1.细菌耐药机制

华南地区，2001.4-9，陆坚等
中国重症监护病房， 1994，陈民钧等
台湾的ICU病房， 2000，Hsueh PR
11.9% 大肠埃希菌 11.3% 肺炎克雷伯菌
香港，2000， Ho PL等
Leabharlann Baidu
11% 大肠埃希菌 13% 肺炎克雷伯菌
ESBLs 的 活 性
可以分解
不耐酶的青霉素类 第一、第二头孢菌素 第三代头孢菌素类 单酰胺菌素类
是质粒介导的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨
基β-内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素，并可被
克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂所抑制的一类β-内酰胺 酶。
ESBLs在分子生物学分类中属于A类酶，在Bush分类
中属于2be类酶。
染色体 （细胞核中）
质粒 （细胞质中）
示意图
ESBLs的分类
根据基因同源性不同分为：
碳青霉烯酶的地域分布
酶 分类 产生的菌属 发现的地区(首次报道的年代)
VIM-1 B VIM-2 B VIM-3 B VIM-4 B VIM-5 B VIM-6 B VIM-7 B SPM-1 B OXA-23/27 D OXA-24/25/26 D OXA-40 D OXA-48 D OXA-49 D OXA-54 D Sme-1/2/3 A IMI-1、NMC-A A KPC-1 A GES –2 A 铜绿假单胞菌 意大利(1999)、希腊 铜绿假单胞菌、不动杆菌 法国(2000)、韩国 铜绿假单胞菌 台湾(2001) 铜绿假单胞菌、不动杆菌 法国(2000)、韩国 肺炎克雷伯菌 土耳其（2002） 恶臭假单胞菌 新加坡(2002) 铜绿假单胞菌 北美(2004) 铜绿假单胞菌 巴西(2002) 不动杆菌 英国(2000)、 新加坡、巴西 不动杆菌 西班牙(2000)、比利时 鲍曼不动杆菌 法国(2002) 肺炎克雷伯菌 法国(2004) 鲍曼不动杆菌 中国(2003) 希瓦菌 法国(2002) （Shewanella oneidensis) 粘质沙雷菌 英国(1990) 、美国 阴沟肠杆菌 法国(1996)、美国 肠炎沙门菌、肺炎克雷伯菌 希腊、美国 铜绿假单胞菌 法国
OmpF OmpC
Beta Lactamases
(hydrolyzing enzymes)
penicillin binding proteins
PBP3 PB1b
CBD/RR
PBP2
PBP1a
临床上最重要的-内酰胺酶
超广谱-内酰胺酶（ESBLs） 高产AmpC酶
碳青霉烯酶
超广谱-内酰胺酶 （extended-spectrum -lactamases，ESBLs）
培南，可以引起青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类抗生素耐药
碳青霉烯类抗生素水解酶
Ｂ类酶(金属酶)
金属酶不仅对β-内酰胺酶的抑制剂敏感性差，而且能够水解包括 碳青霉烯类在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素。金属酶分别属于 Ⅲ类和B类酶。 多数金属酶对亚胺培南的水解能力强于美洛培南，但蜡样芽胞杆
菌Ⅱ酶和3b中的AsbM1对美洛培南的水解能力更强。
产生的菌属
铜绿假单胞菌、沙雷菌、 克雷伯菌、鲍曼不动杆菌 鲍曼不动杆菌 福氏志贺菌 不动杆菌 鲍曼不动杆菌 粘质沙雷菌 铜绿假单胞菌 肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌 木糖氧化产碱杆菌 铜绿假单胞菌 鲍曼不动杆菌 恶臭假单胞菌 铜绿假单胞菌
发现的地区(首次报道的年代)
日本(1991)、新加坡、韩国 意大利(2000) 日本(2000) 香港(2001) 葡萄牙 日本(2001) 加拿大(2002) 台湾(2001) 中国(2001) 日本(2002) 日本（2001） 意大利(2003) 意大利(2001)
菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。
亚胺培南是一种非典型的β-内酰胺类抗菌药物，其对铜绿 假单胞菌的活性，主要是通过一个特殊的孔蛋白通道 OprD2的扩散而实现的，一旦这一孔蛋白通道消失，则铜 绿假单胞菌对亚胺培南就会产生耐药性。
二、 产生灭活酶
细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解
或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位
金属酶筛选结果
2-巯基丙酸 IMP纸片
EDTA
2-巯基丙酸 IMP纸片 EDTA
阳性对照株结果
临床标本结果
2f 类酶（三维抑制试验）
Enzyme
Enzyme+ cloxacillion
Enzyme +EDTA
Enzyme+ clavulanic acid
金属酶筛选结果
2-巯基丙酸 CAZ
产碳青霉烯酶细菌感染的治疗
碳青霉烯酶
指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青 霉烯类抗生素的一类β内酰胺酶 分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类 酶。
碳青霉烯酶按其来源可分为
天然来源碳青霉烯酶
嗜麦芽寡养单胞菌的L1酶
获得性碳青霉烯酶（Ambler分子分类）
B类酶（金属酶）：IMP、VIM类及SPM-1
A类酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等
D类酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54
嗜麦芽寡养单孢菌
产生二种可诱导的染色体-内酰胺酶L1和L2： L1:(class B Zinc Enzyme)对 Ticarcillin 和 Aztreonam常敏感； L2:属于2e类，主要水解头孢菌素及单环酰胺类 的氨曲能，克拉维酸能抑制其活性。 特美汀在-内酰胺抗生素中对嗜麦芽寡养单孢菌 有较好的抗菌活性；
碳青霉烯类抗生素水解酶
Ａ类酶
分类属于２ｆ型，具有丝氨酸位点，可以被克拉维酸抑制。
包括阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌中由染色体介导的NMC-A、Sme1～Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎克雷伯菌中质粒介导的KPC-1、 KPC-2酶、铜绿假单胞菌中质粒介导的GES-2酶。
A类碳青霉烯酶都是青霉素酶 ，对亚胺培南的水解活性强于美罗
头孢菌素酶
其分子量大约为39000左右 其等电点大多≥9.0
能分解三代头孢菌素及单环酰胺类抗生素
不被β-内酰胺酶抑制剂所抑制，但可被氯唑西 林抑制
表型分类
低基础水平持续表达
低基础水平和高诱导产生 高基础水平持续表达
Process of Selection
Normal Population of Bacteria with Mutants
细菌耐药机制
一、外膜孔蛋白减少或丢失
细胞内抗生素浓度降低
膜孔蛋白(OprD):
膜孔蛋白
细胞外膜上的 某些特殊蛋白是
一种非特异性的、
跨越细胞膜的水 溶性物质扩散通 道。
“先天不足”
某些细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使 一些抗菌药物不能进入菌体内部，称为“内在性耐药” 或“固有性耐药”（intrinsically resistant），即这种耐 药并非是由于任何染色体的突变或是耐药质粒的获得所 致。
金属酶对氨曲南的水解能力都很弱。
碳青霉烯类抗生素水解酶Ⅲ
D类酶 （OXA酶）
在Bush分群中属于2d类，对苯唑西林的水解活性很强。 OXA型碳青霉烯酶对亚胺培南的水解活性较低，对头 孢他啶、头孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。 除OXA-23外，其它酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。
OXA型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上，
之前失去活性
细菌产生的灭活酶主要有：

β-内酰胺酶 氨基糖苷类钝化酶 氯霉素乙酰转移酶 MLS钝化酶
细菌耐药的主要机制
抗生素靶位点改变 孔蛋白改变，细胞壁/膜 通透性改变
灭活酶产生
β-内酰胺酶
由细菌产生的能够降解β-内酰胺类抗生素（如青 霉素类，头孢菌素类，碳青霉烯类抗生素等）， 使其抗菌活性减弱或消失的酶 至今，已发现β-内酰胺酶有四百多种
Cephalosporins Imipenem
Rapid diffusion due to small size and zwitterionic +/- charge)
-内酰胺酶
最主要的耐药因素
对-内酰胺抗生素造成威胁
slower diffusion due to bulk and ionic charges
或定位在I型整合子基因盒中，具备向其他菌种转移 的能力
碳青霉烯酶的地域分布(1)
酶
IMP-1 IMP-2 IMP-3 IMP-4 IMP-5 IMP-6 IMP-7 IMP-8 IMP-9 IMP-10 IMP-11 IMP-12 IMP-13
分类
B B B B B B B B B B B B B
Bush-Jacoby-Med eiros group 1 2a 2b 2be 2br 2c 2d 2e 2f 3 4
1989 Bush group 1（头孢菌素酶） 2a（青霉素酶） 2b（广谱酶） 2b’（超广谱酶） Not included Not included 2d 2e Not included 3（金属酶） Not included
TEM型
SHV型
80
46
CTX-M-1组 CTX-M-2组 CTX-M-8组 CTX-M-9组
CTX-M型
OXA型 其它型
37
18
20
http://www.lahey.org/studies/webt.htm.
ESBLs基因型流行情况
美国：TEM-10、TEM-12、TEM-26为主
英国：TEM-10、TEM-12为主 法国：SHV-3、SHV-4、TEM-3为主 希腊： SHV-5，CTX-M型 意大利：SHV-12 阿根廷：CTX-M-2 日本：TOHO-1，TOHO-2
ESBL ® Etest Prescribing Information – AB BIODISK
抑制剂增强的纸片扩散法
头孢噻肟 头孢他啶
头孢噻肟 ＋ 克拉维酸
头孢他啶 ＋ 克拉维酸
头孢菌素酶
大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌种、
弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、普鲁菲登 菌属菌种粘质沙雷菌等都能产生染色体介导 的AmpC酶。
比较稳定
头孢西丁 头孢替坦 碳青霉烯类最稳定
但是不同类型的ESBLs最优化的底物各不相同
ESBLs Detection Methods:Inhibition by Clavulanic Acid
© Ronald J. Jones （Reprinted with Permission of Author）.
如铜绿假单胞菌的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌
所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小 分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的1%。
“后天培养”
一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过 降低外膜的渗透性而发展成为耐药菌，即原有的孔蛋白通 道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，则细
Process of Selection
Mutants Selected Through Anitbiotic Pressure
阴沟肠杆菌
铺层培养: E. coli ATCC 25922
纸片上有待测菌
7、AmpC 纸片法试验
ß -内酰胺酶的检测
酶粗提液 CTX
酶粗提液+ 氯唑西林
酶粗提液+ 克拉维酸
Molecular class C A A A A A D A A B Not determined
Inhibited by CA EDTA + + + + + + + ?
β-内酰胺酶的分类方法
Antibiotic interactions with gram negative organisms
ESBLs 在
中
国
12.4% 大肠埃希菌 16.7% 肺炎克雷伯菌
北京解放军总医院， 1999.3-11，管希周等
上海市11家医院，2000 -2001，耐药性监测组
17.9% 大肠埃希菌
33.1% 肺炎克雷伯菌
浙江省12家医院， 1998.9-1999.6，俞云松等
34.0% 大肠埃希菌 38.3% 肺炎克雷伯菌 12.9% 大肠埃希菌 20.1% 克雷伯菌属菌 10% 大肠埃希菌 12% 肺炎克雷伯菌
酶粗提液+ 克拉维酸+ 氯唑西林
产AmpC酶菌株感染的抗生素选择
首选碳青霉烯类、四代头孢菌素（如头孢吡肟、头孢匹 罗）、替莫西林、对其敏感的非β－内酰胺类抗生素（ 如氨基苷类、喹诺酮类）
常规的青霉素类、三代头孢菌素、β-内酰胺酶抑制剂和
β－内酰胺抗生素合剂往往对该类细菌无效 正在研究中的特异性AmpC酶抑制剂如BRL42175、 Ro47-8284、Ro48-1256和Ro48-1220等虽然体外效果不 错，但距临床应用还有一定时间。