Kupffer_细胞_分离_培养
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取出培养板，用 37℃ 的 PBS 液轻轻冲洗 3 次，去 除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。
刚分离出的细胞
KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
培养基配方为 DMEM （ H ） + 双抗 +10% 胎牛血清
（HyClone）。
2天及3天KCs
管）。
• 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一 层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用 PBS离心清洗 2遍，
弃上清(300×g，5min)。
非肝细胞SIP离心准备
SIP离心后细胞层与洗涤
wk.baidu.com 细胞贴壁
• 把细胞按 5x105/ml 浓度种植于培养板中，培养 2h 。
肝脏巨噬细胞(KCs)的分离 与培养
研究生：魏思东 戴卓娅 导师： 龚建平
2010-05-04
肝脏细胞悬液制备
• 门静脉穿刺，以10ml／min流量经门静脉灌注PBS ，直至肝脏呈黄白 色，总量约20ml。再用20ml 0.05％的Ⅳ型胶原酶溶液(sigma ，PBS 液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。 • 取下肝脏加入20ml 0.05％胶原酶，37 oC孵育40 min，经200目细胞 筛过滤。 • PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀 释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g， 5min, 4oC离心，取沉淀。
2周及3周KCs
KCs的鉴定活力判定
• 通过形态学观察及吞噬功能鉴定活力：在体外培养的 24
孔板细胞换液时，加入已消毒碳素墨水的培养基(1/250)，
2 h后倒置显微镜观察，记数200个细胞，观察具有吞噬功
能的细胞数量。0.2%台盼蓝拒染色判断细胞活力。 • F4/80免疫荧光鉴定KCs（小鼠）， CD163免疫组化鉴定 KCs（大鼠）,阳性为KCs。
用镊子划碎肝组织
装入试管消化
肝脏消化吹打后细胞悬液
细胞悬液过滤
洗涤与肝细胞沉淀
梯度离心
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。
• 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o） 试管，轻轻的沿着管加 2mL25 ％的 SIP 细胞悬液（小鼠 2 管，大鼠 4
KCs 吞墨图像与台盼蓝拒 然图片
F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400)
致谢
• 感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋， 陈琦，等同学。 • 感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。
刚分离出的细胞
KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
培养基配方为 DMEM （ H ） + 双抗 +10% 胎牛血清
（HyClone）。
2天及3天KCs
管）。
• 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一 层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用 PBS离心清洗 2遍，
弃上清(300×g，5min)。
非肝细胞SIP离心准备
SIP离心后细胞层与洗涤
wk.baidu.com 细胞贴壁
• 把细胞按 5x105/ml 浓度种植于培养板中，培养 2h 。
肝脏巨噬细胞(KCs)的分离 与培养
研究生：魏思东 戴卓娅 导师： 龚建平
2010-05-04
肝脏细胞悬液制备
• 门静脉穿刺，以10ml／min流量经门静脉灌注PBS ，直至肝脏呈黄白 色，总量约20ml。再用20ml 0.05％的Ⅳ型胶原酶溶液(sigma ，PBS 液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。 • 取下肝脏加入20ml 0.05％胶原酶，37 oC孵育40 min，经200目细胞 筛过滤。 • PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀 释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g， 5min, 4oC离心，取沉淀。
2周及3周KCs
KCs的鉴定活力判定
• 通过形态学观察及吞噬功能鉴定活力：在体外培养的 24
孔板细胞换液时，加入已消毒碳素墨水的培养基(1/250)，
2 h后倒置显微镜观察，记数200个细胞，观察具有吞噬功
能的细胞数量。0.2%台盼蓝拒染色判断细胞活力。 • F4/80免疫荧光鉴定KCs（小鼠）， CD163免疫组化鉴定 KCs（大鼠）,阳性为KCs。
用镊子划碎肝组织
装入试管消化
肝脏消化吹打后细胞悬液
细胞悬液过滤
洗涤与肝细胞沉淀
梯度离心
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。
• 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o） 试管，轻轻的沿着管加 2mL25 ％的 SIP 细胞悬液（小鼠 2 管，大鼠 4
KCs 吞墨图像与台盼蓝拒 然图片
F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400)
致谢
• 感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋， 陈琦，等同学。 • 感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。