2015启动子克隆与荧光素酶报告基因分析
荧光素酶报告基因实验的用途
荧光素酶报告基因实验的用途
荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物技术实验，其用途主要有两个方面。
一、检测基因转录活性
荧光素酶报告基因实验可以用来检测基因的转录活性，即某一特定基因在细胞中是否被转录成RNA。
实验中，将荧光素酶基因与待测基因的启动子序列连接，构建成荧光素酶报告基因，然后将其转染到细胞中。
若待测基因的启动子序列在该细胞中被活化，则会促使荧光素酶基因转录成mRNA，再进一步转化成荧光素酶，从而发出荧光信号。
通过测量荧光信号的强度，可以判断待测基因的转录活性。
二、筛选基因调控剂
荧光素酶报告基因实验还可以用来筛选基因调控剂，即寻找能够调节某一特定基因转录活性的化合物。
实验中，将荧光素酶基因与待测基因的启动子序列连接，构建成荧光素酶报告基因，然后将其转染到细胞中。
接着，将待测化合物加入细胞培养基中，观察荧光信号的变化。
若待测化合物能够促进或抑制待测基因的转录活性，则会对荧光信号产生影响。
通过比较不同化合物对荧光信号的影响，可以筛选出能够调节待测基因转录活性的化合物。
总之，荧光素酶报告基因实验是一种重要的生物技术实验，可用于检测基因转录活性和筛选基因调控剂，具有广泛的应用前景。
基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果评估
基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果评估摘要：近年来，基因启动子活性检测技术在克隆表达研究中得到了广泛应用。
本文通过系统综述已有文献，并结合实验研究结果，评估了基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果。
研究发现，基因启动子活性检测技术可通过定量及定位分析启动子活性，从而提高克隆表达效率和精确性。
然而，在选择合适的启动子，优化实验条件和解读数据方面仍存在一些挑战和限制。
因此，进一步的研究和优化仍然需要进行。
引言：基因启动子是调控基因转录的关键序列。
准确评估基因启动子的活性对于克隆表达和基因功能研究具有重要意义。
传统的基因启动子活性检测方法存在一些局限性，如低灵敏度、低通量和复杂操作等。
近年来，随着新技术的出现，基因启动子活性检测在克隆表达研究中得到了广泛应用。
本文旨在评估基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果，为相关领域的研究提供参考和指导。
一、基因启动子活性检测技术的原理和方法1. 荧光素酶报告基因系统荧光素酶报告基因系统是一种常用的基因启动子活性检测方法。
它利用荧光素酶作为报告基因，通过测量其活性来反映启动子的活性水平。
这种方法具有高灵敏度、高通量和低背景的优点，被广泛应用于克隆表达研究。
2. 可视化报告基因系统可视化报告基因系统是另一种常用的基因启动子活性检测方法。
它利用可视化标记（如荧光蛋白和β-半乳糖苷酶等）作为报告基因，使启动子活性的检测结果可以直观地观察和分析。
可视化报告基因系统具有直观、快速和定量化分析的优点，在基因启动子活性检测中得到了广泛应用。
二、基因启动子活性检测技术在克隆表达中的应用1. 提高克隆表达效率通过基因启动子活性检测技术可以筛选出活性高的启动子，从而提高克隆表达效率。
研究发现，活性高的启动子与高表达水平存在正相关关系，选择合适的启动子可以显著提高克隆表达效果。
2. 精确调控克隆表达水平基因启动子活性检测技术可以定量分析启动子的活性水平，从而实现精确调控克隆表达水平。
荧光素酶报告基因实验
荧光素酶报告基因实验
荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物学实验方法，它通过荧光素酶作为报告基因的表达，来研究目标基因的表达情况。
这种实验方法可以应用于多种生物学研究领域，包括基因调控、蛋白质相互作用等研究。
在本文中，将介绍荧光素酶报告基因实验的基本原理、实验步骤和数据分析方法。
首先，进行荧光素酶报告基因实验前，需要准备实验所需的材料和试剂。
这些包括质粒载体、目标基因的启动子、荧光素酶基因、细胞培养基、转染试剂等。
在实验过程中，需要注意材料的质量和纯度，以确保实验结果的可靠性。
接下来，进行荧光素酶报告基因实验的步骤包括，转染质粒载体到细胞、荧光素酶基因的表达、荧光素酶活性检测等。
首先，将质粒载体和目标基因的启动子共转染到细胞中，待细胞表达目标基因后，再加入荧光素底物，通过荧光素酶的催化作用产生荧光信号。
最后，使用荧光素酶检测试剂盒对荧光素酶活性进行检测和定量分析。
在数据分析方面，可以通过比较不同条件下荧光素酶活性的差异，来研究目标基因的表达调控机制。
此外，还可以利用荧光素酶报告基因实验来研究蛋白质相互作用、信号转导通路等生物学过程。
总之，荧光素酶报告基因实验是一种重要的生物学实验方法，它在基因表达调控、蛋白质相互作用等研究领域具有广泛的应用前景。
通过本文的介绍，相信读者对荧光素酶报告基因实验有了更深入的了解，希望能够对相关研究工作有所帮助。
【豆丁推荐】-PLUNC基因启动子区荧光素酶报告载体的构建与鉴定
-----------------------------------Docin Choose -----------------------------------豆 丁 推 荐↓精 品 文 档The Best Literature----------------------------------The Best Literature热带医学杂志2009年2月第9卷第2期·硕博专栏论著·[文章编号]1672-3619（2009）02-0147-04基金项目：广东省自然科学基金（No．32874）；广东省医学科研基金（No．2004382）。
作者简介：刘贝娜（1982－），女，硕士研究生，主要从事鼻咽癌基因多态性方面的研究。
*通讯作者：何英，女，硕士生导师，副主任医师，E-mail ：ying-h＠tom．comPLUNC （palate ，lung and nasal epithelium clone ）基因即腭、肺、鼻上皮细胞克隆，多在口腔、鼻、呼吸和消化道的上皮表面或分泌腺中高表达［1－3］。
多项研究表明PLUNC 基因与鼻咽癌关系十分密切，其表达下调可能有助于鼻咽癌的发生，为抑瘤基因的候选者［4，5］。
我们前期对该方面也做了更深入的研究［6］，发现hPLUNC 基因启动子区多态位点C－1888T 与中国广东人群鼻咽癌易感性关系非常密切（OR＝2．8－3．3，P ＜0．001），而且携带单倍体型C－C 的个体更易患鼻咽癌（OR＝1．86，95％CI＝1．34－2．56，P ＝0．00016），说明hPLUNC 基因的遗传多态性可能影响了广东人群鼻咽癌的易感性。
本研究采用PCR 技术从人类基因组中克隆了PLUNC 基因1888位点含C ／T 的2种单倍体型的荧PLUNC 基因启动子区荧光素酶报告载体的构建与鉴定刘贝娜1，何英1*，王爽2（1．南方医科大学南方医院耳鼻咽喉头颈外科，广州510515；2．南方医科大学病理学教研室，广州510515）【摘要】目的构建人PLUNC （palate ，lung and nasal epithelium clone ）基因启动子区C-1888T SNP 位点不同单倍型荧光素酶报告基因表达载体。
启动子双荧光素酶报告基因原理
启动子双荧光素酶报告基因原理引言：启动子双荧光素酶报告基因是一种常用于研究基因表达的方法，它可以通过测量荧光素酶的活性来间接评估启动子的活性。
本文将介绍启动子双荧光素酶报告基因的原理及其应用。
一、启动子双荧光素酶报告基因的构建启动子双荧光素酶报告基因通常由两个荧光素酶基因组成，分别为荧光素酶A（lucA）和荧光素酶B（lucB）。
这两个基因分别与不同的启动子相连，用于报告不同基因的表达水平。
其中，荧光素酶A 通常用于报告目标基因的表达水平，而荧光素酶B则用于作为内部对照基因。
二、启动子双荧光素酶报告基因的工作原理启动子双荧光素酶报告基因的工作原理基于荧光素酶的催化反应。
荧光素酶是一种能催化荧光素氧化并产生荧光的酶，其催化反应需要三个物质：荧光素、ATP和镁离子。
在细胞内，通过对启动子的识别和结合，荧光素酶能够选择性地催化荧光素的氧化反应，从而产生荧光信号。
当启动子活性较高时，荧光素酶A和荧光素酶B均能结合到各自的启动子上，催化荧光素的氧化反应。
此时，通过测量荧光素酶A和荧光素酶B的荧光强度，可以间接反映目标基因和内部对照基因的表达水平。
而当启动子活性较低时，只有内部对照基因的启动子能够被荧光素酶B结合，从而产生荧光信号。
三、启动子双荧光素酶报告基因的应用启动子双荧光素酶报告基因广泛应用于基因表达调控研究、药物筛选以及毒性评估等领域。
通过构建不同启动子与荧光素酶基因的连接，可以实现对不同基因的表达活性的定量监测。
同时，通过比较目标基因和内部对照基因的荧光强度，可以减少实验误差，提高结果的可靠性。
在基因表达调控研究中，启动子双荧光素酶报告基因可以用于研究启动子序列对基因表达的调控效应。
通过构建不同长度、不同突变的启动子序列，可以评估启动子对基因表达的影响。
此外，启动子双荧光素酶报告基因还可以用于筛选调控基因表达的化合物，如药物和小分子化合物。
在药物筛选中，启动子双荧光素酶报告基因可以用于评估药物对基因表达的影响。
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因启动子活性分析（双荧光素酶报告基因实验）一、实验目的：分析启动子活性二、实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?Reporter AssaySystem（Promega）试剂盒来检测。
利用单通道多标记荧光检测仪测定荧光素酶活性。
在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被同时转染入细胞内作为内参。
三、实验材料：Dual-Luciferase?Reporter Assay System （Promega）试剂盒，PBS，细胞裂解液，96孔，四、实验设备：单通道多标记荧光检测仪五、实验方法及步骤：1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量0.8μg的原则转染细胞，36h后收获细胞；2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液20μl，置于室温震荡裂解20min；3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μl Luciferase Assay Reagent，轻轻震荡混匀，立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定Firefly Luciferase活性；4）读数后立即加入50μl Stop & Glo?Reagent轻轻震荡混匀，读取Renilla Luciferase活性；5）所得的结果为各个实验样品的Firefly Luciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。
每个实验组重复3-4孔，整个实验独立重复3次。
实验结果均为3次独立的实验结果的平均值。
所有的结果均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。
六、注意事项1.做好对照。
2.多做几个复孔，求平均值。
七、补充知识点双荧光素酶报告基因实验1.试剂盒：Dual-Glo TM Luciferase Aassy System（promega E2920）组成如下：? Dual-Glo?萤光素酶缓冲液Dual-Glo?萤光素酶底物（冻干粉）Dual-Glo?Stop-Glo?缓冲液Dual-Glo?Stop-Glo?底物2.报告基因的作用细胞信号转导途径启动子/增强子受体结合病毒/细胞相互作用转录因子药物诱导作用或“效果”3.原理–制备含有luc/ R luc的DNA–转染–提供刺激–测量荧光–用海肾萤光素酶作对照归一实验变化归一反应=实验的(萤火虫萤光素酶)/ 对照的（海肾萤光素酶)4.载体- 萤火虫萤光素酶载体pGL3 家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-Promoter海肾萤光素酶报告基因载体pRL-TK5.试剂制备–将Dual-Glo? 萤光素酶缓冲液倒入Dual-Glo? 萤光素酶底物中，Dual-Glo? 萤光素酶试剂，分装后-70℃保存，避免反复冻融–用Dual-Glo? S top &Glo? 缓冲液按1:100 稀释Dual-Glo? Stop &Glo? 底物（现用现配）–所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于–20°C两步加入试剂：加，读，加，读6.检测步骤：实验前，将Dual-Glo? 萤光素酶试剂平衡到室温1.确认使用的细胞板可以用于荧光检测2.测萤火虫荧光素酶活性：向待测细胞板每孔中加入与培养基等体积的Dual-Glo? 萤光素酶试剂，混匀。
荧光素酶报告基因实验原理和应用
荧光素酶报告基因实验原理和应用
荧光素酶报告基因实验是一种常用的分子生物学技术，其原理
是利用荧光素酶（Luciferase）基因作为报告基因，将其插入到感
兴趣的基因或启动子区域中，通过检测荧光素酶的活性来研究目标
基因的表达情况或调控机制。
在实验中，研究人员首先将荧光素酶基因与感兴趣的基因或启
动子区域连接成融合基因，然后将融合基因导入到细胞系或转基因
模型中。
随后，通过添加荧光素底物（如琥珀酸衍生物）来激活荧
光素酶，荧光素酶与底物发生化学反应产生荧光信号，研究人员可
以通过荧光素酶活性的检测来定量或定性地分析目标基因的表达水
平或调控情况。
荧光素酶报告基因实验在生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因的转录水平和调控机制，通过分析荧光素酶活
性的变化来了解基因的表达模式及其受到的调控。
其次，荧光素酶
报告基因实验也可以用于筛选药物或化合物对基因表达的影响，从
而在药物研发领域发挥重要作用。
此外，荧光素酶报告基因实验还
可以用于研究信号转导通路、蛋白质相互作用等生物学过程，为科
研人员提供了重要的工具和手段。
总之，荧光素酶报告基因实验通过检测荧光素酶活性来研究基因表达和调控，具有灵敏度高、操作简便、应用广泛等特点，对于生物学研究和药物开发具有重要意义。
荧光素酶报告基因检测
荧光素酶报告基因检测
荧光素酶报告基因检测的原理是利用荧光素酶（Luciferase）作为报告基因，将其与感兴趣的基因启动子区域连接，构建成重组融合基因。
当该融合基因转染到细胞中后，若目标基因启动子区域受到调控，荧光素酶的表达水平也会受到影响。
通过加入荧光素底物后，荧光素酶会产生荧光信号，其强度与目标基因的表达水平成正比，从而可以通过检测荧光信号的强度来间接反映目标基因的表达水平。
荧光素酶报告基因检测在科研领域中有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因的调控机制。
通过构建不同长度或突变的基因启动子区域，可以了解到底哪些区域对基因的表达起着关键作用。
其次，荧光素酶报告基因检测也可以用于筛选药物或其他化合物对基因表达的影响。
通过将荧光素酶报告基因检测与高通量筛选技术相结合，可以快速筛选出对特定基因表达具有调控作用的化合物。
此外，荧光素酶报告基因检测还可以用于研究信号转导通路、蛋白质相互作用等多个研究领域。
相比于其他报告基因检测技术，荧光素酶报告基因检测具有许多优势。
首先，荧光素酶的底物具有极高的灵敏度和稳定性，使得
检测结果具有较高的准确性和重复性。
其次，荧光素酶报告基因检
测的操作简单、快速、成本较低，适用于大规模的样品检测。
此外，荧光素酶报告基因检测还可以通过荧光信号的定量来精确测定基因
的表达水平，而不受到其他细胞因素的干扰。
总之，荧光素酶报告基因检测是一种广泛应用于分子生物学研
究领域的技术，其原理简单、灵敏度高、操作方便、成本低，因此
受到了科研人员的青睐。
相信随着技术的不断进步，荧光素酶报告
基因检测将在生命科学领域发挥更加重要的作用。
启动子双荧光素酶报告基因原理
启动子双荧光素酶报告基因原理启动子双荧光素酶报告基因是一种用于研究基因转录水平的实验技术，它能够通过检测荧光素酶基因的表达来反映目标基因的转录活性。
该技术的原理基于双荧光素酶基因的表达与目标基因转录活性之间存在正相关关系。
下面对启动子双荧光素酶报告基因技术的原理进行详细介绍。
首先，启动子双荧光素酶报告基因技术是建立在荧光素酶酶活性检测原理的基础之上的。
荧光素酶（luciferase）是一种广泛应用于生物学研究的标记物质，它通过氧化反应产生可见光。
荧光素酶酶活性检测体系中含有荧光素底物，当荧光素底物被酶催化氧化时会产生可见光，其强度与荧光素酶的活性成正比。
在启动子双荧光素酶报告基因技术中，荧光素酶基因被用作报告基因。
报告基因是一种外源基因，它能够表达荧光素酶并产生可见光信号。
在该技术中，荧光素酶基因与目标基因启动子区域相连，使得荧光素酶基因的转录受到目标基因启动子的调控。
当目标基因启动子区域与荧光素酶基因连接后，研究者可以通过转染等方法将该启动子双荧光素酶报告基因构建导入细胞中。
细胞在转染后，目标基因的启动子区域与荧光素酶基因结合，并促使荧光素酶基因转录，从而导致荧光素酶的表达。
为了测定荧光素酶基因的表达水平，研究者需要添加荧光素底物到细胞培养基中。
荧光素底物与荧光素酶相结合后会发生氧化反应，产生可见光，其强度则与荧光素酶表达水平成正相关。
通过荧光素酶基因表达产生的可见光信号的强度，可以反映目标基因启动子区域的转录活性。
为了更精确地分析目标基因的转录活性，启动子双荧光素酶报告基因技术还可以与荧光素酶的突变体（如分光荧光素酶）结合使用。
这使得研究者可以同时检测多个目标基因的转录活性，从而进行更全面的分析和研究。
总结起来，启动子双荧光素酶报告基因技术是一种通过检测荧光素酶基因的表达来反映目标基因的转录活性的实验技术。
该技术的原理基于荧光素酶酶活性检测原理，将荧光素酶基因与目标基因启动子区域连接起来，使得荧光素酶基因的转录受到目标基因启动子的调控。
启动子活性分析
If there is no specific antibody, then epitope tagging can be employed (FLAG, MYC, HIS)
mixture of the 2 oligos to 95°C and let them slowly cool down by turning off the heat block.
AP-1 biotin-5’-GCT TGA TGA CTC AGC CGG AA C-3’
3’-CGA ACT ACT GAG TCG GCC TT G-5’-biotin
Procedure
1. Prepare nuclear protein extracts 2. Prepare Biotin- labeled and unlabeled target DNA 3. Plan Binding Reactions 4. Prepare and Pre-Run Gel 5. Prepare and Perform Binding Reactions 6. Electrophorese Binding Reactions 7. Electrophoretic Transfer of Binding Reactions to Nylon
启动子（Promoters）
是位于结构基因5‘端上游的DNA序列，其长度从100 bp到200 bp不等，与转录起始时RNA聚合酶识别、结合和启动转录有关。
启动子控制基因转录的起始时间和表达的程度。
人白介素_15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建
人白介素 15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建陶千山,罗 欣,柴 瑜,胡道军,张胜权(安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室,安徽合肥230032)摘 要:目的克隆人白介素 15(IL 15)基因系列启动子,构建IL 15基因启动子荧光素酶报告基因载体。
方法通过PCR 方法从H aCaT 细胞基因组DNA 中获得I L 15基因编码序列5 上游七段逐步缺失的IL 15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因p GL 3 Basic 载体上,构建IL 15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至H aCa T 细胞,并设置空白对照组和LPS 组分别处理;24h 后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。
结果经PCR 方法扩增出七段逐步缺失的IL 15基因启动子片段,PCR 及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染H aCaT 细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。
结论成功构建了IL 15系列启动子报告基因载体,并在H aCa T 细胞中初步活性分析得知所克隆IL 15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL 15表达调控机制奠定了实验基础。
关键词:IL 15;启动子;双荧光素酶报告基因中图分类号:Q 782;Q 785 文献标识码:A 文章编号:1005 1678(2011)03 0187 04Construction of hu man IL 15gene pro m oter luciferase reporter gene vectorsTAO Q ian shan ,LUO X in ,C HA I Yu ,HU D ao j u n ,Z HANG Sheng quan(Depart m ent of B ioche m istry and M olecular B iology,AnhuiM edical Universit y ,H e fei 230032,China ) Abstract :Purpose To c l o ne series o f the hu m an I L 15gene pro m oter and to construct seven l u c ifer ase repo rter gene vectors containing I L 15pr omo ter reg ions .M ethods Seven DNA frag m ents of t h e 5 flanking reg ion of hum an I L 15gene w ere iso lated fro m geno m ic DNA ofH a C a T cells by po l y m erase cha i n reacti o n(PC R ).A fter being d i g ested w ith restricti o n enzy m es ,I L 15gene fa m il y pro m otersw ere inserted i n to the luciferase reporter vecto rs PGL3 Basic .Then the reco mb i n ant constructw h i c h contai n s the largest I L 15pro m oter reg i o n w as transientl y transfected i n to H aCa T cells .6hours l a ter ,cells w ere respectively treated w ith DME M,LPS .Then the acti v ity of luc iferase w as detected .R esults Seven frag m ents of I L 15gene pro m oter w ere a mp lified by PC R,and the identificati o n of PCR and doub le d i g estion o f reco m bined plas m i d w as co m p l e tely correc.t The experi m en t of transient transfection sho w ed that the largest I L 15pro m oter reg ion has t h e sign ificant activ ity .Conclusion The hum an I L 15gene pr o m o ter l u ciferase reporter gene vectors have been constr ucted successfu ll y .The ana l y sis of acti v ity i n H a C a T cells ind i c ated that the cloned I L 15gene fa m ily pro m oters con tain the key cis regulatory ele m ents .Itw ill be essential to further study the regulation o f I L 15expression.K ey w ords :I L 15;Pro mo ter ;Dua l luc iferase reporter gene 收稿日期:2010 06 28基金项目:安徽省自然科学基金(050430604);安徽省重点实验室优秀中青年科研带头人专项基金作者简介:陶千山,男,在读硕士研究生;张胜权,通信作者,副教授,博士,E m ai:l sqz 36@yahoo .co m 。
人Puma启动子荧光素酶报告基因的构建和鉴定
Ｃｏ ｔ ｕｃｉ ｎ ｄ ｄｅ ｉｉ ａｉ ｎ ｆ ｈ ｎｓｒ ｔｏ ａｎ ｉ ｎｔｆｃ ｔｏ ｏ ｕｍ ａｎ Ｐｕｍ ａ ｐ ｏｍ ｏ ｏｒｌ ｉｅ ａｓ ｅ ｒ ｅ ｅ ｔ ｒ ｒ ｔ ｕｃｆ ｒ ｅ ｒ ｐｏ ｔｇ ｎｅ ｖ ｃ ｏ
ｌｅｆｒｓ ｅ ｏｔｇ ｎ ｅｅ ｔ ｎ ｙｔｍ Ｒｅ ｕｌｓ： ｅ ｓｑ ｅ ｃｎ ｅｕｔ ｎ ｉａｅ ｔａ ｈ ｍｐｉ ｅ ｅ ｕ ｎ ｅ ｗａ ｏｒｃ ， ｎ ｔｅ ｌｅｆｒｓ ｕ ｉ ａｅｒｐ ｒ ｅ ｅ ｄ ｔｃｉ ｓｓｅ ｅ ｏ ｓ ｔ Ｔｈ ｅ ｕ ｎ ｉｇ ｒｓ ｌ ｉｄｃ ｔｄ ｈ ｔ ｅ ａ ｌ ｄ ｓｑ ｅ ｃ ｓｃ ｒｅ ｔ ａ ｄ ｈ ｕ ｉ ａｅ ｓ ｔ ｉ ｆ ｅ ａｔ ｉ ｅ ｎ ｔ ｔｄ ｔａ ｈ ｏ ｓｒｃｅ ｅ ｔｒｈ ｄｔｅｐｏ ｍｔｒａ ｔ ｉｙ Ｃｏｎ ｌ ｓｏ ： ｈ ｕ ｎＰ ｍａｐ ｏ ｍｔｒｌｃｆｒｓ ｅ ｏ ｅ ｅ ｅｖｃｏ ｃｉ ｔ ｄ ｍｏ ｓｒ ｅ ｈ ｔｔｅｃ ｎ ｔ ｔｄｖ ｃｏ ａ ｈ ｒｎ ｏ ｃｉ ｔ． ｖｙ ａ ｕ ｖ ｃ ｕ ｉｎ Ｔ ｅｈ ｍａ ｕ ｒｎ ｏ ｕ ｉ ａｅｒｐ ｒ ｒｇ ｎ ｅ ｔｒ ｅ ｔ
・
４ ２・
西南 国防 医药 ２ ０ ０ ９年第 ｌ ９卷第 １ 期
・
ห้องสมุดไป่ตู้
论著 ・
人 Ｐ ｍａ 动 子荧 光素 酶报 告基 因的构 建和 鉴定 ｕ 启
刘 兵 （ 解放军第 ３４医院检验科 ， 庆 ４ ０ ２ ） ２ 重 ００ ０
摘要
目的： 克隆人 Ｐ ｍ 基 因的启动子 ， 入荧光 素酶报告基 因载体 中， 在细胞 内检 测其活性 。方法 ： 用 Ｐ Ｒ技 ｕａ 插 并 采 Ｃ
载脂蛋白M基因启动子的克隆及荧光素酶报告基因载体的构建
【 中图分类号 】 Ｑ ７ ８ ２ ； Ｑ ７ ［ 文章编号 】 ２ ０ ９ ５ — ０ ６ １ ６（ ２ ０ １ ３） １ １ — ３ ０ — ０ ３
【 Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ 】Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｌ ｕ ｃ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｓ ｅ ｒ ｅ ｐ ｏ ｒ ｔ ｇ ｅ ｎ ｅ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｆ ｏ ｒ Ａ ｐ ｏ Ｍ ｇ ｅ ｎ ｅ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ ｏ ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｄ ｅ
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荧光素酶报告基因原理
荧光素酶报告基因原理
荧光素酶报告基因（luciferase reporter gene）是一种常用的实验方法，用于研究基因调控和蛋白质相互作用以及药物筛选等领域。
其基本原理是将荧光素酶基因与感兴趣的基因或启动子区域相连，通过检测荧光素酶的活性来间接测量目标基因的表达或调控程度。
在荧光素酶研究中，荧光素（luciferin）是一种特殊的底物，能够被荧光素酶氧化反应催化转化为活性光。
这个催化反应一般需要辅助因子如氧气和三磷酸腺苷（ATP）。
当荧光素酶基因与感兴趣的基因相连接后，如果目标基因或启动子区域活性较高，则荧光素酶的表达水平也会增加，导致活性光的释放增强。
为了测量活性光的强弱，一般使用荧光素酶底物——荧光素酯（luciferin ester）。
在实验中，细胞或组织被溶解至含有荧光素酯底物的缓冲液中，荧光素酯与荧光素酶催化生成活性光，并且这个发光反应是非常强的。
这时，可以借助荧光素酶酶标仪或荧光成像系统来测量产生的荧光信号强度，从而间接反映出目标基因的表达水平。
通过荧光素酶报告基因的应用，研究人员可以实时、定量地分析靶基因的表达及其调控，在生物学、医学以及药物研发等领域具有广泛的应用价值。
荧光素酶报告基因实验
荧光素酶报告基因实验在现代生物学研究中，荧光素酶报告基因实验被广泛应用于基因表达分析、蛋白质定位及信号转导等领域。
该实验通过将荧光素酶作为报告基因与感兴趣的基因或蛋白质进行连接，从而达到检测和定量基因表达的目的。
本文将探讨荧光素酶报告基因实验的原理、应用以及一些注意事项。
一、实验原理荧光素酶（Luciferase）是一种源自萤火虫的酶类蛋白质，能催化荧光素（Luciferin）与氧气发生化学反应，产生可见光。
实验中，荧光素酶基因被连接到感兴趣的基因或启动子区域，形成荧光素酶报告基因。
当目标基因被转录和翻译时，荧光素酶也会被表达出来。
加入荧光素底物后，荧光素酶与荧光素底物发生催化反应，产生可见的荧光信号，从而可以定量目标基因的表达水平。
二、实验应用荧光素酶报告基因实验具有许多应用领域。
首先，它可用于检测基因的转录水平。
通过连接荧光素酶基因到感兴趣的基因或启动子上，研究人员可以观察到目标基因的表达情况，并通过荧光强度来定量其转录水平。
其次，该实验也可以用于研究蛋白质的定位。
将荧光素酶与目标蛋白质结合，可以观察到蛋白质在细胞中的定位情况和分布模式。
此外，荧光素酶报告基因实验还可以被应用于研究信号转导通路。
通过连接不同的响应元件到荧光素酶基因上，研究人员可以观察到不同信号分子的活化程度，从而揭示信号转导通路的调控机制。
三、实验注意事项在进行荧光素酶报告基因实验时，有一些注意事项需要谨记。
首先，合适的正常对照是必须的。
通过设置对照组或添加阻遏剂等，可以排除实验误差或非特异性荧光造成的干扰。
其次，要注意荧光素的浓度和反应时间的选择。
不同基因和反应体系需要不同的条件来达到最佳的荧光强度。
此外，要注意实验的设计和统计分析。
合理的实验设计和统计方法能够提高实验的灵敏度和可靠性。
在进行荧光素酶报告基因实验时，还要注意避免光和盐酸等强酸碱对荧光素的影响。
同时，实验仪器和试剂的选用也需要慎重。
优质的试剂和仪器可以提高实验的准确性和重复性，从而得到可靠的实验结果。
猪RELMβ基因启动子区克隆及序列分析
猪RELMβ基因启动子区克隆及序列分析陈哲;雷明明;于建宁;王公金;施振旦【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2015(000)005【摘要】本研究旨在分析猪RELMβ基因启动子结构，初步探索RELMβ基因表达调控机制。
通过PCR方法扩增RELMβ基因的系列启动子缺失片段并分别克隆到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Enhancer中，经酶切、测序和生物信息学分析，构建包含RELMβ启动子系列截短的荧光素酶报告基因重组质粒，脂质体转染至HT29和293T细胞，应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子活性。
试验获得了猪RELMβ基因约1 kb的启动子序列，序列比对发现猪和人物种间相似性仅34.9%，猪和小鼠的同源性是82.4%。
生物信息学分析预测猪RE LMβ基因转录起始位点在-556 bp处，猪和人RELMβ基因启动子存在系列保守的转录因子结合位点，包括Cdx2、SRY、NFKB、NKX-2、c-Myb、GATA-1、GATA-3、C/EBP、MZF1等。
细胞检测结果显示， pGL-RELMβ(-574~+215)活性最强，推测在-574~-182 bp位点之间存在RELMβ基因启动子的关键顺式调控元件，这一区域发现SRY、Cdx2、GATA-1和MZF1等关键转录因子结合位点。
【总页数】5页(P1060-1064)【作者】陈哲;雷明明;于建宁;王公金;施振旦【作者单位】江苏省农业科学院畜牧研究所，动物品种改良与繁育重点实验室，江苏南京210014;江苏省农业科学院畜牧研究所，动物品种改良与繁育重点实验室，江苏南京 210014;江苏省农业科学院畜牧研究所，动物品种改良与繁育重点实验室，江苏南京 210014;江苏省农业科学院畜牧研究所，动物品种改良与繁育重点实验室，江苏南京 210014;江苏省农业科学院畜牧研究所，动物品种改良与繁育重点实验室，江苏南京 210014【正文语种】中文【中图分类】S828【相关文献】1.猪SelS基因启动子区的克隆及序列分析 [J], 张宁波;井文倩;李奎2.猪SP-A基因启动子区的克隆与序列分析 [J], 陈书明;晋大鹏;王立贤;张龙超;颜华;程笃学3.蒙古羊GDF11基因启动子区克隆及序列分析 [J], 何小龙;李蓓;刘永斌;王峰;田春英;荣威恒4.绵羊甘露聚糖结合凝集素基因启动子区的克隆与序列分析 [J], 余鹏;王遵宝;吴洪宾;班谦;赵宗胜5.长白猪甘露聚糖结合凝集素-C基因启动子区的克隆与序列分析 [J], 楼柏丹;周明;满朝来;王洋;刘玉芬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
CYP7A1基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体构建
CYP7A1基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体构建CYP7A1基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体构建张照研1,2，王宇光2，高月1,2【摘要】［摘要］目的：克隆细胞色素P450 7A1（CYP7A1）基因启动子，构建以CYP7A1基因启动子为启动序列的双萤光素酶报告基因系统并分析其活性，为研究CYP7A1基因转录调控提供有效筛选工具。
方法：采用PCR方法克隆CYP7A1基因启动子序列，连接到pUC57载体中，双酶切后连接至萤光素酶报告质粒pGL3-Basic上，构建重组萤光素酶报告质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc。
结果：重组质粒经双酶切和测序，证实构建正确；pGL3-CYP7A1-promoter-luc质粒2、3转染HepG2细胞均具有显著性启动子活性，pGL3-CYP7A1-promoter-luc2转染24和48 h后经检测分别为对照组（pGL3-basic空载体）的13.1±2.8倍（P＜0.001）和23.3±2.9倍（P＜0.001）；pGL3-CYP7A1-promoter-luc3转染24、48 h后，荧光响应值分别是对照组的8.4±1.6倍（P＜0.001）和22.1±1.9倍（P＜0.01），呈现强启动子活性。
结论：构建了CYP7A1基因启动子萤光素酶报告基因重组质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc，为后续深入研究药物对其调控作用机制奠定了基础。
【期刊名称】生物技术通讯【年(卷),期】2018(029)005【总页数】6【关键词】［关键词］细胞色素P450 7A1（CYP7A1）；报告基因法；载体构建基金项目：国家重大科技专项（2015ZX09501004-003-003）；中医药行业科研专项（201507004）。
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• 基因表达的必要条件
应用原理简述如下：
（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶 表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。 （2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共 转染实验需要的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启 动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与 转录因子的作用强度成正比。 （3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应， 产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活 性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
质粒共转染
Luciferase assay
裂解细胞，添加buffer以及底物荧光素
底物过剩的情况下，转录 因子的作用越强，荧光素 酶表达量越高，萤光越亮。
Promega双萤光素酶检测试剂盒操作步骤：
1.制备细胞裂解液：加入足够的1X裂解缓冲液（室温平衡）以覆盖 细胞（如：六孔板加200ul） a.对于贴壁细胞，在吸尽细胞培养液后可以直接加入报告基因细 胞裂解液。 b.晃动培养皿数次以保证裂解缓冲液完全覆盖细胞。将细胞从培 养皿刮下。将细胞及所有的液体转移至一个离心管中。将离心管 置于冰上。 旋涡震荡离心管5-10 秒钟，然后以 12,000 x g 离心 15 秒钟（室温）或长至2 分钟（4℃）。将上清液转移至一个新 的试管中。 2.融解荧光素酶检测试剂，并达到室温。 3.按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测 定时间设为10秒。 4.每个样品测定时，取细胞裂解液20ul，加入100ul荧光素酶检测试 剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。 以报告基因细胞裂解液为空白对照。 5.归一化=RLU萤火虫荧光素酶/RLU海肾荧光素酶
报告基因的特点： 1. 全序列已测定和已被克隆； 2. 表达产物在受体细胞中无内源表达； 3. 其表达产物能进行定量测定。 转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功 能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因 子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的 序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和 顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑 制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异 顺序结合的重要手段。
启动子克隆与荧光素酶报告 基因分析
2015-01-17 HZ-CRC 主讲：郑琳
启动子
实验原理
启动子定义：RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。 启 动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录） 的起始时间和表达的程度。
荧光素酶报告基因
Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测 萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光 素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的 过程中，会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪也称化 学发光仪(luminometer) 测定luciferin氧化过程中释放的生物 荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、 高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子 区DNA相互作用的一种检测方法。
• 荧光素酶报告基因的表达
Aபைடு நூலகம்P+O2+
AMP+
+
技术流程：
（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因 子结合位点。 （2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动 子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3basic）中。 （3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。 （4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载 质粒对照，提纯备用。 （5） 培养目的细胞，并接种于24孔板中，生长10-24小时 （80%汇合度）。 （6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。 （7）裂解细胞并用于荧光素酶检测。 （8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。 （9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。