Kupffer_细胞_分离_培养

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肝脏基础知识与肝间充质细胞制备

肝靠近腹腔的一面叫肝面，脏面中部有略呈 “H”形的三条沟，中间横行的沟又称肝门，有肝左、右管。肝固有动脉左、右支，肝门静脉左、右支和肝的神经、淋巴管由此进入。左侧的纵沟较窄而深，沟的前部有肝圆韧带通过，称肝圆韧带支，肝圆韧带由胎儿时期的脐静脉闭锁而成,经肝镰状韧带的游离缘内行致脐。后部容纳静脉，称静脉韧带裂。肝面分为4个叶：肝左叶位于肝圆韧带左侧，肝右叶位于胆囊窝与腔静脉右侧，方叶位于肝门前，胆囊窝与肝圆韧带之间，尾状叶位于肝门之后，静脉韧带裂与腔静脉沟之间。
离心淘洗技术是根据反向流动离心原理设计的。在整个离心淘洗过程中 ,淘洗室内悬浮液中的细胞受到两个相反方向的力:离心力(离心转速)和向心力(泵控流速) 并处于平衡状态。当淘洗室内悬浮液往离心转轴方向流动时，随着淘洗室壁逐渐变宽，悬浮液流速逐渐变慢，这样就形成了一个速度梯度；从离心转轴近端至远端，离心力逐渐增大，也形成一个速度梯度，这两者刚好相反。沉降速度跟细胞大小和密度有关，体积、密度较小的细胞由于沉降速度低先被洗脱出来，较大的细胞由于沉降速度高则滞留在淘洗室入口，这里流速和转速都很高；体积、密度中等的细胞则在淘洗室壁最宽处保持平衡。离心力不变时 ,通过增加淘洗液的流速可以使体积、密度大的细胞也被淘洗出来。
2、肝腹面
二、肝的功能肝脏是人体中最大的腺体，也是最大的实质性脏器，约占体重的1/40～1/50。肝的功能极其复杂，参与多种有机物合成以及休内物质的分解代谢，主要功能如下：第一解毒功能。
第二代谢功能
第三分泌胆汁。第四造血、储血和调节循环血量的功能。第五免疫防御功能。第六肝脏再生功能。
3.2肝间充质干细胞制备
取出肝脏
剪碎组织
离心去红

211246889_Kupffer细胞在肝脏NK细胞亚群稳态维持和分化成熟中的作用探究

Kupffer 细胞在肝脏NK 细胞亚群稳态维持和分化成熟中的作用探究①张新宇陈雅雯陈永艳田志刚彭慧（中国科学技术大学免疫学研究所，合肥 230027）中图分类号 Q28 文献标志码 A 文章编号 1000-484X （2023）05-0897-07［摘要］目的：探究Kupffer 细胞对肝脏NK 细胞的调控作用。

方法：利用荧光成像技术分析小鼠Kupffer 细胞和肝脏NK 细胞的位置关系；通过注射氯磷酸盐脂质体构建体内清除Kupffer 细胞模型，流式分选去除肝脏非实质细胞中的Kupffer 细胞进行体外共孵育实验；通过抗生素水饲喂清除小鼠肠道共生菌；利用流式细胞术分析肝脏NK 细胞亚群的比例、数量和成熟状态。

结果：稳态下Kupffer 细胞和肝脏NK 细胞存在共定位，清除Kupffer 细胞后肝脏驻留NK 细胞和经典NK 细胞数量减少；体内清除和体外共培养实验证实Kupffer 细胞可促进肝脏驻留NK 细胞和经典NK 细胞的成熟，而抗生素处理过的小鼠在清除Kupffer 细胞后，肝脏NK 细胞亚群的数量和成熟状态无显著变化。

结论：Kupffer 细胞有利于肝脏NK 细胞的数量维持，且以共生菌依赖的方式促进肝脏NK 细胞的成熟分化。

［关键词］肝脏NK 细胞；Kupffer 细胞；共生菌Roles of Kupffer cells in homeostatic maintenance and differentiation and maturation of liver NK cell subsetsZHANG Xinyu ， CHEN Yawen ， CHEN Yongyan ， TIAN Zhigang ， PENG Hui. Institute of Immunology ， University of Science and Technology of China ， Hefei 230027， China［Abstract ］ Objective ：To explore the regulation of liver NK cells by Kupffer cells. Methods ：Fluorescence imaging technology was used to analyze the positional relationship between mice Kupffer cells and liver NK cells. Kupffer cell depletion in vivo was estab⁃lished by injecting clodronate liposomes. The liver non -parenchymal cells without Kupffer cells used in co -culture experiments in vitro were obtained by using fluorescence -activated cell sorting. Mice were fed with antibiotics in the drinking water to deplete microbiota. Theproportion ， number and maturation of liver NK cell subsets were analyzed by flow cytometry. Results ：There is colocalization between Kupffer cells and liver NK cells at steady state ； depletion of Kupffer cells leads to decreased number of liver -resident NK and conven⁃tional NK cells ； Kupffer cells promote the maturation of liver -resident NK and conventional NK cells ， which was confirmed by deple⁃tion experiments in vivo and co -culture experiments in vitro ； however ， depletion of Kupffer cells in antibiotic -treated mice led to no significant changes in the number and maturation of liver NK cell subsets. Conclusion ：Kupffer cells contribute to the maintenance of liver NK cells and promote the maturation of liver NK cells in a microbiota -dependent manner.［Key words ］ Liver NK cells ；Kupffer cells ；Microbiotadoi ：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.05.001①本文为NSFC 重大研究计划项目（92042305）；国家重点研发计划项目（2022YFC2304502，2020YFA0804100）。

大鼠肝细胞、Kupffer细胞体外共同培养的初步研究

朱强 ¨，韦嘉 ¨，黄富礼，董坚”，刘怀鄂 ”，江元森
（）昆明医学院第一附属医院感染疾病科，云南昆明１
６０３；５０２
２泸州医学院附属医院感染病科，四川泸州６６０；）４００
３昆明医学院第一附属医院生物治疗科，云南昆明６０３；）５０２４）中山大学附属第三医院感染病科，广东广州５０３）１６０
需进一步优化．
［关键词］肝细胞；Ｋｐｅ细胞；共培养ｕｆｒ［中图分类号］Ｒ２．８［３９２文献标识码］Ａ［文章编号］１０４０（０７４— ０５— ５０３— ７６２０）００３０
Ｃｏ — ｃｌｕｒｆＨｅａｏｙｅ，ＫｕｅｌｏＤｔｉｔｏｕｔｅｏｐｔｃｔｓｆｒＣｅｌｆＳＲａｎＶｉｒ
［ｂｔａｔＡｓｃ］ＯｂｅｔｅＴｒｕｈＣ —ｃｌｒＫｐｅｅｓｗｔｅａｏｙｎｖｔ．ｔｕｄｒｔｄｔｅｉ— ｒｊｃｉｈｏｇＯｕｔｅｕｆｒｌｉｈｐｔｔｉｉｏｏｎｅｓｎｎｖｕｃｌｈｃｅｒａｈ
ｌｎｅｏｆｅｃｆｐｆｒｃｌｎｔｅｇｏｔ、ｍｏｐｏｏｙａｄｍｅａｏｉｍｆｈｐｔｃｔ．ＭｅｈｄＩ —ｓｕＩｏｌ．ｕＫｕｆｅｌｏｒｗｈｅｓｈｒｈｌｇｎｔｂｌｓｏｅａｏｙｅｔｏｓｎｉＶｃｌｔａ
两种细胞单独培养、肝细胞与Ｋｐｅ细胞按６１比例共同培养，观察不同情况下肝细胞生存时间和形态，检ｕｆｒ：

Kupffer细胞分离培养

• 取下肝脏加入20ml 0.05％胶原酶，37 oC孵育40 min，经200目细胞筛过滤。
• PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g， 5min, 4oC离心，取沉淀。
非肝细胞SIP离心准备SIP Nhomakorabea心后细胞层与洗涤
细胞贴壁
• 把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。取出培养板，用37℃的PBS液轻轻冲洗3次，去除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。
刚分离出的细胞
KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
KCs 吞墨图像与台盼蓝拒然图片
F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400)
致谢
• 感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋，陈琦，等同学。
• 感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。
用镊子划碎肝组织
装入试管消化
肝脏消化吹打后细胞悬液
细胞悬液过滤
洗涤与肝细胞沉淀
梯度离心
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。 • 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o）
试管，轻轻的沿着管加2mL25％的SIP细胞悬液（小鼠2管，大鼠4 管）。 • 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用PBS离心清洗2遍，弃上清(300×g，5min)。
培养基配方为DMEM（H）+双抗+10%胎牛血清（HyClone）。

小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨

化、连续密度梯度离心、择性贴壁三步法分离Ｋ并比较链霉蛋白酶、不选Ｃ， Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和 Ⅳ 型胶原酶等３不同酶消化分离方法所得ＫＣ得率及纯度。结果３种不同酶消化分离方法细胞得率分别为（．２种６３
龄，洁级，四Ｊ大学华西医学中心试验动物中清由Ｉｌ心提供（可证号：４）许０６。试验前禁食１，２ｈ自由饮
水，随机分为３组。
配制，．２ｍ滤器过滤除菌，０２临用前加入ｌ新Ｏ，９６鲜灭活的小牛血清，霉素１０Ｕ／青０ｍＬ，霉素１０链０
２ｍＬ；
１１４ＳＳ液的配制１０／ｅｃｌ液和８５．．Ｐ０Ｐｒｏｌ９６．％
ＮＳ以９：１的比例混合，制成ＳＳ原液；７配Ｐ以０Ｐｒｏｌ２ｍＬ配制：Ｐ．ｅｃｌ液ＳＳ１４ｍＬ和ＰＳ０６ｍＬＢ．
２ｍＬ。酶消化液：００Ｉ型胶原酶２ｍＬ方法含．５Ｖ；
免疫调节作用，时影响肝细胞、脂细胞及内皮同贮细胞的生物学功能［。近期发现ＫＣ能诱导同种异１］
体Ｔ淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥
士０５ × １ｇ。（．６０４ ×１－，１．士０７ ×１＿；胞纯度分别为（３２１７％，９．士１５，．）０－．３６ ± ．）０ｇ。（０３．）０ｇ。细９．士．）（０７．）

大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响(医药类)

大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响（医药类）目的观察大鼠肝实质细胞和枯否细胞共培养对其体外生长、形态和功能的影响方法采用原位两步ⅳ型胶原灌注法和高密度离心法分离大鼠肝实质细胞和枯否细胞。

在体外，肝实质细胞和枯否细胞以6∶1的比例共培养。

观察不同条件下肝细胞的存活时间和形态。

培养36 h 后，每隔24 h检测上清液中白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平，用放射免疫法检测上清液中白细胞介素1 (IL 1)、白细胞介素6 (IL 6)和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)的含量。

结果分离培养组肝细胞生长增殖迅速，并向正常肝细胞进化。

肝细胞可以培养并存活15天。

共培养组肝细胞生长和增殖缓慢，可存活10天。

24、36、48和60 h时，共培养组上清液白蛋白水平低于单培养组(t = 2.551 ~ 3.139，P0.05)；24小时、36小时、48小时和60小时血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平高于单独培养组(T = 2.446 ~ 3.108，P0.05)；共培养组的枯否细胞维持il1、il6和tnfα的分泌功能，而单培养组则未检测到il1、il6和tnfα。

结论大鼠枯否细胞和肝实质细胞可以在合适的培养条件下共培养。

这两种细胞能保持良好的分泌功能，可用于实验研究。

[关键词]肝细胞；枯否细胞；共培养技术；白蛋白；细胞因子。

大鼠[摘要]目的观察生长情况。

和肝细胞功能的影响。

方法采用原位ⅳ型胶原酶两步灌注法和超临界流体低速离心法分别分离大鼠肝实质细胞(PHC)和枯否细胞。

PHC细胞和库普弗细胞按6∶1的比例进行体外共培养。

观察细胞在不同条件下的存活时间和形态。

培养上清中丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶在24小时检测一次，36小时用放射免疫法测定白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的浓度。

结果单独培养组肝细胞生长迅速，发育成正常肝细胞，可存活15天；对于共培养组，细胞生长和生成缓慢，存活10天。

大鼠Kupffer细胞分离、培养及永生化实现

大鼠Kupffer细胞分离、培养及永生化实现毛德文;裴燕燕;王明刚【摘要】枯否细胞(Kupffer Cells,KC)是肝脏免疫防御的第一道防线,其与多种肝脏疾病密切关联.Kupffer细胞分离纯化技术要求较高,且该细胞分化增殖能力极弱,成为开展大规模细胞实验的主要障碍.课题组简化了Kupffer细胞分离纯化步骤,构PDS152_pLenti-GFP-IRES-SV40LT表达载体,包装形成慢病毒颗粒侵染Kupffer 细胞,侵染后细胞生长速度变快,能多次传代,细胞状态稳定,巨噬细胞特异性标志F4/80呈阳性表达.将SV40LT片段导入Kupffer细胞可实现细胞永生化,且转染后的kupffer细胞仍维持巨噬细胞的功能特性.【期刊名称】《大众科技》【年(卷),期】2017(019)012【总页数】3页(P35-37)【关键词】Kupffer细胞;SV40-LT片段;永生化;特性【作者】毛德文;裴燕燕;王明刚【作者单位】广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023【正文语种】中文【中图分类】Q2;R57枯否细胞（Kupffer cells，KC）是定植在肝脏的巨噬细胞，是肝脏非实质细胞的重要组成部分。

Kupffer细胞在肝脏固有免疫系统中发挥关键作者，是肝脏免疫防御的第一道防线。

Kupffer细胞与慢性肝炎、肝硬化及肝癌等多种肝脏疾病密切关联。

有效、快速分离Kupffer细胞，针对性开展功能与机制研究是探明不同致病因素对 Kupffer细胞影响及其与疾病相关性的基石。

但Kupffer细胞分离纯化技术要求较高，且关键在于Kupffer细胞分化增殖能力极弱，成为开展大规模细胞实验的主要障碍，课题组在实验中分离纯化了Kupffer细胞，且构建了一种永生化的细胞模型。

kupffer cell 标签

Kupffer细胞标签一、Kupffer细胞简介Kupffer细胞是肝脏内最大的巨噬细胞裙，起着维护肝脏内稳态、清除血液中有害微生物和代谢产物等重要作用。

Kupffer细胞表面上的标签物质能够帮助识别这些细胞，进而对其功能进行研究，这些标签通常包括对细胞表面特异抗体的染色等。

二、Kupffer细胞标签的种类1. CD68标签：CD68是一种已知的巨噬细胞特异性标记物，在研究Kupffer细胞时常用于标识细胞的存在和数量。

2. F4/80标签：F4/80是巨噬细胞的一种细胞表面抗原，也是Kupffer 细胞的特异性标记物质之一。

3. CD163标签：CD163是单核-巨噬细胞的特异性表面标记，在进行Kupffer细胞相关研究时也常作为标签使用。

三、Kupffer细胞标签在研究中的应用Kupffer细胞标签的运用能够帮助科研人员迅速、准确地定位和识别Kupffer细胞，从而更好地开展相关研究工作。

利用CD68标签可以帮助研究者检测和定量Kupffer细胞的数量变化，进而观察其在肝脏疾病中的变化规律；而借助F4/80标签则可以更好地观察Kupffer细胞在肝脏免疫反应中的作用。

四、Kupffer细胞标签在临床中的意义Kupffer细胞在肝脏疾病的发生和发展中扮演着重要角色，因此对其进行研究不仅有助于从分子水平揭示疾病发生的机制，还可为相关疾病的临床治疗提供依据。

Kupffer细胞标签的运用所得到的研究结果可以为实验室与临床间的桥梁，为肝脏病变的诊断与治疗提供新思路和方法。

五、结语Kupffer细胞标签的使用在相关研究和临床中具有重要意义，它为科研人员提供了更多的研究方法和手段，有助于更好地了解Kupffer细胞的生物学特性、功能以及在疾病发生发展中的作用，其应用前景广阔，也为相关临床治疗提供了新的研究思路。

希望未来能够有更多的相关研究者投入到这一领域的工作中，为Kupffer细胞及其相关疾病的研究和临床治疗做出更大的贡献。

kupffer细胞培养注意事项

kupffer细胞培养注意事项1. 注重无菌操作：在进行kupffer细胞的培养过程中，保持实验环境的无菌状态是非常重要的。

使用无菌操作技术，如穿戴无菌手套、操作在无菌工作台下进行，以避免细菌和真菌的污染。

2. 选择合适的培养基和补充物：选择适合kupffer细胞生长的培养基，并根据实验需求添加适当的补充物，如生长因子、血清等。

培养基和补充物的选择将直接影响到细胞的生长和功能。

3. 细胞的处理和传代：处理kupffer细胞时，要避免对细胞造成过度机械和化学刺激，以免影响细胞的功能。

同时，在进行传代时，注意细胞的浓度和细胞悬液的稀释比例，以确保细胞的正常生长和传代效果。

4. 适当的温度和湿度：细胞培养的温度和湿度对细胞的生长和代谢具有重要影响。

维持适当的培养温度（一般为37°C）和湿度（通过培养皿内添加适量的水）有助于提高细胞的生存率和生长速度。

5. 注意培养皿的处理：培养皿的表面应保持洁净，避免污染细胞培养。

在进行细胞移植或处理时，避免过度摇动或振动培养皿，以减少细胞的机械损伤和静电影响。

6. 定期检测细胞污染：在培养过程中定期检测细胞的纯度和污染情况，避免细菌、真菌或其他污染物的存在。

使用合适的方法如细胞培养物中添加抗生素等，以确保细胞培养的质量和纯度。

7. 注意培养液的更换和配制：定期更换培养液，并遵循合适的配制方法和储存条件。

避免使用过期的培养液和补充物，以免影响细胞培养。

8. 增加培养时间的控制：根据实验需要，控制kupffer细胞的培养时间。

过长的培养时间可能会引起细胞的老化或功能的改变，因此及时收取和处理细胞培养物是重要的。

9. 严格遵守实验守则：在进行任何实验操作之前，首先熟悉并遵守实验守则和操作规程。

不得盲目进行实验操作，保证自己和他人的安全。

注意：本回答仅供参考，具体操作应根据实验室和研究要求进行，并按照相应实验守则和机构的规定进行操作。

库普弗细胞的研究进展

第４ｌ卷第２期２０１０年４月解剖学报ＡＣＴＡＡＮＡＴＯＭＩＣＡＳＩＮＩＣＡＶ０１．４１，Ｎｏ．２Ａｐｒ．２０１０‘３３１。

库普弗细胞的研究进展张强伟１’２徐存拴１’２。

（１．河南师范大学生命科学学院；２．河南省－科技部共建细胞分化调控国家重点实验室培育基地，河南新乡４５３００７）［摘要］库普弗细胞（ＫＣｓ）是肝脏的非实质细胞。

具有分泌细胞因子及吞噬、免疫等功能，亦与多种肝脏疾病，如肝损伤、肝纤维化、肝硬化等密切相关。

本文简要总结了近几年有关库普弗细胞的生理功能及与肝病关系等方面的研究进展。

［关键词】库普弗细胞；细胞因子［中图分类号】Ｑ２８［文献标志码］Ａ［ＤＯＩ］１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９—１３５６．２０１０．０２．０３５ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎＫｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓＺＨＡＮＧＱｉａｎｇ．ｗｅｉ。

・２．ＸＵＣｕｒｔ．ｓｈｕａｎｌｆ２。

（Ｊ．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｅ如ｔｗｅ，胁’ｉｌａｒｔＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；２．研ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ，肌’ｌｌａｌｌＸｉｎｘｉａｎｇ４５３００７，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｉｓａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｌｉｖｅｒｎｏｎｐａｒｅｎｅｈｙｍａｌｃｅｌｌｓ，ｉｔｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓｉｎａｖａｒｉｅｔｙｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｔｈｒｏｕｇｈｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ａｎｔｉｇｅｎ—ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ，ａｎｄｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏａｖａｒｉｅｔｙｏｆｄｉｓｅａｓｅｓｓｕｃｈａｓｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ，ｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｗｉｔｈｌｉｖｅｒ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＬｉｖｅｒＫｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌ；Ｃｙｔｏｋｉｎｅ自１８７６年发现库普弗细胞（ｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓ，ＫＣｓ）以来，至今已有１３０多年。

小鼠原代kupffer细胞分离

1、小鼠肝脏Kupffer 细胞分离、纯化参照Tetsuya Abe等的方法并加以改进。

腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg/kg），沿腹部正中做一约2cm 的切口，完全暴露门静脉，经门静脉置入18G 套管针，置入位置约距离肝门1cm，插入约0.8cm，4-0 丝线固定后，立即剪开下腔静脉，用无钙灌注液进行灌注，灌注速度约为10ml/min,同时剪开上腔静脉，灌注过程见图 1.1、图1.2。

灌注5min，共灌注无钙灌注液50ml/只，灌注后肝脏体积膨大、颜色变浅，解剖剪分离取下肝脏，去除结缔组织及胆囊，在75%的酒精里漂洗5s，然后用PBS 漂洗三次，以防污染。

放到盛有PBS 的50ml 无菌瓶中，每批细胞需要灌注3-5 只小鼠。

待所有小鼠肝脏灌注好之后，一起放到细胞培养皿中，用眼科剪剪碎，加入0.1% 四型胶原酶，每只约需5ml，放至37℃CO2培养箱，消化一小时，摇匀一次/15 min，并用移液枪轻轻吹打1min。

待组织块消化完全，细胞基本散落形成细胞悬液后，过350 目滤网2 次，以去除未消化的组织块和结缔组织。

用15ml 离心管收集细胞悬液，300 rpm×3 min，离心两次，收集上清，可以去除大部分的小鼠肝脏细胞。

然后，1500 rpm×5 min，弃上清，收集沉淀，用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 培养基悬浮细胞沉淀。

Percoll不连续密度梯度离心，2000g×20min，4℃；各层为上：细胞悬液2ml，中：25%Percoll 3ml，下：50%Percoll 3ml（用15ml 离心管，2-3 管/只）。

先将50%的Percoll液3ml 置于离心管底部，再沿着离心管管壁缓慢加入25%Percoll3ml在50%Percoll 液上面，最后沿着管壁缓慢加入细胞悬液2ml 于最上层，见图1.3 。

离心后可见四层区带：最上一层为细胞碎片；第二层为富含肝窦内皮细胞的区带；第三层为富含Kupffer 细胞的区带；第四层为积于管底的沉淀，主要是红细胞，见图1.4 。

一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法

一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法小鼠滑膜细胞的分离及培养方法是研究小鼠滑膜细胞功能和生物学特性的重要步骤。

在本方法中，我们将展示一种经典的小鼠滑膜细胞分离和培养方法，旨在为研究者提供操作指南。

首先，我们需要准备所需材料和试剂，包括小鼠、PBS（磷酸盐缓冲液）、酶消化液（例如，胰酶和胰蛋白酶）、培养基（例如，DMEM/F12）和培养皿。

1. 小鼠的选择和准备:选择适龄、健康的小鼠，注意其性别和品系。

提前准备好所需的操作平台和相关仪器。

2. 小鼠滑膜细胞的分离:将小鼠以适当的方式进行麻醉和消毒。

在细菌培养箱中，通过剖腹取出小鼠的关节滑膜组织，尽量保持其完整性，并将其置于含有PBS的培养皿中。

3. 组织消化:将滑膜组织切碎并置于含有胰酶和胰蛋白酶的酶消化液中，在37°C的恒温振荡器中进行消化。

消化时间和酶的浓度应根据滑膜样本的大小和类型进行调整，通常需要2-4小时的消化时间。

4. 细胞分离:经过消化的滑膜组织将被过滤，以除去组织残渣和大颗粒物。

将过滤液收集到离心管中，进行离心，去除上清液。

沉淀的细胞可以通过重新悬浮和离心的方法进行重复洗涤，以进一步净化细胞。

5. 细胞培养:将净化后的小鼠滑膜细胞重新悬浮于预先准备好的培养基（例如DMEM/F12），添加适量的血清和生长因子。

将细胞转移至培养皿中，并放置在37°C的恒温培养箱中进行培养。

通过定期观察和更换培养基，维持适当的温度和湿度，小鼠滑膜细胞将逐渐形成单层，并开始增殖和扩增。

总结起来，这种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法提供了一种简单有效的操作指南，可用于研究小鼠滑膜细胞的功能和特性。

它为进一步探究滑膜相关疾病的发生机制以及治疗方法的开发提供了基础。

维化发生发展及逆转过程中+kupffer+细胞表型的研究

资助项目：国家自然基金重点项目（81123001）北京市重点实验室阶梯计划项目（Z111102055311076）
目录英文缩写词对照表 .................................................................................................................... 1 中文摘要 .................................................................................................................................... 2 英文摘要 .................................................................................................................................... 4 绪论 ............................................................................................................................................ 7 第一章 CCl4 诱导小鼠肝纤维化模型建立与评估 ................................................................ 13
分类号 UDC
密
级
公开
保密期限
硕士学位论文
题
目
肝纤维化发生发展及逆转过程中 kupffer 细胞表型的研究陈芳艳贺福初院士；姜颖研究员军事医学科学院放射与辐射医学研究所生物化学与分子生物学 2013 年 6 月 13 日中国人民解放军军事医学科学院徐宁志

大鼠肝细胞与kupffer细胞的分离与鉴定

大鼠肝细胞与kupffer 细胞的分离与鉴定李婉雁1，2，相雪莲1，2，曹楠1，2，陈文斌1，2，潘建秋1，2，江丹莉1，2，田允波1，2，黄运茂1，2，许丹宁1，2*（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东广州510225）摘要：本研究旨在建立一种简单有效的分离大鼠肝细胞和kupffer 细胞的方法。

大鼠体外肝脏灌流，采用percoll 密度梯度分离法分离肝细胞与kupffer 细胞，糖原染色鉴定肝细胞，墨汁吞噬实验鉴定kupffer 细胞。

结果表明，此方法分离的肝细胞和kupffer 细胞活性都在95%以上，新分离的肝细胞鹅卵石样，贴壁能力不是特别强，24h 可分化出不同形态。

Kupffer 细胞具有较强的吞噬能力和贴壁能力，可看到墨汁被细胞吞噬。

结论：本实验建立的分离培养方法较稳定，为开展肝细胞和kuffer 细胞的相关研究提供方法依据，也为建立各种体外细胞分离培养方法提供借鉴。

关键词：大鼠；肝细胞；kupffer 细胞；分离；鉴定中图分类号：Q343.6文献标识码：B文章编码：1005⁃8567（2021）02⁃0046⁃04收稿日期：2021⁃03⁃16基金项目：广东省基础与应用基础研究基金项目区域联合基金⁃青年基金项目（2019A1515110106）作者简介：李婉雁（1988⁃），女，广东广州人，讲师，博士。

*通讯作者：许丹宁，E⁃mail ：*****************肝脏是机体最大的代谢器官，在机体的生命活动中扮演着相当重要角色，很多疾病的防治和肝脏的代谢息息相关［1］。

作为体外培养的一种原代细胞，肝细胞具有很强的活性和高代谢能力，在研究肝脏的代谢机制以及药物对肝脏的作用机制方面具有十分重要的作用，为研究药物代谢、开发新药物的研究提供了一个有效平台。

因此，建立有效稳定的分离和培养原代肝细胞方法，将为开展肝脏功能相关研究提供有力的方法支持［2，3］。

肝脏组织样品分离细胞的方法

肝脏组织样品分离细胞的方法1.肝细胞的分离和培养分离方法：1. 肝组织展液的制备将肝组织放在前灌流液(含EDTA0.019％，pH 7．4，一定浓度的抗菌素)中带回实验室，剪去外露明显的血管和胆管组织。

前灌流液(预先在37℃水浴箱中浴热)用BRAUNULE穿刺针从管腔残端灌入，约3—5次，每次20 m1，尽量冲净肝组织中残存的血细胞，见肝组织呈谈红色或淡黄色，后用0．05％的胶原酶IV型水溶液15m1—20 m1，缓慢灌入3—4次，每次约5min—8min，胶原酶IV型可以重复使用，每次使用前均应在37℃水浴箱中浴热以保持酶活力。

待肝组织韧性消失，压迫不易恢复，肝包膜下有时呈粒状时，放入平皿中、用眼科镊剪去除被膜及肝组织内肉眼可见的管道系统，然后连同灌注流出的胶原配溶液放入锥形瓶中，在37℃水浴箱中振荡消化10min。

用培养液终止反应制成混合肝细胞悬液。

2. 分离培养肝细胞取混合肝细胞悬液用200目尼龙布过滤，50×g离心3min。

留下上清液作分离肝窦状间隙的内皮细胞用。

用1640培养液反复离心3次，每次50×g离心3min，以清洗残存的胶原酶和纯化肝细胞，在显微镜下观察肝细胞形态及纯化状态；用0.4％锥兰染色判断细胞活率，血细胞计数板计数细胞浓度。

以1640合成培养基(含10％AB型人血清)细胞混悬液稀释至2×l0E5／m1后分别接种在培养瓶和六孔培养板上。

在37℃、5％CO2条件下先培养l 8h—20 h，换液去除残存血细胞，再用同样培养基培养7d一10d。

2.间质细胞的分离和培养a.肝寨间隙内皮细胞分离、培养：取分离肝细胞后的上清液，用50×g离心3min和500×g离心5min交替离心3—5次，去除残存的肝细胞，同时用1640培养液清洗残存的胶原酶。

分出的细胞主要为肝内皮细胞和枯否氏细施的混合悬液。

用0.4％锥兰染色判断细胞活率后，接种在培养瓶中。

小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养的一种新方法

第30卷第1期2010年1月国际病理科学与临床杂志 htt p://www .gjbl .netI nternati onal Journal of Pathol ogy and ClinicalMedicineVol .30　No .1Jan .　2010收稿日期:2009-10-09 修回日期:2010-01-23作者简介:赵秀华,硕士研究生,主要从事成体干细胞的研究。

通讯作者:程腊梅,E 2mail:chenglamei2000@yahoo .com基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2007CB947900);湖南省自然科学基金重点项目(08JJ3075)。

The work was supported byNati onal Key Basic Research and Devel opment Pr ojects (2007CB947900)and Key Pr ojects of Natural Science Foundati on of Hunan Pr ovince,P .R.China (08JJ3075).・Arti cles ・・论　著・小鼠肝脏窦状内皮细胞分离和培养的一种新方法赵秀华,罗彬,罗盘,程腊梅(中南大学生殖与干细胞工程研究所,长沙410078)[摘要]　目的:建立小鼠肝窦状内皮细胞(liver sinus oidal endothelial cells,LSEC )的分离培养方法,研究其生物学特性。

方法:中性蛋白酶消化小鼠肝脏组织,Percoll 密度梯度离心分离消化后的细胞悬液,用内皮细胞筛选培养基及酶差异消化法纯化LSEC;免疫细胞化学染色检测LSEC 的表面标志,分析LSEC 的超微结构,观察D iI 荧光标记的乙酰低密度脂蛋白(acetylated 2l ow density li pop r otein,D iI 2Ac 2LDL )摄取能力,以体外成血管能力分析LSEC 的功能。

小鼠肝Kupffer细胞使用说明

小鼠肝Kupffer细胞小鼠肝Kupffer细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

派瑞金提供的小鼠肝Kupffer细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。

研发的小鼠肝Kupffer细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。

同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。

注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。

3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。

4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。

5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。

小鼠肝Kupffer细胞产品简介：产品名称：小鼠肝 Kupffer 细胞（Mouse Hepatic Kupffer Cells）组织来源：小鼠肝组织产品规格：5×105cells/25cm2 培养瓶小鼠肝Kupffer细胞细胞简介：小鼠肝 Kupffer 细胞分离自小鼠肝脏组织，细胞呈圆形或多角形。

Kupffer 细胞是位于肝窦内表面的吞噬细胞，能够清除血液中的外来抗原、抗原－抗体复合物和细胞碎片等物质。

Kupffer 细胞是全身单核-吞噬细胞系统的重要组成部分，也是肝脏防御系统主要成员，在全身和肝脏疾病发生发展中起到重要作用。

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用镊子划碎肝组织
装入试管消化
肝脏消化吹打后细胞悬液
细胞悬液过滤
洗涤与肝细胞沉淀
梯度离心ห้องสมุดไป่ตู้
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。
• 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o）试管，轻轻的沿着管加 2mL25 ％的 SIP 细胞悬液（小鼠 2 管，大鼠 4
管）。
• 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用 PBS离心清洗 2遍，
弃上清(300×g，5min)。
非肝细胞SIP离心准备
SIP离心后细胞层与洗涤
细胞贴壁
• 把细胞按 5x105/ml 浓度种植于培养板中，培养 2h 。
KCs 吞墨图像与台盼蓝拒然图片
F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400)
致谢
• 感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋，陈琦，等同学。 • 感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。
肝脏巨噬细胞(KCs)的分离与培养
研究生：魏思东戴卓娅导师：龚建平
2010-05-04
肝脏细胞悬液制备
• 门静脉穿刺，以10ml／min流量经门静脉灌注PBS ，直至肝脏呈黄白色，总量约20ml。再用20ml 0.05％的Ⅳ型胶原酶溶液(sigma ，PBS 液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。 • 取下肝脏加入20ml 0.05％胶原酶，37 oC孵育40 min，经200目细胞筛过滤。 • PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g， 5min, 4oC离心，取沉淀。
2周及3周KCs
KCs的鉴定活力判定
• 通过形态学观察及吞噬功能鉴定活力：在体外培养的 24
孔板细胞换液时，加入已消毒碳素墨水的培养基(1/250)，
2 h后倒置显微镜观察，记数200个细胞，观察具有吞噬功
能的细胞数量。0.2%台盼蓝拒染色判断细胞活力。 • F4/80免疫荧光鉴定KCs（小鼠）， CD163免疫组化鉴定 KCs（大鼠）,阳性为KCs。
取出培养板，用 37℃ 的 PBS 液轻轻冲洗 3 次，去除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。
刚分离出的细胞
KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
培养基配方为 DMEM （ H ） + 双抗 +10% 胎牛血清
（HyClone）。
2天及3天KCs