）
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（一）真菌的形态结构
所致感染多为慢性感染过程，长期迁延，并有破 坏性的组织病变。
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（二）抗酸杆菌染色原理
抗酸杆菌菌体胞壁上含有不等量的类脂质（磷脂、脂肪酸、 蜡质D），并由糖脂形成一个蜡质的外壳，它能与苯酚碱性 品红结合形成复合物，用盐酸酒精脱色能够抵抗酸的漂洗。 因而抗酸杆菌呈红色。
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（三）染色化学试剂选择
①苯酚/石碳酸：无色结晶，特殊气味，呈弱酸性，时间过 久/长期暴露在空气受到氧化而变成粉红色。有毒、腐蚀性， 常温下微溶于水（熔点43°C），温度达60°C时，能与水以 任何比例互溶。 ②碱性品红：黄绿色闪光结晶块状/暗红色粉末，微溶于水
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二、抗酸染色
——苯酚碱性品红法（ Ziehl-Neelsen法）
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（一）抗酸杆菌的形态结构
抗酸染色是针对抗酸杆菌而言，属分枝杆菌属。
是一类细长略弯曲的杆菌
其种类较多，有致病性和非致病性两类。
引起人类疾病：结核杆菌、麻风杆菌、牛分枝杆菌
因其本身的特殊性（菌壁中含不等量脂质）
一般不易着色，但一经着色后可抵抗酸类脱色（抗酸杆菌）
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一、网状纤维染色 ——氢氧化银氨法（Gomori法）
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（一）网状纤维的形态结构
较细的纤维组织、短、分支多，交织成网状
（与胶原纤维共同为细胞丰富的器官起到支撑作用）
HE呈淡红色，银氨液浸染、甲醛还原后呈黑色
（嗜银性/嗜银纤维：黑色）
主要由Ⅲ型胶原蛋白构成，表面被覆糖蛋白
（PAS染色：淡紫红色）
6
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套染-Masosn+Gomori
对照：可采用组织较小的肝脏穿刺组织 与其他染色共同应用
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（八）小结——做好网状纤维的要素
1.优质化学试剂的选择： 硝酸银、氢氧化钾/钠、氢氧化铵 2.合格的银氨液配制（染色的关键）： 氨水的量 3.甲醛还原后的镜下控制： 深浅适宜 4.染液的保存期和配制的量： 2-8°C冰箱保存、不宜多配、滴染。 1-6月（出现沉淀）更换
（溶解度0.4%），溶于酒精（溶解度7.6%）。
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（四）染液的配制及保存
①5%苯酚水溶液：（临时配制）
先在恒温箱中加热溶解，吸取5ml与95ml蒸馏水混合配制。
②苯酚碱性品红液：（保存期1年）
碱性品红 无水乙醇 5%苯酚水溶液
0.5-1g 溶解
（水浴加热）
10ml
充分混合 过滤
2-8°C冰箱保存
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染色过程中的注意事项
1.网状纤维经媒染和浸银染色后蒸馏水洗时间以数秒为佳。水洗 时间过长：银的还原性减弱（网状纤维不够黑）；时间过短：银 的还原性不均匀（着色程度不均）。 2.染色中的镜下观察： 网状纤维经4%甲醛还原，自来水洗后显微镜下观察。如浸银不足 （网状纤维不够黑、一般提示银氨液需要更换），可在自来水洗 后，再滴加银氨液染色1-2min，蒸馏水洗后4%甲醛还原；如浸银 过度，可用高锰酸钾液液稍处理（对比不清晰），再经自来水洗 。可获得一定效果。
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5.配制银氨液需使用蒸馏水/去离子水，以防出现银盐沉淀。 6.配制银氨液时，所滴加氢氧化铵的量很关键，边加边摇动至沉 淀刚好溶解。 7.配好的银氨液对光及空气较为敏感（长时间暴露在光/空气作用后 均易离解而析出银盐沉淀），应用棕色试剂瓶盛装并密封避光后置 于冰箱（2-8°C）保存。（理论上保存使用几周更换，实际工作中有
＋蒸馏水，洗涤沉淀（50-100ml蒸馏水） <反复/3次，沉淀不浑浊>
留下沉淀及少许上清液（4ml）
<保留沉淀物质>
逐滴＋氢氧化铵（一次1-2滴加入）
<边加摇晃>
至沉淀逐渐完全溶解
<无色溶液>
逐滴＋10%硝酸银，至刚出现浑浊 加氢氧化铵一至数滴，使沉淀消失
＋蒸馏水至40ml，2-8°C冰箱
<浑浊状态>
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（四）染色化学试剂选择
1.高锰酸钾：强氧化剂，具腐蚀、刺激性。在酸性溶液（氧化力最强） 易分解（光有催化作用），在实验室用棕色瓶存放。 2.草酸：有毒性、腐蚀、刺激性及很强的还原性。（还原剂和漂白剂） 3.硫酸铁铵/铁明矾：易吸湿。对光敏感。在水中溶解缓慢。（媒染剂） 4.Gomori银氨/氢氧化银氨：硝酸银、氢氧化钾、氢氧化铵。（密封保存） ①硝酸银：氧化性较强。遇有机物（沾上皮肤）变灰黑色。常因纯度不 高被保存于棕色瓶。与部分有机物或硫、磷混合研磨、撞击可引起爆炸。 ②氢氧化钾：呈强碱性及具有腐蚀性。极易吸收空气中水分而潮解。 ③氢氧化铵：不稳定，易分解而生成氨和水。具有挥发性，应密封保存 在棕色瓶中。
<无色溶液>
<棕色瓶、密封保存>
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Gomori银氨液-2
甲液：硝酸银(10.2g)+蒸馏水100ml 乙液：氢氧化钠（3.1g）+蒸馏水100ml
甲液（5ml）+乙液（5ml） 逐滴＋氢氧化铵（一次1-2滴加入）
至沉淀逐渐完全溶解
补加＋氢氧化铵（4滴）
＋蒸馏水至50ml，2-8°C冰箱
<出现棕黑色颗粒沉淀> <边加摇晃> <无色溶液>
真菌是一类真核细胞型微生物，种类繁多，分布极广。 对人体有致病性真菌和机会致病性真菌有上百种之多。
酵母型真菌（新生隐球菌）
单细胞
呈圆形/椭圆形
真菌
类酵母型真菌（白假丝酵母）
菌体呈丝状，并分枝交织成团 曲菌、白色念珠菌、
多细胞
（基本上都是由菌丝和孢子组成）
毛霉菌
（按形态、结构分类） 35
（二）真菌染色方法的选择
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（五）染色流程
1、切片快速进行常规脱蜡至水。 2、滴加苯酚碱性品红染液室温下染30min-60min（气温高低 调节），或在恒温箱加热（立式染缸）染色15-20min。 3、1%盐酸酒精分化数秒，至组织呈淡粉/无色，自来水洗。 4、0.1%亚甲蓝水溶液复染30s-2min，自来水洗。 5、快速梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
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抗酸菌
结核杆菌
麻风杆菌
结核杆菌：细长、稍弯曲，长短粗细不一，常单条散在分布， 多见于结核性干酪样坏死灶，在陈旧的病灶中，可 呈颗粒状、短棒状等，在病理组织中有多形性变化。
麻风杆菌：较粗短、笔直，常呈束状排列或聚集成堆 抗酸杆菌在退行性改变时可呈颗粒状，随后染色减弱甚至完全不着色。
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（七）小结——做好抗酸染色要素
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染色过程中的注意事项
1.传统染色法采用酒精灯加热以缩短时间（15-20min），其染色 结果相对不稳定。室温中染色30-60min能达到较好效果，冬天 可在立式染缸进行加热（60°C）染色（20min）。 2.盐酸酒精分化要适度，切片经水洗后应为淡红/无色为宜。 3.亚甲蓝复染时间为30s-2min，避免过染。复染后迅速乙醇脱 水，防止脱色过度（过浅对于坏死组织对比不鲜明）。复染过深或 过浅都会造成对比不清晰。 4.在苯酚碱性品红染色时和盐酸酒精分化步骤之间尽量不要使 得切片干燥。
90ml
苯酚作为媒染剂，可提高染液的染色性能，使碱性品红与抗酸杆菌牢固结合。
③0.1%Biblioteka Baidu甲蓝液：（保存期1年）
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染液配制中的注意事项 1.苯酚如呈红色（受到氧化），应及时更换。 2.碱性品红须选择纯度较高的试剂配制时较难溶解，应注意 其溶解程度。 3.因抗酸杆菌菌体特殊性，可在苯酚碱性品红液内加入适当 的5%-10%的Triton X-100或5%-10%的Tween-20表面活性剂 （碱性品红酒精液10ml+5%苯酚水溶液85ml+活性剂5ml，用前过滤）， 来增加染液的渗透力（易产生沉淀）。 4.对于脱钙组织，强酸脱钙可能会破坏抗酸性，最好使用弱 酸（甲酸）脱钙。
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（五）染液的配制及保存
①0.25%高锰酸钾：（定期更换）
②2%草酸：
③2%硫酸铁铵： ④Gomori银氨液：（使用、保存几周）
棕色瓶 2-8°C冰箱保存
（染色成败的关键）
⑤4%中性甲醛：（定期更换）
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Gomori银氨液-1
10%硝酸银(3ml)+10%氢氧化钾(1ml)
<出现棕黑色颗粒沉淀>