胡萝卜愈伤组织的培养

胡萝卜愈伤组织的培养

一、实验目的

1、理解胡萝卜愈伤组织培养的培养方法及条件。

2、了解培养基的成分及掌握培养基的配制方法。

3、会对外植体胡萝卜进行预处理和正确消毒。

4、能严格按照操作规程进行无菌操作。

二、实验原理

在离体根培养中，首先解决外植体消毒问题，因为在自然条件下，根生长在土壤中，要进行彻底灭菌、消毒。为了消灭这种污染源，在把植物组织接种到培养基上之前必须要进行彻底的表面消毒；内部已受到真菌或细菌侵染的组织在组织培养研究中一般都淘汰不用。

胡萝卜的肉质根，其硬度较大，容易操作，可直接用灭菌剂进行处理。

无菌操作技术室用于防止微生物进入实验室区内的操作技术。

要求：①在进行无菌操作之前将界面上的细菌和病毒等微生物杀灭；

②操作过程中是界面与外界隔离，避免微生物的侵入。

目前，多数实验室都使用各种类型的超净工作台进行无菌操作。

三、实验材料与用具

1、器具：培养瓶、电磁炉、玻璃棒、酒精灯、解剖刀、镊子、酒精棉球（浓度为75%）、烧杯、废液缸、滤纸、玻璃棒、移液管、PH试纸

2、材料：新鲜健康的胡萝卜肉质直根

3、试剂、2.4-D、6-BA、大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液、蔗糖、琼脂、钙盐母液、无菌水、蒸馏水

四、实验方法与步骤

1、配制培养基

（1）、确定配方和配制量：根据实验需要，确定配制培养基的配方。

（2）、计算各种母液和药品用量：a、确定培养基配制量b、查看MS培养基母液的扩大倍数、植物生长调节剂母液浓度c、由母液用量=培养基配方浓度/培养基母液浓度*培养基配制量植物生长调节剂母液用量=培养基配方浓度/植物生长调节剂母液浓度*培养基配制量

（3）、量取：由表一的数据仔细量取相应的量并用托盘天平分别称取蔗糖、琼脂。（4）、溶解：a、在锅内加配制量60%左右的蒸馏水，至于电磁炉加热b、加入琼脂，加热不断搅拌，待琼脂完全溶化后加入蔗糖c、将所量取的各种母液的混合液倒入锅中，搅拌均匀d、琼脂必须完全熔化，以免造成浓度分布不均匀（5）、用蒸馏水定容：a、将完全溶解、混匀后的培养基倒入烧杯中b、加蒸馏水定容至规定体积。

（6）、调节PH（5.8）：用PH试纸将PH调制5.8。

（7）、分装：将配制好的培养基趁热分装到培养瓶中厚度为1cm左右。

（8）、封口：用橡皮筋扎紧封口膜。

（9）、标记：在瓶壁上写上标记，作好记录，准备灭菌

2、培养基灭菌：将培养基放入高压蒸汽锅中灭菌20min左右。

3、接种前的准备工作

A、外植体表面灭菌前的准备工作

（1）、接种室的清洁和消毒及超净工作台的开机和消毒：将接种室、超净工作台清理干净。用酒精棉球将超净工作台进行消毒（酒精浓度为75%）。

紫外灯+风机20min后关闭紫外灯并保持风机吹风状态。

（2）、将待用的培养基，无菌水、解剖刀、镊子、消毒溶液、培养皿、烧杯、玻棒、废液缸放到超净工作台上待用。

B、实验材料的准备

（1）、准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验材料；

（2）、实验材料的修整、刷洗、冲洗；

（3）、用洗衣粉水浸洗后再用自来水冲净

用试管刷和肥皂将胡萝卜洗净，浸洗除此表明清洁；洗净后用干净的烧杯盛放，用小刀切成合适大小的4段（每人一段），转入超净台待用。

4、植物材料的表面灭菌和接种

（1）、操作人员洗手消毒，操作前，工作人员的手和小臂用75%的酒精消毒。（2）、装材料的容器及玻棒用酒精表面消毒。

（3）、将待消毒的胡萝卜浸入75%的酒精中10s，取出后转入无菌术冲洗干净。（酒精单独一个杯子装，消毒完毕转下一组使用或回收）

（4）、将无菌水倒出，并倒入消毒剂（10%的次氯酸钠溶液）并计时10min；（同一瓶中操作即可，但注意不要碰到瓶口等关键部位）。

（5）、到预定时间后，倒出消毒液，并用无菌水清洗4遍，保证消毒液全部清洗干净。

（6）、将一套培养皿打开，一皿里面放一张滤纸，另一皿可用作镊子的解剖刀支架。

（7）、拆刀镊，并消毒。将洗净的胡萝卜用灭过菌的镊子夹出，放到干净的滤纸上吸干水分，并在滤纸上操作后续步骤。

（8）、将已表面消毒的材料，从正中间竖直一分为二，然后切去表层，再切成扇形大小的方块，厚度约0.5—1cm左右，不要太薄。注意要留下形成层。（9）、材料切块后接种到诱导培养基上。（注意每瓶放3~5块材料即可，材料不要过于集中；材料不能全部压入培养基）。

（10）、封口膜封好后，做好标记，20摄氏度条件下黑暗条件培养。

五、实验现象

根据实验现象可看出总共12瓶，我们组污染多的有3瓶，有一点污染的有6瓶，完全没有污染的有3瓶，实验现象如下图所示：

完全没有污染的完全没有污染和污染最严重的对比

六、实验结果分析

1、有3瓶发霉的，有一瓶已长出大量霉菌，有两瓶长出了少许霉菌。

长出了大片霉菌的一瓶，可能是在操作过程中，我们对外植体消毒不充分，因为将材料切成了6段，放入消毒时有可能用玻璃棒搅拌时没有使外植体充分得到消毒。

长出少量霉菌的两瓶，可能是培养过程中染菌，我们没有戴口罩，操作过程中时不时说话，可能是污染到了材料；由于橡筋不敢拉的太紧怕断裂，所以也有可能是封口膜没有封紧。

2、有3瓶长的特别好，说明操作过程中没有受到任何污染，消毒充分，封口膜叶封好了。

3、有6瓶长的一般，我们观察之后发现有几瓶是切块切得太小了，没有长出愈伤组织或只长出了一点；还有的是胡萝卜切块被压入培养基里面太深了，只露了一点在外面，以致培养基遭到了破坏愈伤组织也没有长出来。

七、注意事项：

1、工作人员要避免紫外灯的照射，做实验时将紫外灯关闭。

2、移入培养基时，打开封口，封口纸要小心摆正，不能乱丢乱放，最后封口膜一定要绑好。

3、镊子用手拿住上端，不能去拿下端，接种时瓶口应倾斜45°，以免手、镊子上的脏物容易掉到三角瓶里。

4、整个操作过程要尽量在超净工作台的无菌范围内进行。

5、禁止操作时正面大声讲话。

6、无菌操作，材料经消毒液后，即认为是消毒干净，此后的操作中的用具要求无菌。为防止染菌，注意：手要用酒精擦干净；镊子和刀经常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。

7、在植入或移植材料的前后，培养瓶的瓶口需在酒精灯上火烧灭菌。

8、使用的镊子解剖刀等用90%的酒精浸泡，之后放在酒精灯上烧火灭菌，再放在灭菌支架上冷却使用。

9、废液处理。酒精要回收，放原处；Hgcl2有毒，小心不要溅出，废液使用后应按要求放到指定位置。

10、实验材料大小要适中，不宜太大或太小。

11、切胡萝卜时，下面应垫上滤纸。

12、接种时，动作要轻，力度适中。不要把接种的切块压入培养基里面，以致破坏培养基。

13、操作期间应经常用 70%—75% 的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在的酒精中浸泡和在火焰上消毒。

14、调节培养基PH时，理论上应调至5.8为宜，但因培养基经高温高压灭菌时，蔗糖分解，PH值会有所下降，因此调至6.0可减小误差。