5-蚕豆根尖细胞微核检测技术

蚕豆根尖细胞微核检测技术
第6周
实验目的
❖了解微核检测的原理和毒理遗传学意义 ❖学习蚕豆根尖微核检测技术
实验原理
微核(micronuclei,MCN): 是真核生物细胞经辐射或化学药物作用而产生的一
种游离于主核之外的异常核结构。在细胞间期，微核呈 圆形或椭圆形,直径大约是细胞直径的1/20～1/5。 微核产生过程:
蚕豆根尖
实验步骤
➢浸种催芽 ➢用高盐或重金属其中一种液体处理根尖，设对照 （自来水），三次重复，室温放置30分钟； ➢用自来水冲洗干净，放回铺有滤纸的培养皿，带回 宿舍培养24h后，带到实验室滴加固定液固定，移入 70%乙醇保存。用于观察。
第5周已完成
➢HCl解离：将酒精倒出，清水漂洗2次，加入6mol/L HCl，室温下解离10min至根尖软化； ➢染色压片：倒去HCl，清水漂洗2次，每次3-5min。 再用醋酸洋红染色，取根尖分生区压片观察； ➢显微观察、统计微核细胞数目：每一处理观察3个根 尖、1000个细胞，统计MCN ‰ ，计算污染指数
评价指标
样品实测MCN ‰平均值
污染指数(PI)=
对照组MCN ‰平均值 0-1.50区间基本没有污染 1.51-2.00区间为轻度污染 2.01-3.50区间为中度污染 3.51以上为重度污染
实验材料
经NaCl、PbNO3、CrO3处理的蚕豆根尖分生区细胞
蚕豆：拉丁学名： Vicia faba Linn ，别称： 胡豆、佛豆、 川豆、倭豆、罗汉豆，双子叶 植物，我国四川分布最多，次 为云南和湖南
5对接入新的培养瓶中继续培养； 1瓶正交观察后放飞窗外 2瓶反交观察后各选5/10对接入新的培养瓶中继续培养 ➢ 7天后，F2幼虫出现，倒出F1亲本果蝇； ➢ 7天后，麻醉、观察全部F2成虫性状。
思考与分析
❖1只雄果蝇1生中可以交配多少次 ❖1只雌果蝇1生中可以产卵多少枚 ❖影响果蝇产卵的因素，卵是否都可以正常发育 ❖您掌控的培养瓶里果蝇产卵的情况与对策
学学期期实实验验安安排排
遗传学实验课
F1幼虫观察，释放伴性遗传及三点试验亲本 蚕豆根尖细胞微核检测技术 第6周
授课老师：黄文超
F1幼虫观察，释放伴性遗传及三点试验亲本
第6周
实验回顾Hale Waihona Puke Baidu
黑腹处（男女）果蝇
❖ 野生型（19#）：+ + + 红眼、长翅、直刚毛 ❖ 突变体（6#） ：w m sn 白眼、小翅、焦刚毛
➢2个同学为1组，首先把观察镜调试好，一人负责 一个号，将亲本蝇在麻醉瓶中麻醉，在观察镜下辨 明雌雄，迅速转入平放于固定在实验台上的相应培 养瓶，待麻醉的果蝇苏醒后，再将瓶放正即可；
➢每组同学将果蝇的3间婚房放置于25℃温室中培养；
第5周已完成
果蝇生活周期
❖ 受精卵：白色，椭圆形，22-24 h 后即可孵化
❖ 幼虫：三龄幼虫体头部稍尖、有一 黑色钩状口器，2-3天后化蛹
❖ 蛹：颜色变深褐色，蛹体逐渐硬化， 3-4天后羽化
❖ 成虫：羽化8 h后即可交配，雌蝇在 交配后2天即开始产卵，25℃下成 虫的可活15天
➢ 7天后，F1幼虫出现，在实验室外放飞亲本果蝇； ➢ 7天后，麻醉、观察全部F1成虫性状，并每组合各选
细胞经处理后，其有丝分裂后期丧失着丝粒的染 色体断片不能向两极移动，游离于细胞质中，在间期 细胞核形成时，则产生一到几个很小的圆形结构，这 就是微核。
微核
微核
微核
微核
微核形态
微核检测的意义: ❖微核率的大小与用药剂量或辐射累积效应呈正相关， 因此，微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体 或纺锤体的损伤程度。 ❖微核测试已用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、 新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等方面。
➢ 组合设计，在培养瓶上做好标记：
正交：野生型(+++) × 三隐性突变体（abc） 1瓶 解读：19#雌性（5头）与6#雄性（5头）共处一室，看能
发生什么故事? 反交：三隐性突变体（abc） × 野生型(+++) 2瓶 解读：6#雌性（5头）与19#雄性（5头）共处一室，看能
发生什么故事?
实验报告
蚕豆根尖微核观察统计表
微核数 细胞数 微千分率 平均微千分率 污染指数（PI） 处理组
对照组
样品实测MCN ‰平均值 污染指数(PI)=
对照组MCN ‰平均值
思考
❖微核检测的意义 ❖微核产生的影响因素与处理设计 ❖为何要用植物根尖分生区进行检测