荧光微球标记抗体制备的详细步骤及问题分析

荧光微球标记抗体方法及问题分析

很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。本人总结了部分胶乳微球标记技术相关主题帖，并加以分类，以便朋友们查阅，希望朋友们继续完善或分享经验。

1. 胶乳大小选择

【求助】免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径

免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径- 丁香园论坛

【求助】乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体

乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体- 丁香园论坛

2. 胶乳标记方法

【交流】蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上

蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上- 丁香园论坛

（求助）胶乳标记

（求助）胶乳标记- 丁香园论坛

【求助】抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值

抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值- 丁香园论坛

3. 胶乳标记过程问题

【求助】胶乳偶联出现絮凝

胶乳增强免疫比浊试剂稳定性问题- 丁香园论坛

【求助】胶乳增强免疫比浊中抗体交联的问题

胶乳微球物理吸附

反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。

带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。醛

基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。

反应步骤：

1. 用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml；

2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到1%；

3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。室温搅拌孵育2hr；

4. 离心或超滤，除去未结合蛋白；

5. 将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。

注意事项：

1. 最优蛋白标记量影响因素

1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加；

2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用；

3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。

2. 胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白，

3. 储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能；

4. 表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。

微球共价结合抗体方法

一、一步法

1. 准备50mM pH 6.0的reaction buffer，醋酸或MES buffer更合适

2. 用reaction buffer溶解抗体，使其浓度为1mg/mL。

3. 用reaction buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v

4. 边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟

5. 准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前准备，现配现用。

6. 将计算需求量的EDC溶液加入到上述微球悬液中。(Note 6).

7. 室温下，立即调节pH (Note 7).

8. 移除未结合的蛋白，并将包被微球用storage buffer重悬。(Note 3 and 4)

B. 两步法

为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适。两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。两步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面和加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。

B1 简单一步法：

1. 准备50mM pH 6.0的活化buffer，醋酸或MES buffer更合适；用活化buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v

2. 每ml微球悬液加入20mg的EDC，室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20分钟。(Note 7).

3. 离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球，最后悬浮在包被缓冲液中。(Note 3).

4. 用包被缓冲液溶解抗体到1mg/mL，包被缓冲液pH7~9，浓度为50mM~100mM。(Note 1)

5. 将抗体快速加入的搅拌中的微球悬液中，持续搅拌，室温孵育2~5小时。(Note 2).

6. 每ml反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌并室温孵育10分钟。(Note 9).

7. 离心或超滤，用储存缓冲液悬浮，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺。(Note 3 and 4)

B2. NHS中间活化酯两步法

在此方法中，在EDAC存在下，NHS通过与微球上的羧基反应形成中间活化酯。活化酯比EDC更稳定，不易水解。

1. 每ml反应混合物加入以下成分：

加入DIW，定容最终体积为1ml；

0.1ml 10X的MES buffer，ph6.0~6.5（10X的buffer通常用0.5M）；

0.1ml 10%的微球(终浓度为1%)；

0.23ml NHS水溶液（50mg/mL）; 11.5mg

一定体积的19.2mg/ml(100mM)的EDAC水溶液；

2. 室温下搅拌反应15~30min；（Note7）

3. 清洗：MES buffer或DIW清洗两次；（Note3）；

4. 用DIW冲悬浮微球到浓度为1%；

5. 同时，用包被buffer溶解稀释抗体。buffer一般为ph7~9，50mM~100mM。最终的蛋白浓度1mg/mL;

6. 清洗完微球后，立即加入一定体积的抗体溶液。（Note 2）。（注意：此处给出的例子，微球浓度和蛋白浓度和buffer分别为0.5%（w/v），0.5mg/mL，25~50mM）;

7. 室温下搅拌孵育2hr；

8. 每ml反应液中加入2.5ml 乙醇胺，室温搅拌孵育10~30min；

9. 清洗：storage buffer清洗两次。（Note 3/4）

NOTES:

1. reaction buffer的组成根据蛋白种类的不同而改变，常用buffer有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液。蛋白在等电点附近更易于吸附到微球上，因为在等电点附近，蛋白表面会有更多的疏水位点暴露出来。在这种情况下，抗体也更紧密，因此需要更多的抗体用于标记到微球上。然而，最终reaction buffer的选择，需要考虑最终抗体微球复合物的生物活性，因此，几个不同浓度的抗体和不同pH的反应buffer应该进行优化选择。起始实验，反应buffer的离子强度应该在25~50mM。

2. 蛋白溶液应该在快速的搅拌下，快速加入到微球悬液中。小体积的话，可以进行斡旋混合。当大体积时，应该在烧瓶或烧杯里搅拌剧烈些，蛋白溶液快速加入到漩涡中间。

3. 移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散。离心力不宜过大，这样会导致微球不易分散。也可以用超滤或透析来纯化。当用超滤时，滤膜孔径应该足够大，使得游离的蛋白能自由的通过滤膜。用于清洗微球的buffer应该和storage buffer一样。用于清洗的buffer的任何缓冲液成分及pH的改变，都会引起蛋白的脱落。

4. 微球包被抗体后，加入表面活性剂或者去污活性成分，可能会导致抗体脱落。如果是共价结合到微球上，共价结合的抗体就不会有脱落现象发生。封闭蛋白，像BSA，casein 或gelatin可以用来封阻任何空余的疏水性位点，防止微球发生非特异性凝集。但是表面活性剂可以将那些共价结合不牢固的抗体洗脱下来。

5. 此试剂和水反应，因此，溶解后应立刻使用掉。

6. EDC的用量，根据微球表面羧基浓度来计算。根据计算所需量，每mol的羧基应该再多