亲和层析法
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。
它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。
亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。
在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。
例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。
利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。
亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。
亲和层析方法具有许多优点。
首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。
其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。
此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规模的样品分析。
亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。
在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。
在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。
在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。
亲和层析是一种基于亲和性相互作用的分析方法，通过选择性地富集和分离目标物质，实现了样品的准确分析。
亲和层析方法具有许多优点，并在各个领域中得到了广泛应用。
未来随着技术的不断发展，亲和层析方法将进一步完善和应用于更多的领域，为科学研究和工业生产提供更多的可能性。
亲和层析法
第三节 提高吸附剂的操作容量
亲和吸附剂的操作容量的影响因素： 配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小、 基质的多孔性 操作条件 等因素
一、在配体和基质之间引入“手臂”
1．原理
在配体和基质之间，特 别是在小分子的配体 和基质之间，引入适 当长度的“手 臂 ” ( arm)， 使 配 体 离开基质的骨架，
• 将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物 反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基 团的化合物反应，
• 即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂，
二、增加配体取代的程度
对一些解离常数较大的配体而言，增加配体在基质上 的浓度也是增加吸附剂结合量的有效手段。
增加配体数的方法是： 在配体量一定时，随着基质活性基团的增加(通过活化 时pH值的提高和溴化氰量的增加)偶联配体的量也相
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。
• ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质(如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。
• ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。
A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。
• 2)间接测定法
①推算法
一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出 来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ②根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分子 物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质， 然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子 物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
生物分子相互作用的实验方法与分析技术
生物分子相互作用的实验方法与分析技术生物分子相互作用是指生物体内分子之间的相互作用，包括蛋白质与DNA、RNA、低分子化合物等的相互作用。
了解生物分子相互作用的方法可以帮助我们更好地理解生命过程，从而为疾病治疗、药物研发等提供有益的指导。
下面将介绍几种常用的生物分子相互作用实验方法与分析技术。
1. 亲和层析法（affinity chromatography）亲和层析法是一种利用特定配体与目标分子的亲和作用进行分离和纯化的方法。
一般分为亲和柱层析和免疫沉淀两种。
亲和柱层析是将特定配体固定在柱子上，利用配体与目标分子的亲和作用将其吸附在柱子上，在洗脱过程中分离目标分子。
免疫沉淀则是利用特异性抗体与目标分子结合，再将抗体-目标分子复合物通过一系列的洗涤步骤分离。
2. 免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation）免疫共沉淀法利用抗体特异性地结合目标分子，然后以抗体为桥梁将与目标分子结合的其他分子一同沉淀下来。
通过分析沉淀物中的分子成分，可以确定目标分子与其他蛋白质的相互作用关系。
该方法通常与免疫检测技术（如免疫印迹）相结合使用，可以用来研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA/RNA等之间的相互作用。
3. 蛋白质结晶与X射线晶体衍射（protein crystallization andX-ray crystallography）蛋白质结晶与X射线晶体衍射是研究蛋白质三维结构的常用方法。
首先通过体外重组表达得到目标蛋白质，并将其进行纯化和结晶处理。
然后在适当的缓冲溶液中形成结晶，最后通过X射线衍射测定结晶体的晶体学参数，通过计算和解析来得到蛋白质的三维结构。
蛋白质结晶和X射线晶体衍射为药物研发提供了重要的结构信息，例如为针对特定蛋白质的药物设计提供靶标。
4. 双杂交法（yeast two-hybrid）双杂交法是研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验方法。
该方法利用酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的生殖特点，将转录因子中的DNA结合域（DNA binding domain，DBD）和激活域（activation domain，AD）分别与两个蛋白质结合。
亲和层析法 ph
亲和层析法 ph
亲和层析法（Phaffinity Chromatography）是一种分离和纯化蛋白质的方法，利用特定配体与目标蛋白之间的亲和性进行选择性吸附和洗脱。
在亲和层析法中，一种特定的配体或亲和剂（affinity ligand）被固定在亲和树脂上，例如蛋白A、蛋白G或金属离子等。
这些配体具有与目标蛋白质特异性结合的能力。
亲和层析法的操作步骤如下：
1.样品加载：将含有目标蛋白的混合物（样品）加载到装有
亲和树脂的柱上。
2.亲和吸附：目标蛋白与固定在亲和树脂上的配体发生特异
性结合，其他非目标蛋白被洗脱。
3.洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH、离子浓度、
温度等，使目标蛋白与亲和树脂上的配体解离，从而将目
标蛋白洗脱。
4.纯化和收集：收集洗脱液中的目标蛋白，经过后续处理获
得纯化的蛋白质。
亲和层析法能够高效、选择性地富集目标蛋白质，并且可以在非变性条件下进行操作，从而保持蛋白的活性和折叠状态。
这使得亲和层析法在生物医药研究和生产中得到广泛应用，如蛋白质纯化、抗体制备、酶分析等。
药物分析中的亲和层析法应用研究
药物分析中的亲和层析法应用研究亲和层析法（affinity chromatography）是一种基于亲和性的分离和纯化方法，广泛应用于药物分析领域。
本文将探讨亲和层析法在药物分析中的应用，并介绍其原理、操作步骤和优势。
一、亲和层析法概述亲和层析法是利用配体与目标分子之间的特异性相互作用进行分离和纯化的技术。
在药物分析中，亲和层析法通常用于研究药物与其靶标蛋白之间的相互作用、药物结合位点的鉴定和药物的筛选。
二、亲和层析法的原理1. 亲和剂的选择在亲和层析中，选择合适的亲和剂是至关重要的。
亲和剂通常是目标分子的衍生物或具有特异性结合能力的化合物，如抗体、金属离子等。
通过调节亲和剂与目标分子之间的结合条件，实现目标分子的选择性结合和纯化。
2. 亲和层析纯化步骤亲和层析法的纯化步骤一般包括样品处理、进样、洗脱和再生等过程。
首先，将样品与亲和层析柱填料之间的非特异性结合物洗脱，然后再用合适的洗脱缓冲液洗脱目标分子。
3. 分离效果评价亲和层析分离的效果主要通过检测目标分子在洗脱峰的峰面积或峰高来评价。
分离的效果好坏不仅取决于亲和剂的选择，还与样品的纯度、目标分子的亲和性以及平衡时间等因素有关。
三、亲和层析法在药物分析中的应用1. 药物与蛋白的相互作用研究亲和层析法可用于研究药物与蛋白质之间的结合特性以及药物-蛋白复合物的稳定性和解离动力学等。
通过该方法，可以揭示药物与蛋白之间的相互作用机制，为药物的设计和改进提供重要的依据。
2. 药物结合位点的鉴定亲和层析法可以用于鉴定药物在蛋白质分子中的结合位点。
通过与不同的亲和柱进行层析，可以确定药物与蛋白分子的结合位点，进而揭示药物与蛋白质之间的结构和功能关系。
3. 药物筛选与优化亲和层析法可用于筛选具有高亲和力和高选择性的药物。
通过将潜在药物与亲和剂结合，并利用洗脱步骤将药物从亲和剂中洗脱，可以筛选出具有良好亲和性的药物并进行后续的优化。
四、亲和层析法的优势1. 高选择性：亲和层析法可通过调节亲和剂和目标分子之间的结合条件，实现高度选择性的纯化和分离。
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法（Affinity chromatography）是一种利用生物分子的特异性相互作用进行分离和纯化的技术方法。
它基于目标分子与固定相上的亲和配体之间的特异性结合，通过这种结合来实现分离和富集目标分子。
亲和层析色谱法的原理是在固定相上引入亲和配体，这些配体可以选择性地与目标分子结合。
固定相通常是一种多孔的或者具有大表面积的材料，如琼脂糖凝胶、硅胶、聚合物等。
亲和配体可以是抗体、酶、亲和标记物等，它们能够与目标分子发生特异性的结合。
在进行亲和层析色谱时，目标分子溶液会通过固定相，处于非特异性结合的状态下，不与固定相上的亲和配体结合。
然后，通过洗涤步骤去除非特异性结合物。
最后，通过改变溶液条件（如pH、温度等），使得目标分子与亲和配体之间的结合解离。
这样，目标分子就可以从固定相上洗脱出来。
这种方法能够实现对目标分子的高效纯化和富集。
亲和层析色谱法广泛应用于生物化学、生物技术和制药工业中，用于分离和纯化蛋白质、抗体、核酸等生物分子。
它具有选择性高、纯化效果好、操作简
便等特点，已成为分离和纯化生物分子的重要方法之一。
亲和层析法纯化荧光蛋白
亲和层析法纯化荧光蛋白简介荧光蛋白是一种广泛应用于生物学研究中的重要工具。
为了获得高纯度的荧光蛋白样品，可以使用亲和层析法进行纯化。
亲和层析法是一种利用目标蛋白与特定配体的高亲和力进行选择性结合的技术。
本文将介绍亲和层析法在纯化荧光蛋白中的应用，并提供一种常用的亲和层析流程供参考。
原理亲和层析法的原理基于配体-目标蛋白的相互作用。
一般来说，配体可以是某种金属离子、抗体、其他蛋白或化学修饰的小分子。
荧光蛋白的亲和层析通常使用针对荧光蛋白的抗体作为配体。
亲和层析法的步骤一般包括以下几个方面：1.准备亲和柱：将配体固定在柱子上，例如使用亲和树脂等。
2.样品处理：将含有荧光蛋白的样品经过前处理，如细胞裂解、离心、蛋白质沉淀等。
3.样品加载：将处理后的样品加载到亲和柱顶部。
4.洗脱杂质：通过调整洗脱缓冲液的条件，将非目标蛋白质洗脱。
5.荧光蛋白洗脱：通过调整洗脱缓冲液的条件，将目标荧光蛋白洗脱。
实验步骤1. 准备亲和树脂根据所用的亲和树脂种类，按照供应商提供的方法进行亲和树脂的准备。
一般情况下，亲和树脂的包装上都会有详细的说明。
在准备过程中，需要注意维持亲和树脂的稳定，避免干燥和污染。
2. 样品处理样品处理的步骤可以根据使用的样品来源的不同，进行不同的优化。
一般情况下，可以通过细胞裂解并离心，获得含有目标荧光蛋白的上清液。
如果需要增加目标荧光蛋白的表达量，可以选择合适的转染方法。
3. 样品加载将处理好的样品缓冲液均匀地加载到亲和柱顶部，避免样品直接滴注到亲和树脂上。
可以通过缓慢滴注的方式进行样品加载，这样可以避免样品在亲和树脂上积聚造成阻塞。
4. 洗脱杂质使用洗脱缓冲液进行洗脱步骤，以去除非目标蛋白质。
洗脱缓冲液的选择应该根据配体和目标荧光蛋白的亲和力进行优化。
一般情况下，可以使用逐步加深浓度的洗脱缓冲液进行洗脱。
5. 荧光蛋白洗脱通过调整洗脱缓冲液的条件，使得目标荧光蛋白与配体解离并从亲和树脂上洗脱下来。
亲和层析法原理
亲和层析法原理
亲和层析法的原理是基于生物分子之间的特异性亲和力进行分离的。
亲和层析的基本原理是利用生物分子间的亲和力，将一个分子固定在不溶性基质上，然后利用分子间的亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
在亲和层析时，首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。
然后将配体共价结合在适当的不溶性基质上，如常用的Sepharose-4B等。
通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。
由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以这些方法的分辨率往往不高。
亲和层析法的应用范围非常广泛，可以用于分离纯化各种生物大分子，如蛋白质、酶、抗体、激素等等。
由于亲和层析法的分离效果非常好，因此可以获得高纯度、高活性的生物大分子，在生物工程、生物制药等领域具有重要的应用价值。
如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法引言亲和层析是一种常用的分离纯化生物大分子的方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
本文将介绍亲和层析的基本原理和常用方法。
一、亲和层析的基本原理亲和层析是利用化学结合的特异性，将目标分子与固定在层析柱上的亲和配体结合，从而实现目标分子的分离纯化。
其基本原理如下：1. 亲和配体选择性结合目标分子：亲和配体是一种具有特异性结合目标分子的生物大分子或化学物质。
通过选择合适的亲和配体，可以实现对目标分子的选择性结合。
2. 层析柱固定亲和配体：亲和配体通常通过共价键或非共价键的方法固定在层析柱的填料上。
固定亲和配体后，层析柱具有了对目标分子的特异性结合能力。
3. 样品溶液通过层析柱：样品溶液中含有目标分子和其他杂质分子。
当样品溶液通过层析柱时，目标分子会与层析柱上的亲和配体结合，而杂质分子则流经层析柱。
4. 目标分子的洗脱和回收：通过改变洗脱缓冲液的条件，可以使目标分子与亲和配体解离，从而实现目标分子的洗脱和回收。
二、常用的亲和层析方法亲和层析方法根据亲和配体的性质和结合方式的不同，可以分为多种不同的方法。
以下是几种常用的亲和层析方法：1. 金属离子亲和层析：利用金属离子与亲和配体之间的配位作用，实现对目标分子的选择性结合。
常用的金属离子包括Ni2+、Cu2+和Zn2+等。
2. 免疫亲和层析：利用抗体与抗原之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
免疫亲和层析广泛应用于生物医学领域，用于分离纯化抗体和抗原。
3. 亲和色谱层析：利用染料、受体或配体等分子与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和色谱层析方法有离子交换层析、亲和柱层析等。
4. 亲和吸附层析：利用亲和吸附剂与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和吸附层析方法有亲和蛋白A/G层析、亲和葡萄糖层析等。
三、亲和层析的应用领域亲和层析作为一种常用的分离纯化方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
亲和层析法原理硼酸
亲和层析法原理硼酸亲和层析法是一种从混合物中分离出目标分子（即配体）的技术。
该方法利用特定的亲和性分子（即配基）与所需分子结合的能力，将所需分子从混合物中拦截下来。
此技术的原理与制备置换树脂相似。
通常，亲和层析法可分为以下几个步骤：1. 预处理样品：将样品通过某些方法处理，以便使需要寻找的分子与其他分子分离。
2. 配基连接：将配基固定到某种材料（如氧化硅，丙烯酸树脂）上，以便捕捉目标配体。
3. 层析柱装填：将这种材料装入层析柱中，从而创建一个过滤混合物的过滤器。
4. 绑定目标：将样品流经层析柱，配基将配体捕捉下来。
5. 冲洗杂质：一旦所有目标分子都捕获，杂质就可以被冲洗掉。
6. 浓缩和洗脱：所需的分子可以通过复杂的方法浓缩和洗脱，以便得到纯净的样品。
这种技术信手拈来的用途包括纯化蛋白质，制备抗体，提取酶，以及从小分子药物中分离成分。
硼酸硼酸是一种不规则的分子，由三个元素组成：硼，氧和氢。
其化学式为H3BO3，通常以无色晶体或白色粉末形式存在。
硼酸具有很高的水溶性，并且可以用于制造淀粉糖和其他产品。
硼酸常常被用作缓冲剂，因为它具有在水中保持稳定的PH值的能力。
硼酸是一种较弱的酸，因此它可以用作在微生物学、细胞生物学和生物化学中的缓冲剂，以维持样品的一个稳定的PH范围。
此外，硼酸还可以用作用于甲醛固定的样本的缓冲剂，在死细胞、组织样品中广泛使用。
除了作为缓冲剂外，硼酸还可以用作高温玻璃和火花塞陶瓷的材料，因为硼酸具有高熔点和高热稳定性。
硼酸也被运用在清洗和杀菌产品中。
虽然硼酸不是一种危险的化学物质，但是有些人对其具有过敏反应。
硼酸也可以自然地存在于食物中，特别是对过量的硼酸摄入可能会对人体造成负面影响。
因此，人们需要保证自己食用的食品中不含有过多的硼酸，从而避免可能的健康问题。
结论亲和层析法使用配基捕捉目标分子，是一种用于纯化蛋白质的关键技术。
硼酸则是一种用于调节能维持物质含量PH值的缓冲剂。
尽管它们具有不同的用途，但二者在科学实验中都起着重要的作用。
亲和层析
葡聚糖凝胶 商品名:Sephadex 型号:G-100,150,200 型号含义:每克干凝胶吸水量X10 特点:理化性质稳定,耐热耐碱不耐酸,网孔小
四、配基的选择
应具备的特性： 1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 2.必须具备能被修饰的功能基团
以酶和底物为例来讨论配基与欲纯化的生物 物质的亲和性:
2.豌豆素生物活性测定 取反应板一块，分别在各孔中加入对照 生理盐水、杂蛋白洗脱液、豌豆凝集素收 集液各二滴再加入兔红细胞悬液1滴，置 37℃保温10分钟，取出后用玻棒在反应孔 轻轻搅动，比较各孔凝集情况，并解释结 果。
亲 和 层 析 Affinity Chromatography
一、概述
亲和层析：是利用生物大分子之间有 专一的亲和力而达到分离纯化的层析 方法
优点：1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和 缺点：1.针对某一分离对象就需要制备专一的 吸附剂和建立相应的实验条件 2.配基的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤
二、基本原理 生物专一吸附
(bioselective adsorption )
1.具有专一性亲和力的生物分子对： 酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅 酶因子） 特异性抗原—抗体 激素—受体 DNA—互补的DNA或RNA 凝集素和糖蛋白
2.基本过程： 固相化 (Immobilise)
配基Ligand:亲和层析中能被某一生 物大分子识别和可逆结合的生物专一性物 质。 基质Matrix(载体):亲和层析中与配基 共价结合,使其固相化的物质。
五、配基的固相化
固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于 水的固相基质上制成固相化吸附剂
过程：活化、接臂
"插入剂"或"手臂"使小分子配基适当的离开载 体骨架,克服载体空间位阻的影响
亲和层析法 (Affinity chromatography)
親和層析法（Affinity chromatography）在這裡，我們從四個方向介紹親和層析法。
1. 1.基本原理：說明親和層析法運作的方式。
2. 2.材質選擇：解釋如何選用適當的填充物。
3. 3.樣品的分離：說明如何達到最佳的分離效果。
4. 4.親和層析法的應用：使用親合層析法的時機。
一、基本原理親和層析（affinity chromatography）也稱為功能層析（function chromatography）、生物專一吸附（biospecific adsorption）或是選擇層析（selective chromatography）。
所謂的親和力，乃生物大分子和其配體（ligand）之間形成可逆結合的能力，如酵素和它的受質（substrate）、抗體和抗原、激素和受體（receptor）、RNA和其互補的DNA等，親和層析就是根據這種親和力發展出來的純化方法，例如將酶的substrate接在固體支持物上，再用此支持物填裝管柱，當含有這種酶的樣品溶液通過管柱時，酶便被吸附在管柱上，其它的蛋白質及雜質不被吸附，全部從層析柱流出，最後使用適當的緩衝液，將欲分離的酶從柱中洗出來，經過這些步驟便能得到純化的酶。
整個過程如下：二、材質選擇欲進行親和層析，ligand的選擇相當重要，ligand可以是輔酶、酶的抑制劑或抗體，具備的條件如下：1. 1.能與欲分離的物質進行專一性的結合，親和力愈大愈好。
2. 2.Ligand與分子結合後，在一定的條件下又能解離，而且不會因解離破壞原本的生物活性。
3. 3.Ligand上具有能連結到固體支持物上的團基，結合後不影響它與欲分離物質的結合專一性。
在實際操作上，若要純化的是某一種酶，則lignad選用此酶的競爭性抑制劑、受質（substrate）、輔酶或是效應劑（effector ）；若是要純化酶的抑制劑，就選用此酶作為ligand；純化能與某維生素結合的蛋白質，可以使用這種維生素當ligand；純化激素的受體（receptor），選用荷爾蒙當ligand。
亲和层析法注意事项
亲和层析法注意事项亲和层析法是一种常用的生物分子分离方法，需要注意以下事项：亲和层析柱的长度：亲和层析柱一般较短，通常在10cm左右。
过长的层析柱会导致样品与配体之间的亲和力下降，影响分离效果。
样品处理：亲和层析对样品处理要求较高，需要将样品中的杂质尽量去除，以减少对分离效果的影响。
同时，样品液的浓度也不宜过高，以免影响吸附效果。
缓冲液选择：亲和层析中选择的缓冲液应使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力，同时应有一定的离子强度，以减小基质、配体与样品其他组分之间的非特异性吸附。
温度控制：生物分子间的亲和力受温度影响，通常亲和力随温度的升高而下降。
因此，在上样时可以选择适当较低的温度，使待分离的物质与配体有较大的亲和力，能够充分地结合；而在后面的洗脱过程中可以选择适当较高的温度，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。
流速控制：上样时应注意选择适当的流速，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。
如果样品液的浓度过高，可以降低流速以便于样品与亲和吸附剂有更充分的接触时间进行吸附。
平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。
重复上样：如果待分离物质与配体的亲和力较小或者样品浓度较高、杂质较多时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。
洗脱液选择：洗脱液的选择应使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。
如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤，但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显影响，以免将待分离物质同时洗下。
以上是亲和层析法的一些注意事项，实际操作中需要根据具体情况进行调整和优化。
研究蛋白质相互作用的方法及原理
研究蛋白质相互作用的方法及原理蛋白质相互作用是生命科学研究中的重要问题，因为蛋白质在细胞内发挥着许多生物学功能，如信号转导、代谢调控和基因表达等。
在研究这些生物学过程时，了解蛋白质相互作用的方法和原理非常重要。
本文将介绍几种常见的研究蛋白质相互作用的方法及其原理。
1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中纯化出来的方法。
该方法利用目标蛋白质与其相互作用的配体（亲和剂）固定在填充层析柱中的树脂上，将混合物加入层析柱中，通过蛋白质与配体的特异性相互作用，使目标蛋白质与填充层析柱中的树脂结合，从而将其分离出来。
亲和层析法可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子等相互作用。
2. 免疫沉淀法免疫沉淀法是一种利用抗体特异性结合目标蛋白质的方法。
该方法将抗体固定在磁珠或凝胶颗粒上，将混合物加入其中，抗体与目标蛋白质特异结合，将其从混合物中沉淀出来，从而实现目标蛋白质的纯化。
免疫沉淀法可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸等相互作用。
3. 双杂交技术双杂交技术是一种检测蛋白质相互作用的方法。
该技术基于贝尔-拉布实验，将目标蛋白质的DNA序列与另外一种被称为“活化因子”的蛋白质DNA序列连接起来，形成一个双杂交体。
当该双杂交体与另一种包含另一个蛋白质DNA序列的双杂交体结合时，它们可以通过激活报告基因的表达来检测相互作用。
双杂交技术可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
4. 表面等离子共振(SPR)技术表面等离子共振技术是一种实时监测蛋白质相互作用的方法。
该技术基于利用表面等离子共振技术将一个蛋白质固定在芯片上，然后通过流动另一个蛋白质溶液，可以精确地测量这两个蛋白质之间的相互作用。
通过测定反应速率和平衡常数等参数，可以定量分析蛋白质相互作用的强度和亲和力。
表面等离子共振技术可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子等相互作用。
总之，以上这些方法可以帮助研究人员深入了解蛋白质相互作用的机制和原理，在生命科学中有着广泛的应用。
亲和层析法纯化酶的研究进展
亲和层析法纯化酶的研究进展亲和层析法是一种常用的酶纯化技术，其通过利用酶与其特异性结合物（亲和柱上的配体）之间的相互作用，对复杂的混合物进行分离和纯化。
本文将探讨亲和层析法在酶纯化领域的研究进展。
一、亲和层析法的原理亲和层析法基于酶与其特异性配体之间的特定相互作用。
酶可以与配体形成高度特异性和稳定的复合物，这是亲和层析法的基础。
配体通常通过共价或非共价结合在固定相（如亲和柱）上，而酶则在流经柱子时与配体结合。
通过对流动相的调节，可以实现在柱子上进行选择性的酶结合和洗脱，从而纯化目标酶。
二、亲和柱的选择选择适当的亲和柱对于酶的纯化至关重要。
常见的亲和柱包括亲和素亲和柱、金属螯合层析柱、亲和抗体亲和柱等。
根据目标酶与配体的相互作用类型，合理选择亲和柱可以提高亲和层析法的分离效果和纯化程度。
三、多步骤纯化策略的应用亲和层析法可以与其他纯化技术相结合，形成多步骤纯化策略，以提高酶纯化的效果。
常见的多步骤纯化策略包括离子交换层析、凝胶渗透层析、亲和层析法等。
通过不同纯化步骤的有序进行，可以有效地去除杂质，并提高纯化程度。
四、亲和层析法在酶纯化中的应用案例亲和层析法在酶纯化中得到广泛应用。
以乳酸脱氢酶（LDH）为例，研究人员利用LDH与NAD+/NADH的特异结合，设计了亲和层析法纯化方案。
首先，将NAD+/NADH修饰在亲和柱上，随后经过样品加载、非特异性洗脱和特异性洗脱等步骤，最终获得高纯度的LDH。
另外，亲和层析法还可以与其他技术相结合，用于纯化具有糖基化修饰的酶。
例如，将糖结合蛋白（如Concanavalin A）修饰在亲和柱上，可实现糖酶的选择性捕获和纯化。
五、亲和层析法的优势与限制亲和层析法具有选择性高、纯化程度高、操作简便等优点，广泛应用于酶纯化领域。
然而，亲和层析法也存在一些限制。
例如，某些配体可能与其他组分结合形成非特异性复合物，导致纯化效果下降。
此外，亲和柱的制备成本较高，也制约了亲和层析法的广泛应用。
四种蛋白纯化的有效方法
四种蛋白纯化的有效方法四种蛋白纯化的有效方法在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中，常常需要将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标蛋白样品，以便进一步进行结构和功能研究。
然而，由于蛋白质的复杂性以及其在混合物中的低浓度，蛋白纯化常常面临一系列的挑战。
为了克服这些挑战，科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。
在本文中，我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法，并探讨其原理和适用性。
1. 亲和层析法：亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的方法。
这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力，通过设计具有高亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。
在实验中，我们可以将配体固定于固相材料上，例如琼脂糖或石蜡烃树脂，并将载有目标蛋白的混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。
随后，非特异性蛋白质被洗脱，而目标蛋白则被保留下来。
目标蛋白可以通过改变条件（例如改变pH值或添加竞争性配体）来洗脱。
亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。
然而，由于亲和剂的设计和合成需要具有相关专业知识，并且选择适当的配体是关键。
亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。
2. 凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。
凝胶过滤层析法是利用凝胶材料，例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶，通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。
较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙，因此会在凝胶的表面留下。
较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中，因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。
凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快，且可以对蛋白进行某种程度的分离。
然而，该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制，因此对于体积较大的蛋白分子，凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。
3. 离子交换层析法：离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
常用抗体纯化方法
常用抗体纯化方法抗体纯化是分离和纯化单克隆或多克隆抗体的方法，以获得高纯度和高活性的抗体样品。
常用的抗体纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤法、亲和电泳法、硫酸铵沉淀法等等。
下面将对常用的抗体纯化方法进行详细介绍。
1.亲和层析法：亲和层析法是一种基于抗原-抗体互作原理的分离纯化方法。
先制备含有抗原的固相材料，如亲和树脂或亲和膜，然后将抗体样品与这些固相材料接触，使抗体与抗原结合，其他非特异性蛋白质被洗脱，最后用适当的溶液洗脱目标抗体。
这种方法可以用于多克隆或单克隆抗体的纯化。
2.离子交换层析法：离子交换层析法是利用样品中的离子性蛋白质与离子交换树脂（正离子交换或负离子交换）之间的相互作用进行分离的方法。
通过改变洗脱缓冲液的离子强度和pH值，可以将目标抗体从离子交换树脂上洗脱下来。
这种方法适用于广泛的抗体样品，可以快速纯化大量的抗体。
3.凝胶过滤法：凝胶过滤法是一种分子大小分离纯化方法，适用于分离分子量较大的抗体。
基本原理是通过调节凝胶孔隙大小，使大分子如抗体可以滞留在凝胶中，而小分子如低分子量杂质则可以通过凝胶孔隙逸出。
这种方法操作简单，纯化速度快，适合于大量抗体的纯化。
4.亲和电泳法：亲和电泳法是利用抗体在电场中迁移速度与分子特性有关的原理进行纯化的方法。
可以通过改变电场强度、溶液pH值和溶液离子浓度等参数来调节抗体的迁移速度，从而实现抗体的纯化。
亲和电泳法适用于纯化低丰度目标抗体和快速分离纯化。
5.硫酸铵沉淀法：硫酸铵沉淀法是利用硫酸铵的沉淀作用将目标抗体从混合物中分离出来的方法。
通过调节溶液的硫酸铵饱和度和沉淀时间，可以得到纯度较高的抗体样品。
该方法简单、快速，适用于大量抗体的纯化。
总的来说，抗体纯化方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，可以根据具体的实验要求和抗体性质选择最适合的纯化方法。
同时，也可以结合两种或多种方法进行联合纯化，以获得更高纯度和活性的抗体。
亲和层析分析
酶的名称
醇脱氢酶 3-磷酸甘油醛脱氢酶
己糖激酶 甘油激酶
来源
结合强度* 吸附剂1 吸附剂2
酵母
400
0
兔肌肉
0 >1 mol/L#
酵母
0
0
122
0
*以KCl浓度（mol/L）表示。 #需加5×10-3 mol/L还原辅酶I才能洗脱。
一种专一性的亲和吸附剂只能分离一种酶，虽然效 率高，但使用范围窄，如果能以一类酶的通用配基 制成亲和吸附剂，再仔细选择洗脱条件，将其逐个 分别洗脱下来，可以在短时间内分离纯化几个酶。
主要技术指标： ⑴．配基偶联量：0.5-1.0 (mmol/ml胶)； ⑵．蛋白吸附量：4-6(mg/ml胶)； ⑶．活性回收率：80%左右。
多孔玻璃载体亲和吸附剂的制备
载体先在5％硝酸溶液中煮沸45 min，用水洗涤，在 115℃下烘干，1g干的清洁载体加入75 mL 10%的γ丙氨基三乙氧硅烷，后者溶解在甲苯中，回流12-24 小时，用甲苯、丙酮清洗，空气干燥。
活化载体“接臂”
“接臂”的前提：小分子作为配基，被分离物质是大 分子，空间位阻影响亲和吸附。
具有专一亲和力的生物分子对主要有： 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA 酶与它的底物或竞争性抑制剂 激素（或药物）与它们的受体 维生素和它的特异结合蛋白 糖蛋白与它相应的植物凝集素等
亲和层析的优点
♦ 待分离物质与配基专一性结合，分辨率 高，操作简单，一次操作即可得到较高 纯度的分离物质。
♦ 具有浓缩作用，纯化倍数高达几千倍。 ♦ 分离条件温和，有利于保持物质原有的
例如：SAH（S-腺苷酰-高半胱氨酸）可以作为 RNA、DNA和蛋白质转甲基化酶的通用配基。
转甲基化酶
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目
录
亲和层析的基本原理
制备方法
操作步骤
亲和层析的应用
亲和层析能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非
常高，对含量极少又不稳定的生物活性药物的分离极为有效，它是一种专门 用于分离纯化生物大分子的层析分离技术。 相应的配体 底物、抑制剂、辅酶（辅因 子） 所要分离的目的产物 酶
抗体
凝集素 激素
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大
分子结合的配体，如各种凝集素可以结合各种糖蛋白等。 通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合
适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、
偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得 到了广泛的应用。
抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白 脱氢酶和激酶 蛋白质 蛋白质 脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内 切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等
辅酶和磷酸酰苷
过渡金属离子（Cu2+等） 组氨酸 肝素
抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结 合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是 以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的 有效手段。 凝集素
5、洗脱
当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱目标产物时， 可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性，失 去与配基的结合能力。但应注意目标产物变性后能否 复性。 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无 亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱， 以备下次使用。
图8.2 亲和层析操作示意图
①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； ③抗微生物和酶的侵蚀； ④最好为粒径均一的球形粒子； ⑤具有亲水性，无非特异性吸附； ⑥含有可活化的反应基团，利于亲和配体的固定化。
例：琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为 2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。Sepharose 4B 的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。
物质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯
化是不利的。
②具有与基质共价结合的基团 与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组 分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸 附作用。 ③配体要能够与基质稳定的共价结合 在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对 其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中 与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明 显影响。 ④配体自身应具有较好的稳定性 在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的较剧烈的 条件，可以多次重复使用。
缺点：基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa＝ 10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子 离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。 另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配 体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易 挥发，所以操作不便。
凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的 总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同 的凝集素与糖结合的特异性不同。例如，常用做亲和配基的伴刀豆 球蛋白A(concanavalin A，con A)与葡聚糖和甘露糖的亲和结合作 用较强。
辅酶和磷酸酰苷
各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存在下表现其生 物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和作用。辅酶主要有 辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadenine dinucleotide，NAD）、辅酶Ⅱ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NAD phosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外，磷酸腺苷 （adenosine 5’-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷 （adenosine2’，5’-diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶 的结构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用，可用做这些酶 的亲和配基。 过渡金属离子
为：
生物亲和层析 利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和作用，通常 具有高的选择性，典型的物质对有酶-底物， 酶-抑制剂，激素-受 体等。
免疫亲和层析
利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测法，特别适用于 检测含量低微的样品。
偶联。
基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表 面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 不同的载体活化需要不同的活化剂。 常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、
高碘酸盐、苯醌等。
活化溴化腈活化法
溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺 碳酸活性基团，它可以和伯氨（NH2）反应，主要生成异脲衍生物。 反应如下：
2、配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。 如抑制剂、底物、抗体、辅酶等。 依据蛋白结构设计配体要考虑两个重要因素： ① 正确地预计被设计的配体构像 ② 正确预计配体的亲和力 优良配体须具备的条件： ① 与待纯化的物质有较强的亲和力。 一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析 时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化
金属离子亲和层析 金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统，目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，
如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利
于蛋白质与固定化金属离子结合，这是用于蛋白质分离纯化的根据。 金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸
环氧基活化法
在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合 物；在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶 联。
优点：活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的N－C、O－ C 和S－C 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用 寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，没有毒性。 缺点：用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为9-13，温度为20-40℃。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能 不适用。
配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法。
在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。配基必须偶联于不溶 性母体上。母体又称为载体或担体，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。
2、亲和作用的机理
结构特点 钥匙和锁孔的关系 相互作用力 静电作用、氢键、疏水性相互作用、配位键、弱共价键 等。 影响亲和作用的因素 离子强度、pH值、抑制氢键形成的物质、温度、液体离
改变离子强度
专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制剂、底物类似 物） 被吸附物质结合 竞争性地与 配体结合
2、基质活化
当用小分子化合为作为配体时，由于空间位阻作用，难于与配对
的大分子亲和吻合，常在母体与配体之间引入适当长度的连接臂。
要使不溶性母体与配体偶联或通过连接臂与配体偶联，必须先使 母体活化。即使母体引入某一活泼的基团，才能以共价键与配体
主要内容
亲和层析的基本原理
制备方法
操作过程
亲和层析的应用
1、操作流程
层析前：制备亲和层析剂 选择 根据欲分离物质特性 根据配基分子大小及基团特性 配基 选择 载体 偶联
亲和层析剂
洗脱：削弱目的产物和亲和吸附配体间的相互作用。 包括：非专一性洗脱和专一性洗脱
非专一性洗脱：
改变温度 改变pH值
的巯基结合，含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子
亲和层析得到分离。 拟生物亲和层析 利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工 合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析。
主要内容
亲和层析的基本原理
制备方法
操作过程
亲和层析的应用
1、载体的选择
一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰载 体，以制备所需的亲和吸附介质即固定相。 作为载体的物质应具有：
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性
配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。
特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合
的配体。如生物素－亲和素、抗原－抗体、酶－抑制剂、激素－受体 等，它们结合都具有很高的特异性。
另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法等。
3、偶联
经过活化和洗涤过的基质与等体积的0.2-0.5mol/L碳酸 盐缓冲液混合，缓慢搅拌2小时，或室温下过夜，以便配体和 基质充分偶联而形成固体载体。对于偶联极牢固会丧失活性 的大分子物质配体，则应在低pH值缓冲液中反应或活化基质 预先在pH8.3的碱性溶液中进行适当的水解作用，这样可提高 配体的活性。 配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去除未偶联 的配体。另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的活 性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的亲和层析分离。 例如对于能结合氨基的活性基团，常用的方法是用2－乙醇胺、 氨基乙烷等小分子处理。
4、配体结合量的测定
配体结合量一般是用每毫升或每克贮存胶束缚配体
的量来表示，测得的配体结合量，可作为决定亲和 吸附剂实际用量的参数，具体测定方法有直接测定 法（2,4,6-三硝基苯磺酸钠的颜色试验和根据配体 的特征来进行测定）和间接测定法（推算法和根据 亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的 结合量）。