实验8酶的分离纯化
酶的分离提纯实验原理
酶的分离提纯实验原理酶的分离提纯是指从复杂的混合物中获得纯净的酶样品的过程。
此过程旨在去除其他杂质，并提高酶的比活性和纯度。
酶的分离提纯实验原理可以分为以下几个方面：1. 根据酶的生理特性进行分离：酶的分离可依据酶对pH值、温度、离子浓度、底物特异性等因素的敏感性进行。
常用分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、电泳等。
2. 分离的物理性质利用：酶可根据其分子大小、电荷、溶解度等物理性质进行分离。
例如，凝胶过滤层析通过选用合适的孔径筛选凝胶，使大分子酶无法进入凝胶孔隙，进而实现分离。
3. 分离的化学性质利用：酶可通过与其他物质的特异性相互作用来实现分离。
亲和层析是一种常用的方法，利用酶与某些配体（如某种金属离子、亲合剂等）的特异性结合来分离酶。
在实验中，通常采用以下步骤进行酶的分离提纯：1. 细胞破碎：从生物体中获得酶源，如细胞、组织、分泌物等。
通常使用超声波破碎、搅拌破碎、离心等方法破碎细胞，并保持样品低温以防止酶的失活。
2. 酶提取：将破碎的细胞溶液用适当的缓冲液进行提取，并添加必要的辅助物质（如阻聚剂、金属离子等）以保持酶的稳定和活性。
3. 初步分离：通常先进行粗提，包括沉淀、超滤、离心、酒精沉淀等方法，目的是将酶与其他细胞组分分离开来。
4. 层析：根据酶的物理性质或化学性质选择适当的层析方法。
离子交换层析是常用的方法之一，根据酶与离子交换基质之间的相互作用进行分离。
5. 亲和层析：利用酶与特定配体之间的结合进行分离。
例如，选择性地将酶与亲和基质（如亲和剂或金属离子）结合，然后利用特定条件（如改变pH值或添加竞争性配体）来解离酶。
6. 离心和浓缩：通过离心和浓缩等操作，将目标酶进一步分离和提纯。
7. 再结晶：通过结晶或沉淀等方法进行酶的最终纯化。
8. 活性测定和纯度检验：测定酶的比活性，评估酶的纯度和活性。
总之，酶的分离提纯实验原理基于酶对物理、化学条件的敏感性，通过适当的分离方法和步骤，去除杂质，提高酶的纯度和比活性。
酶的分离纯化
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五、抗体酶
五、抗体酶 （abzyme） ） 抗体酶本质上是免疫球蛋白， 抗体酶本质上是免疫球蛋白，但在易变区被赋予了 免疫球蛋白 酶的属性，所以又称“催化性抗体” 酶的属性，所以又称“催化性抗体”（catalytic antibody）。 ）。 抗原： 抗原：
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二、调节酶
• 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 • 调节酶分子中有活性区和调节区，其催化活力 调节酶分子中有活性区 调节区， 活性区和
可因与调节剂的结合而改变， 可因与调节剂的结合而改变，有调节代谢反应 的功能。 的功能。
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三、酶的纯度鉴定
酶产品质量评价中常使用比活力， 酶产品质量评价中常使用比活力， 比活力越高，纯度越高。 比活力越高，纯度越高。
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第七节 一些酶的名称及概念介绍
寡聚酶( ) 一 寡聚酶(oligoenzyme)
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 非催化部位 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 进而改变酶的活性状态， 进而改变酶的活性状态，这种现象称为别 构调节作用。 构调节作用。
别构激活作用 别构抑制作用
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三、同工酶
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酶的分离纯化及活性测定
第五节酶的分离、纯化及活性测定1一、酶的分离、纯化•:一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用胞外酶生然后分到行作的酶，这类酶大多都是水解酶类。
•胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用的，这类酶数量较多。
的多2一般原则：般原则：防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中避免剧烈搅拌 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈的烈”的手段。
3酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。
在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一第，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)。
4基本操作程序微生物、动物、选材植物加入提取液抽提胞内酶先破碎抽提先净化处理再沉淀法分离离子交析分离纯化换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等5（一）酶的抽提（）酶的抽提1、破碎细胞对于细胞外酶可用水缓冲液浸泡过对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得粗抽提液。
对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎，通常用匀浆器捣碎机，制成较易破碎，通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提液。
细菌细胞壁较厚，需用超声波、溶胞壁较声溶菌酶等抽提。
酶等提62、酶的抽提酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。
抽提条件：提出来抽提条件⑴抽提溶的pH选择应该在酶的pH稳定，并离范围之内，并且最好远离等电点。
低温下抽提⑵低温下抽提（0～40C）7（二）酶的纯化（）酶的纯化抽提液中除含有所需有酶外，还含有其它大抽提液中除含有所需有酶外还含有其它大分子物质。
常用分离纯化的方法：①溶解度②电荷性质③大小或质量④亲和部位。
分离纯化一种酶的方法
分离纯化一种酶的方法分离纯化一种酶是生物工程领域的一个重要研究课题，有多种方法可以用来实现这一目标。
下面将介绍几种常用的分离纯化酶的方法。
1.固定相吸附色谱法固定相吸附色谱法是最常用的酶纯化方法之一。
在这种方法中，通过对酶进行吸附，然后使用缓冲溶液洗脱的方式分离纯化酶。
为了实现这一目标，可以选择一种适合酶吸附的固定相，例如亲和树脂、离子交换树脂或凝胶等。
通过在不同的条件下洗脱，可以逐步去除非目标蛋白质，最终得到纯化的酶。
2.亲和层析法亲和层析法是常用的可以选择性地与酶相互作用的方法。
在亲和层析法中，可以通过与酶相互作用的特定亲和剂将酶从复杂混合物中分离出来。
例如，可以根据酶与金属离子的亲和性，使用金属离子柱进行层析。
亲和层析法通常需要先对亲和剂进行固定，然后通过加载样品和适当的洗脱剂来纯化酶。
3.凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于酶的大小差异来分离纯化的方法。
这是一种较为简单的方法，适用于分离不同分子量的酶。
在凝胶过滤法中，通过将混合物通过一系列的凝胶分离层来分离不同大小的分子。
酶分子会在凝胶中被阻止，而较小的分子可以通过凝胶透析孔隙。
通过控制凝胶的孔隙大小，可以选择性地纯化酶。
4.电泳法电泳法是一种常用的酶分离纯化方法，尤其适用于具有不同电荷的酶。
在电泳法中，通过在电场中施加电压，根据不同酶的迁移速度将酶分离出来。
根据酶的等电点和电荷性质，可以选择凝胶电泳或者等电聚焦电泳来分离纯化酶。
电泳法的一个重要应用是SDS-PAGE，它从凝胶中获得酶的纯化和分析。
5.超滤法超滤法是一种可以根据酶的分子量选择性地分离纯化酶的方法。
在超滤法中，通过将混合物通过一系列合适孔径的滤膜，可以将酶与其他较小分子分离开来。
较大分子（包括酶）会被限制在滤膜上方，而较小分子则可以通过滤膜，从而实现分离纯化酶的目的。
综上所述，分离纯化酶的方法有很多种。
选择适用的方法取决于酶的性质、目标和需求。
常用的方法包括固定相吸附色谱法、亲和层析法、凝胶过滤法、电泳法和超滤法。
酶的分离与纯化注意事项
在酶的分离纯化过程中为什么进行酶活力及酶比活力测定
1、防止酶变性失活。一旦活力明显下降，就要考虑换一种纯 化方法；
2、计算纯化效率。通过总活力和比活，评估纯化效率，寻找 最佳方法。
酶都能溶解于水通常可用酶都能溶解于水通常可用水或稀酸水或稀酸??酶都能溶解于水通常可用酶都能溶解于水通常可用水或稀酸稀碱稀盐溶液等进行水或稀酸稀碱稀盐溶液等进行提取提取有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团则可用有有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团则可用有机溶剂提取
酶的分离与纯化注意事项及酶分离纯化 为什么进行酶活力和酶比活力测定
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱 层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶 的进一步精制纯化，可用 制备式电泳 或 HPLC。
本章 目录
酶的提取：
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶 原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。 一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非 极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易 溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行 提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有 机溶剂提取。
在酶的提取过程中，为了提高提取率并防止酶变性 失活，须注意以下几点：
1．温度： 通常抽提温度应控制在0-10oC（0-4 oC）。对某些耐温的酶，如胃蛋 白酶等，可适当提高抽提温度，在37 oC下保温抽提，效果较好。因 为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提 取。 2.试剂 接着要注意的就是避免使用一些会造成酶变性的试剂，比如说重金属 盐，有机试剂。严格意义上来说，要提取活性酶，任何可能使蛋白质 沉淀的试剂和方法都要避免使用。最好就是直接在液体环境下进行， 比较理想的方法就是色谱柱层析。然后，实际上为了防止蛋白质在提 取过程中被释放的内源性蛋白酶（木瓜蛋白酶，枯草蛋白酶等等）降 解蛋白质，还需要在提取环境中加入适当的蛋白酶抑制剂。
酶分离纯化的步骤主要原理
酶分离纯化的步骤主要原理
酶的纯化和分离是通过一系列步骤实现的，其主要原理包括以下几点：
1. 细胞破碎：首先需要将含有酶的细胞破碎，以释放酶分子。
这可以通过物理方法（如超声波或搅拌）或化学方法（如溶解细胞膜）实现。
2. 酶的特异性沉淀：根据酶的特性和条件，选择适当的方法使酶与其他杂质分子分离。
常用的方法包括沉淀、沉降和离心。
例如，可以通过加入特定的沉淀剂或改变pH值来使酶沉淀，从而将其与其他溶液中的物质分离。
3. 过滤和超滤：利用不同孔径的滤膜，可以通过过滤和超滤方法去除较大分子，如蛋白质碎片和细胞残渣。
4. 离子交换层析：离子交换层析是利用酶与离子交换树脂之间的相互作用进行分离的方法。
树脂上的离子可吸附酶，而其他杂质则被洗脱。
5. 亲和层析：亲和层析是通过酶与特定配体之间的亲和力实现分离的方法。
配体可以是酶的底物、抗体或其他具有与酶特异性结合的小分子。
酶与配体结合后，可以用洗脱剂将酶从亲和层析柱上洗脱。
6. 凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是根据酶的分子大小和形状实现分离的方法。
通过选择合适孔径的凝胶、调节操作条件，可以将酶与其他分子分开。
7. 高效液相层析：高效液相层析（HPLC）是一种高效的液相分离技术。
通过调节流动相和固定相的性质，利用酶与固定相之间的相互作用进行分离。
8. 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法，通过电泳平台上的电场作用下，根据酶的电荷、形状和大小进行分离。
以上步骤和原理可以根据酶的特性和所需纯度的要求进行组合和调整，以实现酶的有效纯化和分离。
酶的生产与分离纯化
重要
（3） 碳氮比 在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是
随生产的酶类、生产菌株的性质和培养阶段的 不同而改变的。 一般蛋白酶 (包括酸性、中性和碱性蛋白酶) 生 产采用碳氮比低的培养基比较有利，例如黑曲 霉3.350酸性蛋白酶生产采用由豆饼粉3.75 %、 玉 米 粉 0.625% 、 鱼 粉 0.625% 。 NH4Cl 1% 、 CaCl2 0.5%、Na2HP04 0.2%、豆饼石灰水解液 10%组成的培养基；
2.2.2.3 液体深层发酵的工艺控制
酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌种产酶性能的影响外，还 受到发酵温度、pH、溶氧量等条件的影响。
(1) 温度对产酶的影响 发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅
拌速度的变化而变化的。微生物在生长发育中，不断地吸收 培养基营养成分来合成菌体的细胞物质和酶时的生化反应都 是吸热反应；培养基中的营养物质被大量分解时的生化反应 都是放热反应。发酵初期合成反应吸收的热量大于分解反应 放出的热量，发酵液需要升温。当菌体繁殖旺盛时，情况则 相反，发酵液温度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量， 这时，发酵液必须降温，以保持微生物生长繁殖和产酶所需 的适宜温度。
重要
不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据 要求进行选择和配制。一般来说，动物细胞要求 有机氮，植物细胞主要要求无机氮。多数情况下 将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的 效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或 硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的30%。只 用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般 除使用高浓度有机氮源外尚需添加1%用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育
菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍微 生物发酵法产酶的一般原理和工艺。
酶的分离 纯化
（2-4）
若酶的总浓度用[E]t表示，那么 [E]= [E]t－[ES]，代入式（2-4）并整理得
（2-5）
由于酶的反应速度与[ES]成正比，所以
V = k3 [ES] 将（2-5）代入（2-6），得
（2-6）
（2-7）
第一节 酶促反应动力学
当底物浓度很高时，所有酶都与底物结合生成中间产物ES，则[E]t=[ES]。此时 反应速度达到最大Vmax，即
整理上式可得 Km= [S] 由此可以看出，Km的物理意义就是当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的 底物浓度，其单位与物质摩尔浓度单位相同，用mol/L表示。Km数值大小与酶的浓 度无关，是酶反应的特性常数。不同酶的Km值不同，且同一酶在不同的底物下，其 Km值也不同。米氏常数可由实验测得，也可用下面的公式求得：
Vmax= k3 [ES]= k3[E]t
（2-8）
（2-7）除以（2-8），并整理得
（2-9）
这就是米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation），又称为米氏方程，式中的 Km是一常数值，称为米氏常数。在特殊情况下，当v = Vmax时，米氏方程可转化为下 式：
第一节 酶促反应动力学
第三章 酶的分离纯化
酶分离纯化的目的
酶分离纯化的目的是使酶制剂 产品达到应用所需的纯度。
分离纯化过程包括3个基本步骤：
1 抽提 2 纯化 3 制剂
Crude product concentration versus selling price (Dwyer, 1984)
第一节 酶促反应动力学
对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下，反应速度（v）直接 与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下，速度趋向于最大值（Vmax），此时反应速 度与底物浓度[S]无关（如图2-1）。
实验8-酶的分离纯化
酶促反应速度的测定与酶的活力单位
1、测定酶促反应的速度必需测初速度 2、酶活力
构体进行反应，或其催化的结果只产生一种立体异
构体，酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异
性（stereospecificity）。
L-乳酸
D-乳酸
H
H
C
C
OH
COOH
H3C
COOH H3C
OH
A BC
A BC
乳酸脱氢酶
图5-11 乳酸脱氢酶的立体异构特异性
目录
主要内容
➢ 单底物酶处反应动力学 ➢ 酶的分离纯化
[S]/v对[S]作图，[S]未取倒数。另两个线性作图 法，v未取倒数。前者对等距离 [S]增值所测数据 作图较双倒数法更优越。后者在低底物浓度下 测定误差较大时使用，比其它方法更可靠。
三、Eisenthal-Cornish-Bowden作图法
这是根据米氏方程的性质而提出的一种直接作图法。该 法是把[S]值标在横轴的负半轴上，而把测得的v值标在 纵轴上，然后把相应的v和[S]连成直线，这样所得的一 簇直线交于一点，该交点坐标为Km和Vmax。
k1
ES
[ES]生成速度：v 1 k 1 E t ES S ，[ES]分解速度：v 2 k 1 E S k 2 ES
米
当酶反应体系处于恒态时： v1 v2
氏 方 程 的 推 导
即： k 1 E t E S S k 1 E k 2 S E S EtSE E SSSk1k 1k2
酶的分离纯化
第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。
一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。
一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。
常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。
二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。
2. 抽提3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。
物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。
即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。
实验8-1红曲霉的分离纯化
实验8-1 红曲霉的分离纯化一、实验目的熟悉红曲霉菌种的分离纯化方法。
二、实验原理红曲霉广泛分布于自然界，因此可以从自然界中分离纯化得到。
鉴于我国劳动人民很早就开始利用红曲，他们将红曲霉制成了各种各样的发酵食品，因此，要得到红曲霉菌种，最简便的办法是直接从这些发酵食品中去分离。
培养红曲霉多用麦芽汁琼脂培养基，红曲霉在该培养基上生长良好，菌落较大，培养初期菌落为白色，老熟后变为淡红色、紫红色、橙红色、烟灰色等，因种而异。
菌落有呈绒毡状的，也有呈皮膜状的，呈皮膜状的菌落少褶皱或只有辐射纹。
红曲霉在马铃薯培养基（PDA）上呈现局限性生长，而不像在麦芽汁琼脂上那样蔓延。
某些种能在PDA培养基上形成疮疤状菌落。
红曲霉产生的是水溶性红色色素，能分泌到培养基中，使培养基着色。
三、实验器材与试剂1. 样品市售红曲米或红曲酒酒药。
2. 培养基（1）半合成培养基：葡萄糖30g，NaNO3 3 g，酵母提取物1 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，pH5.6，用蒸馏水定容至1 L。
固体培养基添加20 g琼脂；（2）麦芽汁培养基：5～8。
P麦芽汁；（3）豆芽汁培养基：豆芽200 g，加水1000 mL，煮沸10 min后过滤，滤液加2％葡萄糖即成，固体培养基添加2％琼脂。
3. 器材水浴锅、培养箱、灭菌锅、培养皿、移液管、试管等。
四、实验步骤1. 实验准备配制上述半合成固体培养基（或麦芽汁培养基、豆芽汁培养基），高压蒸汽灭菌；准备无菌水，移液管、培养皿等，灭菌备用；实验前将培养基倒入平皿中，冷却凝固后于30 ℃培养箱中放置5～6 h，以烘去冷凝水。
2. 红曲霉的分离纯化称取红曲米5 g，放入45 mL无菌水中，振荡摇匀后置于60 ℃水浴中保温30 min以杀死不耐热的细菌及酵母，将上层孢子悬液用稀释涂平板法分离，30℃培养5 d，挑取能产红曲色素的霉菌单菌落，用显微镜检查是否纯种（细胞形态是否一致），确认后保存。
酶的分离
大多数蛋白类酶都溶 于水，而且在低浓度 的盐存在的条件下， 酶的溶解度随盐浓度 的升高而增加，这称 为盐溶现象。
在盐浓度达到某一 界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而 降低，这称为盐析 现象。
举例说明
盐溶液提取
例如，固体发酵生产的麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞 外酶，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液或 0.02~0.05mol/L 的磷酸缓冲液提取；枯草杆菌碱性磷 酸酶用 0.1mol/L 氯化镁溶液提取等。有少数酶，如 霉菌脂肪酶，用清水提取的效果较好。 核酸类酶（R-酶）的提取，一般是在细胞破碎后，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液提取，得到核糖核蛋白提取 液，再进一步与蛋白质等杂质分离，而得到酶 RNA。
沉淀分离方法 分离原理
盐析沉淀 法 等电点沉 淀法 有机溶剂 沉淀法 复合沉淀 法
利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解 度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度 的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀， 从而使酶与杂质分离 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以 及不同的两性电解质有不同的等电点这一特 性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀 析出，从而使酶与杂质分离 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不 同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶 或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合 物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离
三 、离心条件
在离心过程中，应该根据需要，选择好离心 力（或离心速度）和离心时间，并且控制好温 度和 pH 值等条件。
1.
离心力
相对离心力
2、离心时间 3、温度和 pH 值
（三 ） 过滤与膜分离
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形 状的物质分离的技术。 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、 纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等，其中以 各种高分子膜为过滤介质的过滤技术称为膜 分离技术。微滤、超滤、反渗透、透析及电 渗析等都属于膜过滤技术。
酶的提取和分离纯化.pptx
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11.2.1 机械破碎法 • 指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：
• 1.机械捣碎法
• 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。 10000r/min
• 此法在实验室和生产规模均可采用。
• 2.研磨法
• 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压 容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几 分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降， 使细胞破碎。
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压力差破碎法
• （3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 • 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖
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球蛋白溶解度-溶液离子强度关系
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盐析
• 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： • 1).中和蛋白质分子表面电荷 • 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 • 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不
同，因而可以分级沉淀。 • 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋
• 性质
方法
• 分子大小
离心，超离心法、凝胶过滤，
膜分离技术（超滤，反渗透，
微孔过滤，透析，电渗析等）
• 溶解度
法，
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀
选择性沉淀法，结晶
• 电荷或基团
离子交换色谱，电泳，等电聚焦，
吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色 谱
• 稳定性
选择性变性法（热，酸碱，
表面活性剂）
• 特殊（专一性结合）第30亲页/共和13色9页谱，亲和洗脱，亲和电
酶的分离纯化方法
酶的分离纯化方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1酶的分离纯化方法摘要酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
本文从酶原料选择、酶的分离与纯化、酶纯度的评价三个方面进行总结，列举了一些常用的分离纯化方法。
关键词酶、分离纯化、方法、纯度中图分类号O6酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：一是酶一般取自生物细胞，而特定的一种酶在细胞中的含量很少；二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪，前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。
1 酶原料选择提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
但是由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
2 酶的分离纯化由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。
酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。
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H3C
COOH
H3C
A
B
C
A
B
C
乳酸脱氢酶
图5-11 乳酸脱氢酶的立体异构特异性
目录
主要内容
单底物酶处反应动力学 酶的分离纯化
目录
单底物酶促反应动力学
酶动力学是研究酶促反应的速度问题，即研究各种
因素对酶促反应速度的影响。
酶动力学理论与实验在生物化学领域，特别在酶学 研究中，有十分重要的作用。例如，根据某些因素对酶 促反应速度的影响，可推断该酶促反应的机制。又例如， 要准确测定酶活力单位，就需要对最佳反应条件及各种 因素的影响进行研究。 酶促反应有单底物反应和多底物反应之分。单底物 酶促反应包括异构酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反 应。
检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、 浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，
即用酶的活力表示。
酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件 下酶所催化的化学反应的速度来确定。
3、酶活力的表示方法
4、酶活力测定方法：终点法 动力学法
酶活力测定方法
终点法: 酶反应进行到一定时间后终止其反应， 再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。 动力学法:连续测定反应过程中产物\底物或辅酶 的变化量，直接测定出酶反应的初速度。
这样，当[S]为常数时，则初速度v与[Et]成正比。但一个 酶促反应速度，常因[S]的改变而改变。因此反应时间必 须尽可能短，使[S]几乎处于恒态(即只有5％以下的底物 形成产物)，才能得到真正的初速度，v与 [Et]之间的关系 才会是线性的。
二、酶活力单位和比活力
是指酶在一定作用条件下，单位时间内，使底物 转化的量或产物生成的量。也就是说，酶量的多少是 采用其催化能力来度量；换句话说，是采用酶催化反 应的速度来度量，因为在适当的条件下，v∝[E]。 为了使酶单位的文献报道能统一，并具有可比性， 国际酶学会议曾制订了一个标准单位：在特定条件下， 1分钟内能转化1微摩尔底物所需的酶量为一个酶单位。 所谓特定条件，温度定为25℃，pH、底物浓度等其它 条件均定为最适条件。该酶单位称为国际单位〔IU)。 酶制剂中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。 酶的比活力(specific activity)是指每毫克蛋白中所 含的酶单位数，用U/mg蛋白表示。
知识回顾
酶的概念：
酶是生物催化剂，是活细胞合成的
具有高度催化效率和高度特异性的一类 蛋白质。
目录
酶促反应的特点
它遵守一般催化剂的共同性质：
1. 在化学反应前后都没有质和量的改变；
2. 只能促进热力学上允许进行的反应；
3. 只能加速可逆反应的速率，而不能改变反应的平衡点，
即不改变反应的平衡常数。 4. 酶和一般催化剂都是通过降低反应活化能而使反应速 率加快。
各种因素对酶反应速度的影响
1、酶浓度
当S足够过量，其它条件固定且无不利因素时，v=k[E]
2、底物浓度
3、pH
（最适 pH的概念）
4、 温度 （最适温度的概念） 5、激活剂 6、抑制剂
第一节
动力学方程推导
酶反应的基本动力学关系，是指酶反应速度 与酶和底物间的动力学关系。因为酶和底物是 构成酶反应系统最基本的因素，它们决定酶反 应的基本性质、酶反应的速度规律，而其他各 种因素也正是通过它们产生影响的；而且，这 种动力学关系是整个酶反应动力学的基础。 描写这种基本动力学关系的是米氏方程 (Michaelis-Menten equation)。
Vm k2 Et
(4)
将（4）代入（3），则：
v
Vmax S K m S
酶反应速度与底物浓度的关系曲线
V
Vmax
[S] 当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比。
目录
V
Vmax
[S]
随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速。
目录
V
Vmax
[S]
当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度。
酶活力的表示方法
活力单位（active unit）
量度酶催化能力大小
习惯单位（U）: 底物(或产物)变化量 / 单位时间 国际单位（IU）: 1μmoL变化量 / 分钟
Katal（Kat）：1moL变化量 / 秒 比活力（specific activity）
比活力= 总蛋白mg数
总活力单位
量度酶纯度
v = vmax[S] / (Km+[S])
单分子酶促反应的米氏方程及Km
k2 ES E S P E k 1
k1
米氏方程:
Vmax S v K m S
米氏常数:
k 1 k2 Km k1
推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照
“稳态平 衡”假说的设想进行推导。
Lee和Wilson改良双倒数方程对数据的处理
改良的双倒数方程形式与双倒数方程相似，为 其中 是t这一段时间内的平均速度； 为反应过程中底物浓度的算术平均值。 由于积分方程对任何反应程度的数据处理都是准确的
用
可以通过
对比：
处理实验数据的准确性如何，
与
从以上计算可以看出，用改良的双倒数方程作图法 处理实验数据时，即使反应已进行到30％，所引入的误 差也不过1％左右。
1.下图是根据[S]在0.33～2.0Km范围时的实验结果而作 的双倒数图，从此图可准确地测量出-1/Km和1/Vmax等。
[S]在0.33～ 2.0 Km的范 围的实验结 果而作出的 双倒数图。
2.如果所选底物浓度比Km大得多，则所得双倒数图的 直线基本上是水平的。这种情况虽可测得1/Vmax ，但 由于直线斜率近乎零， -1/Km则难以测得。
三、酶的转换数
转换数可用两种方法表示。其一是以分子活性(molecular activity)来定义，即在最适条件下、每摩尔酶每分钟所转 变的底物摩尔数(即每微摩尔酶的酶单位数)。其二是许 多酶为寡聚体。含几个亚基，因此可用另一种方式来表 示转换数，即在最适条件下，每摩尔活性亚基或催化中 心每分钟所转变的底物摩尔数。这两个值有时简单以 min-1表示，即：
[S]/v对[S]作图，[S]未取倒数。另两个线性作图 法，v未取倒数。前者对等距离 [S]增值所测数据 作图较双倒数法更优越。后者在低底物浓度下 测定误差较大时使用，比其它方法更可靠。
三、Eisenthal-Cornish-Bowden作图法
这是根据米氏方程的性质而提出的一种直接作图法。该 法是把[S]值标在横轴的负半轴上，而把测得的v值标在 纵轴上，然后把相应的v和[S]连成直线，这样所得的一 簇直线交于一点，该交点坐标为Km和Vmax。
目录
酶不同于一般催化剂的特点：
（一）酶的催化效率极高 通常比非催化反应高 108 ～ 1012 倍；比一般催化 剂高 107～1013倍。
催化剂 无 胶态钯 过氧化氢酶
每摩尔需活化能 18 000J 11 700J 2 000J
目录
过氧化氢分解反应所需活化能
催化剂 无 胶态钯
每摩尔需活化能 18 000J 11 700J
酶的kp值约在50～107min-1。碳酸酐酶是己知转换数最 高的酶之一(36×106min-1)。1/kp=1.7μsec，即该酶一个 催化周期为1.7微秒。
第五节 酶促反应的稳态前动力学 一、快反应技术
酶促反应动力学研究有两条途径：一是稳态动力学。它 是监测整个反应，得到关于反应的笼统信息。二是稳态 前动力学，它能更直接地研究整个反应中的基本步骤或 部分反应，提供可用于分析复杂反应机制的更有效的数 据，但需要特殊的仪器来测量快反应。所谓快反应，是 相对于普通的混合和观察方法所需要的时间而言。完成 总反应量的一半，即所谓反应半时间，为秒或更短时间， 则属快反应。采用手工混合启动反应，用普通的分光光 度计等仪器所能测量的反应半时间为分和小时。而酶促 反应常常是反应半时间短于一秒的快反应，采用普通方 法是不行的。限制仪器测定能力的主要因素有：混合样 品并充满反应池所需的时间，观察和记录变化所需的
目录
第二节 实验数据的处理 —分析酶促反应速度的作图法
一、Lineweaver-Burk法(双倒数作图法)
将实验所得的一些初速度数据v和[S]取倒数，得各种1/v 和1/ [S]，将1/v对1/ [S]作图，得一直线。该直线纵截距＝ 1/Vmax，斜率＝Km/ Vmax，横截距＝-1/ Km。应用双倒数作图法 处理实验数据求Km和Vmax等动力学常数比较方便，也是最广 泛应用的一种方法，但欲要获得较准确的结果，实验时必须注 意底物浓度范围，一般所选底物浓度需在Km附近。
很明显，如果所有酶是饱和的，而且反应显著不可 逆，而且没有产物抑制的情况，用改良双倒数法处理实 验数据来测定Km和Vmax，可获得准确结果。如有必要， 可用捕获剂或偶联酶使产物不断移去，迫使反应不可逆， 并使产物抑制成为最小。
酶促反应速度的测定与酶的活力单位
1、测定酶促反应的速度必需测初速度 2、酶活力
目录
NH2 O C NH2 尿素 NH CH3 O C NH2 甲基尿素 + H2O
脲酶
2NH3 + CO2
脲酶 + H2O
绝对特异性
目录
相对特异性
蔗糖酶 果糖—葡萄糖 蔗糖 蔗糖酶 果糖—葡萄糖—半乳糖 棉子糖 果糖 + 葡萄糖—半乳糖 蜜二糖 果糖 + 葡萄糖
图5-9 蔗糖酶的水解作用
目录
3．立体异构特异性：一些酶仅能催化一种立体异 构体进行反应，或其催化的结果只产生一种立体异 构体，酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异 性（stereospecificity）。