微生物课件(周德庆)第六章Part 1 微生物生长繁殖的测定和生长规律
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直接法测生长量——干重法
微生物细胞一般干重为湿重的10%-20%。
v离心法：离心→洗涤（一般5次）→干燥（100℃，105℃或 红外线干燥或真空干燥等） v过滤法： v滤纸——丝状菌 v醋酸纤维薄膜——细菌 该法适合菌浓较高的样品。
v单细胞微生物的典型生长曲线 v丝状微生物的生长曲线
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1. 单细胞微生物的典型生长曲线
生长曲线的制作
接种 适温培养 定时取样测 定生长量
将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新 鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间 取样，测细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增 长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。
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第一节 微生物纯培养分离及生长测定方法 第二节 微生物的生长规律 第三节 影响微生物生长的主要因素 第四节 微生物的培养法概论 第五节 有害微生物的控制
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①液体稀释法
首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效 果,使一支试管中分配不到一个微生物，如果经过稀释后的大多 数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养 物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物。 这种方法适合于细胞较大的微生物。
第六章 微生物的生长及控制
Growth and Control of Microorganisms
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生长与繁殖的概念
生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化 作用>异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过 程。 繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的 生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代 谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。 群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、 密度或浓度等来衡量。 由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长 的状况:个体生长→个体繁殖→ 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
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选择法
u原理：单细胞微生物，处于同一生长阶段的细 胞，体积和重量大致相等，处于不同生长阶段的 细胞，体积和重量大小不等。可用膜过滤或密度 梯度离心的方法来选择处于同一生长阶段的细 胞。
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采用显微分离法从混杂群体中直接分离 单个细胞或单个个体进行培养以获得纯 培养的方法。该方法要在显微镜下进 行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体， 适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取 单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制 成小液滴，在显微镜下选取只含一个细 胞的液滴来进行纯培养物的分离。
将微生物在无菌条件下进行系列稀释，然后取少量稀释液 加入到灭过菌的空平皿中，加入冷却到50℃左右的琼脂培养基 ，趁热混匀，进行培养。
1ml
1ml 9ml 1ml
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④平板涂布分离法（Spread Plate）
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典型的生长曲线 （Growth curve）
延 滞 期 对 数 期
稳定期
衰亡期
时期划分：按照生长速率常数（即每小时的分裂次数） R的不同
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用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板 表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果划 线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得 到单菌落。
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③倾注平板法（Pour Plate）
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平板菌落计数法
★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完 成操作），严格无菌操作； ★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀 处理、倾注平板时的培养基温度； ★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生 长的微生物。 ★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有样品 内菌体分布不均匀、以及不当操作等。
环境条件诱导法
u 原理：采用物理、化学因子使微生物细胞生长进行到 某个阶段而停下来，使先到达该阶段的微生物细胞不能 进入下一生长阶段，待全部细胞都达到该生长阶段后， 再除去该因子，使全部细胞同时进入下一个阶段。 如：鼠伤寒沙门氏菌在25℃培养时，不能进行细胞 分裂，但细胞物质的合成照常进行，当细胞变化到有 利于细胞分裂的37℃时，全部细胞进入同步分裂。
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二、微生物生长繁殖的测定方法
描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用 不同的测定指标。 （一）测生长量 直接法：干重法，体积法 间接法：比浊法，生理指标法 （二）计繁殖数：适用于单细胞状态的微生物或丝状微生物 的孢子。 直接法：血球计数板法 间接法：平板菌落计数法
Helmstetter-Cummings 膜过滤法
原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。 步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以 新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可 以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。
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特点：快速、 简便；但易受 干扰。
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间接法测生长量——生理指标法
§测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的 主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为 6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测 得粗蛋白的含量。 §其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化 碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。
①延滞期（lag phase）
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第二节 微生物的生长规律
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一、微生物的个体生长和同步生长
由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上 的困难。 •同步生长：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂 的状态，称为同步生长（synchronous growth），进行同步分 裂的细胞称为同步细胞。 •应用：同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一 相，彼此间形态、生化特征都很一致，是细胞学、生理学和 生物化学等研究的良好材料。
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直接法测生长量——体积法
采用在刻度离心管中自然沉降或离心的方法。
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间接法测生长量——比浊法
原理：在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成 正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因 此，借助于分光光度计，在一定波长下（450-650nm）测 定菌悬液的光密度，就可反映出菌液的浓度。
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直接法计繁殖数——血球计数板法
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血球计数板法
u原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均 匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单 位体积中的细胞数。 u适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不 适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不 易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。 一般细菌则采用细菌计数板。 u特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌 悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。 u缺点：不能区分死菌与活菌；不适于运动细菌的计数；需 要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。
将液体样品用弯玻璃棒涂布在固体琼脂平板上。
简单易行，但易造成机械损伤
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涂布平板法和稀释倒平板法的比较
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⑤单细胞（单孢子）分离法
硝 酸 纤 维 素 滤 膜 法
离 心 法
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同步生长的生长曲线
同步分裂的细胞很快会丧失其同步性！
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二、微生物的群体生长
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获得同步生长的方法：
同步培养法
诱导法
筛选法
化学诱 导 物理诱 导
过 滤法 区 带密度 梯度离 心法 膜 洗脱法
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间接法计繁殖数——平板菌落计数法
1ml 1ml
9ml 1ml 1ml
1ml
9ml
1ml
9ml 1ml 9ml
×2
×2
×2
最常用的活菌计数法。 将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保温 培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可以计 算出原菌液的含菌量。 直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以50~500为宜。 按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数原则， 以平板菌落数在30~300之间为报告依据。
第一节 微生物纯培养分离 及生长测定方法
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一、获得纯培养的方法
v纯培养(pure culture)——微生物学中把从一个细胞或 一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。 v获得纯培养的方法 ①液体稀释法 ②平板划线分离法 ③倾注平板法 ④平板涂布分离法 ⑤单细胞（单孢子）分离法
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②平板划线分离法（Streak Plate）
特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）
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直接法测生长量——干重法
微生物细胞一般干重为湿重的10%-20%。
v离心法：离心→洗涤（一般5次）→干燥（100℃，105℃或 红外线干燥或真空干燥等） v过滤法： v滤纸——丝状菌 v醋酸纤维薄膜——细菌 该法适合菌浓较高的样品。
v单细胞微生物的典型生长曲线 v丝状微生物的生长曲线
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1. 单细胞微生物的典型生长曲线
生长曲线的制作
接种 适温培养 定时取样测 定生长量
将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新 鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间 取样，测细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增 长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。
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第一节 微生物纯培养分离及生长测定方法 第二节 微生物的生长规律 第三节 影响微生物生长的主要因素 第四节 微生物的培养法概论 第五节 有害微生物的控制
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①液体稀释法
首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效 果,使一支试管中分配不到一个微生物，如果经过稀释后的大多 数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养 物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物。 这种方法适合于细胞较大的微生物。
第六章 微生物的生长及控制
Growth and Control of Microorganisms
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生长与繁殖的概念
生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化 作用>异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过 程。 繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的 生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代 谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。 群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、 密度或浓度等来衡量。 由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长 的状况:个体生长→个体繁殖→ 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
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选择法
u原理：单细胞微生物，处于同一生长阶段的细 胞，体积和重量大致相等，处于不同生长阶段的 细胞，体积和重量大小不等。可用膜过滤或密度 梯度离心的方法来选择处于同一生长阶段的细 胞。
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采用显微分离法从混杂群体中直接分离 单个细胞或单个个体进行培养以获得纯 培养的方法。该方法要在显微镜下进 行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体， 适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取 单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制 成小液滴，在显微镜下选取只含一个细 胞的液滴来进行纯培养物的分离。
将微生物在无菌条件下进行系列稀释，然后取少量稀释液 加入到灭过菌的空平皿中，加入冷却到50℃左右的琼脂培养基 ，趁热混匀，进行培养。
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④平板涂布分离法（Spread Plate）
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典型的生长曲线 （Growth curve）
延 滞 期 对 数 期
稳定期
衰亡期
时期划分：按照生长速率常数（即每小时的分裂次数） R的不同
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用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板 表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果划 线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得 到单菌落。
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③倾注平板法（Pour Plate）
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平板菌落计数法
★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完 成操作），严格无菌操作； ★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀 处理、倾注平板时的培养基温度； ★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生 长的微生物。 ★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有样品 内菌体分布不均匀、以及不当操作等。
环境条件诱导法
u 原理：采用物理、化学因子使微生物细胞生长进行到 某个阶段而停下来，使先到达该阶段的微生物细胞不能 进入下一生长阶段，待全部细胞都达到该生长阶段后， 再除去该因子，使全部细胞同时进入下一个阶段。 如：鼠伤寒沙门氏菌在25℃培养时，不能进行细胞 分裂，但细胞物质的合成照常进行，当细胞变化到有 利于细胞分裂的37℃时，全部细胞进入同步分裂。
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二、微生物生长繁殖的测定方法
描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用 不同的测定指标。 （一）测生长量 直接法：干重法，体积法 间接法：比浊法，生理指标法 （二）计繁殖数：适用于单细胞状态的微生物或丝状微生物 的孢子。 直接法：血球计数板法 间接法：平板菌落计数法
Helmstetter-Cummings 膜过滤法
原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。 步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以 新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可 以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。
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特点：快速、 简便；但易受 干扰。
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间接法测生长量——生理指标法
§测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的 主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为 6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测 得粗蛋白的含量。 §其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化 碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。
①延滞期（lag phase）
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第二节 微生物的生长规律
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一、微生物的个体生长和同步生长
由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上 的困难。 •同步生长：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂 的状态，称为同步生长（synchronous growth），进行同步分 裂的细胞称为同步细胞。 •应用：同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一 相，彼此间形态、生化特征都很一致，是细胞学、生理学和 生物化学等研究的良好材料。
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直接法测生长量——体积法
采用在刻度离心管中自然沉降或离心的方法。
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间接法测生长量——比浊法
原理：在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成 正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因 此，借助于分光光度计，在一定波长下（450-650nm）测 定菌悬液的光密度，就可反映出菌液的浓度。
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直接法计繁殖数——血球计数板法
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血球计数板法
u原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均 匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单 位体积中的细胞数。 u适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不 适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不 易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。 一般细菌则采用细菌计数板。 u特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌 悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。 u缺点：不能区分死菌与活菌；不适于运动细菌的计数；需 要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。
将液体样品用弯玻璃棒涂布在固体琼脂平板上。
简单易行，但易造成机械损伤
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涂布平板法和稀释倒平板法的比较
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⑤单细胞（单孢子）分离法
硝 酸 纤 维 素 滤 膜 法
离 心 法
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同步生长的生长曲线
同步分裂的细胞很快会丧失其同步性！
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二、微生物的群体生长
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获得同步生长的方法：
同步培养法
诱导法
筛选法
化学诱 导 物理诱 导
过 滤法 区 带密度 梯度离 心法 膜 洗脱法
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间接法计繁殖数——平板菌落计数法
1ml 1ml
9ml 1ml 1ml
1ml
9ml
1ml
9ml 1ml 9ml
×2
×2
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最常用的活菌计数法。 将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保温 培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可以计 算出原菌液的含菌量。 直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以50~500为宜。 按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数原则， 以平板菌落数在30~300之间为报告依据。
第一节 微生物纯培养分离 及生长测定方法
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一、获得纯培养的方法
v纯培养(pure culture)——微生物学中把从一个细胞或 一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。 v获得纯培养的方法 ①液体稀释法 ②平板划线分离法 ③倾注平板法 ④平板涂布分离法 ⑤单细胞（单孢子）分离法
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②平板划线分离法（Streak Plate）
特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）
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