酶工程 第八章 酶的定向进化 (1)
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2011酶工程 第八章 酶的定向进化
普通筛选方式
常见的96孔板高通量筛选技术
1 平板筛选技术
1）根据细胞生长情况筛选突变基因 热 抗生素 pH 高渗透压 低温 有毒物及抑制剂
OD-Monitor OD值测定传感器
2） 依据颜色变化筛选
颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对硝 基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释放出的 黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。下图显色 底物可检测葡萄糖苷酶。 碱性条件显色pH8 大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一个没 有生色集团的底物的反应，需要将反应产物转变为一 个有色化合物。
Stemmer W P C. , Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 10747- 10751
二 酶稳定性-耐有机溶剂
2001年，Song 和Rhee利用随机突变和重组的方法筛选得到 三株磷脂酶A1 突变体,可以在有机溶剂存在的条件下有效的 发挥作用, 其稳定性和活性都得到较大的提高。 Song J K, Rhee J S. Biochim Biophys Acta , 2001 , (1547) : 370～ 378. Arnold 等用定向进化方法提高P450 BM3对有机溶剂ＤＭＳ Ｏ耐受力提高了６倍，对ＴＨＦ的耐受力提高了１０倍。
基因型
表达型
融合蛋白
PIII
Lead
Hv
Link
Lv
E
PIII
4 酵母细胞表面展示技术
S. cerevisiae 易培养、安全、适用范围广
适用于真核生物蛋白库的构建，有较高的库容量
（ 105 -106 )
展示可溶性蛋白（104 -105 protein copies/cell），
酶的定向进化
2019/11/9
酶分子改造技术的分类 • 一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰，
定点突变等；二是利用基因的可操作性，通过模 拟自然界的演化进程进行非合理化设计方案。
酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计 方式。
2019/11/9
酶分子定向进化的历史
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
2019/11/9
DNA
单一基因
重 组 原 理 图 示
2019/11/9
3.外显子改组技术
• 外显子改组(exonshuffling)类似于DNA改组, • 两者都是在各自含突变的片段间进行交换,
与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分 子间内含子的同源性带动,而DNA改组不受 任何限制,发生在整个基因片段上。外显子 改组更适用于真核生物,并可获得各种大小 的随机肽库。
酶分子的定向进化
2019/11/9
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶分子的定向进化
概念：模仿自然进化过程的人工进化策略。不需要事先了解 蛋白质的结构和作用机制，去获得期望功能或全新功能的蛋 白质或DNA。如从一个靶基因或一群相关家族基因或DNA 开始，用突变或重组等此方 法正在发展中。
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2019/11/9
• 2019年, Ryota等为基因片段重组这一思 想增添ndomInsertional - deletionalStrand
筛选
正突变基因
进化酶
目前酶定向进化的主要策略
• 1.易错PCR 技术 • 是指利用TaqDNA聚合酶不具有3’-5’ 外切酶活力，或改
酶分子改造技术的分类 • 一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰，
定点突变等；二是利用基因的可操作性，通过模 拟自然界的演化进程进行非合理化设计方案。
酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计 方式。
2019/11/9
酶分子定向进化的历史
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
2019/11/9
DNA
单一基因
重 组 原 理 图 示
2019/11/9
3.外显子改组技术
• 外显子改组(exonshuffling)类似于DNA改组, • 两者都是在各自含突变的片段间进行交换,
与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分 子间内含子的同源性带动,而DNA改组不受 任何限制,发生在整个基因片段上。外显子 改组更适用于真核生物,并可获得各种大小 的随机肽库。
酶分子的定向进化
2019/11/9
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶分子的定向进化
概念：模仿自然进化过程的人工进化策略。不需要事先了解 蛋白质的结构和作用机制，去获得期望功能或全新功能的蛋 白质或DNA。如从一个靶基因或一群相关家族基因或DNA 开始，用突变或重组等此方 法正在发展中。
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2019/11/9
• 2019年, Ryota等为基因片段重组这一思 想增添ndomInsertional - deletionalStrand
筛选
正突变基因
进化酶
目前酶定向进化的主要策略
• 1.易错PCR 技术 • 是指利用TaqDNA聚合酶不具有3’-5’ 外切酶活力，或改
第八章酶分子的定向进化概要
张今等为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题 以天冬氨酸为模型通过控制DNA合成的碱基底物 种类和浓度比例实现碱基对的错配，向目的基因 引入突变同时限制突变减少筛选突变体的工作量， 探索了一种称为酶法体外随机、定向改造酶分子 的途径。
9
三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重最早使用的载体系统，在载体本身的设计方面
已经相当成熟。 优点：
插入片段的载容量大，适合于大片段的克隆。 感染效率高、鉴定容易，有较好的质量控制指标。 基因质量高、代表性好，稳定性好，适合长期
▪ 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于 蛋白质的非合理设计。
3
三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
关于外显子在蛋白质进化中的作用有两种观点：
“原生内含子”假说：认为当前所有的蛋白质都 经过外显子改组；
“后生内含子”假说：认为外显子改组仅出现在 真核细胞中，以提高这些生物基因的韧性。
两种假说都承认外显子改组是蛋白质进化的重要 机制，因此人为模拟此自然进化过程定向进化酶 分子将是获得新酶的颇具吸引力的途径。
21
七、突变库的构建及应用（一）构建理想的基因要考虑的因素1.基因的质量
（1）基因的代表性中包含的DNA分子应能完整地反映来源基因
（2）突变基因片段的序列完整性中重组或突变DNA片段应尽可能完整地反映出天然 基因的结构。
9
三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重最早使用的载体系统，在载体本身的设计方面
已经相当成熟。 优点：
插入片段的载容量大，适合于大片段的克隆。 感染效率高、鉴定容易，有较好的质量控制指标。 基因质量高、代表性好，稳定性好，适合长期
▪ 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于 蛋白质的非合理设计。
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三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
关于外显子在蛋白质进化中的作用有两种观点：
“原生内含子”假说：认为当前所有的蛋白质都 经过外显子改组；
“后生内含子”假说：认为外显子改组仅出现在 真核细胞中，以提高这些生物基因的韧性。
两种假说都承认外显子改组是蛋白质进化的重要 机制，因此人为模拟此自然进化过程定向进化酶 分子将是获得新酶的颇具吸引力的途径。
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七、突变库的构建及应用（一）构建理想的基因要考虑的因素1.基因的质量
（1）基因的代表性中包含的DNA分子应能完整地反映来源基因
（2）突变基因片段的序列完整性中重组或突变DNA片段应尽可能完整地反映出天然 基因的结构。
第八章 酶定向进化
其基本操作过程如下 : 靶基因经随机突 变产生含不同突变类型的亲本基因群, 用 DNase I 随机切割; 得到的片段经过不加 引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些 片段之间互为引物和模板进行扩增, 直至 获得全长基因; 再加入基因的两端引物进 行常规PCR, 最终获得发生改组的基因库。
2.1交错延伸重组(Stagger extension process)
图给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图 谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频 率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可 达500-700个； 质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β内酰胺环，从而破坏氨芐青霉素的酶，当用 pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中， 凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就 是都含有pUC19的。
它是由两个相互独立的关键技术组成. 一个是随机基因文 库的构建, 另一个是特定酶( 特别是增加催化活性、增强 选择性或稳定性) 的筛选策略。
第二节 定向进化的方法
一、酶基因的随机突变
1.易错PCR技术 (Error prone PCR)
易错PCR 是指从酶的单一基因出发，通过 改变PCR 的反应条件 , 使碱基在一定程度上 随机错配而引入多点突变, 构建 行全面的筛选。为此要求构建 可能完变基库容量。
所有的质粒载体都有三个 共同的特征：一个复制子、一 个选择性标志和一个克隆位点。 复制子是含有DNA复制起始 位点的一段DNA（ori），也包 括表达由质粒编码的复制必需 的RNA和蛋白质的基因。 选择性标志对于质粒在细 胞内持续存在时必不可少的。 克隆位点是限制性内切酶 切割位点，外源性DNA可由此插 入质粒内，而且并不影响质粒 的复制能力，或为宿主提供选 择性表型。
酶工程 第八章 酶的定向进化 (1)
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酶的定向进化
• 基于序列的理性设计：分子修饰
利用已知酶分子的空间结构、结构和功能之间关系， 以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改造； • 利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：定向进化 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基 因重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因， 并定向筛选出所需突变酶；
• 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ • 提高Mg2+浓度
15
1、易错PCR
• 优点：操作简便，随机突变的定向进化
• 难点：要控制好突变率
16
1、易错PCR
连续易错PCR： 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。
8
酶的定向进化
酶定向进化的概念： 模拟自然进化（随机突变和自然选择） 的过程，在体外进行酶基因的人工随机突 变，并在人工控制条件的特殊环境下进行 定向选择，得到具有优良催化特性的酶的 突变体。所得到的酶称为进化酶。
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酶的定向进化
• 主要过程： 1、随机
DNA 改组 (DNA shuffling)
交错延伸PCR 随机引物体外重组 基因家族重排
12
PCR
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1、易错PCR
• Taq酶不具有3’5’ 方向的 外切酶活性，有一定的错配 几率（5×10-5） • 易错PCR：提高PCR过程 的错配几率
14
1、易错PCR
方法：
• 改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降 至5％-10％），同时加入dITP来代替被减少的 dNTP；
• 基因重组（of chapter 8
8.1进化的应用
34
酶工程5 第八章_酶定向进化
1992年Gram H．等用噬菌体呈现技术体外筛选抗体时，用易错PCR 向抗体的重链可变区和轻链可变区引入突变。
Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，
他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐 渐增加头孢氨00倍的突变体。
酶工程5 第八章_酶定向进化
主要内容
第一节 酶定向进化介绍 第二节 酶基因体外随机突变 第三节 酶突变基因的定向选择 第四节 酶分子定向进化的应用
2/169
第一节 酶定向进化介绍
3/169
获得具有新功能和特性的酶的途径 (1) 从大量未知的生物种系中寻找
(2) 改造现有已知的酶。
4/169
22/169
定向进化研究的历史
1 萌芽阶段
首先在分子水平上进行改造单一分子的是Sol Spiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体 Q进行的试验, 证明达尔文的自然选择也可在非细 胞体进行.
23/169
2 奠基阶段
1981年，Hall B G等报道了他们定向改变了大肠杆 菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对 几种糖苷键有水解能力的酶。
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得 以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所 有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样 说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养 基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳 糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。
Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，
他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐 渐增加头孢氨00倍的突变体。
酶工程5 第八章_酶定向进化
主要内容
第一节 酶定向进化介绍 第二节 酶基因体外随机突变 第三节 酶突变基因的定向选择 第四节 酶分子定向进化的应用
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第一节 酶定向进化介绍
3/169
获得具有新功能和特性的酶的途径 (1) 从大量未知的生物种系中寻找
(2) 改造现有已知的酶。
4/169
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定向进化研究的历史
1 萌芽阶段
首先在分子水平上进行改造单一分子的是Sol Spiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体 Q进行的试验, 证明达尔文的自然选择也可在非细 胞体进行.
23/169
2 奠基阶段
1981年，Hall B G等报道了他们定向改变了大肠杆 菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对 几种糖苷键有水解能力的酶。
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得 以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所 有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样 说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养 基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳 糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。
酶定向进化
基因家族重排技术改组效果
第三节 酶突变基因的定向选择
• 在人工控制条件的特殊环境下，按照人们
所设定的进化方向对突变基因进行选择，
以获得具有优良催化特性的酶的突变体的
过程
反复进行 基因 随机突变 构建基因 定向筛选 正突变基因一、 突变或包装成重组λ 噬菌体的技术过程。 反复进行 随机突变
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
微量滴定板
比色法
微孔板分光光度计
荧光检测
荧光检测器
3.噬菌体表面展示法
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外 壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而 表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面 的生物技术。
用固相化抗原 经“亲和结合 一洗脱一扩增” 数个循环直接、 方便、简捷、 高效地筛选出 表达特异性好、 和力强的抗体 噬菌体库。
2.载体的特点
具有自主复制起点 两种以上易于检测的选择性标记 多种限制性内切核酸酶的单一位点
2. 基因重组
• 在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载 体DNA连接在一起形成重组DNA的技术过程。
• 1）黏性末端连接 • 2）平头末端连接 • 组DNA转入受体细胞或包 装成有感染活性的重组噬将带有外源基因的重组质粒 DNA印染受体细胞的技术过程。）
P212
• 将各种不同的突变基因与载体重组，再转入适宜
突变基因
含突变基因的细胞或 重组λ噬菌体基因正突 变基因基因重组
筛选
载体的选择 含有正突变基因的重完整性（二）构建基因的主要过程• 1. 载体的选择
质粒载体
噬菌体DNA载体 黏粒载体 噬菌粒载体
2、高通量筛选方法
酶定向进化
• 细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化
的过程，以各种细胞为进化对象，通过人工随机
突变，改良细胞的各种特征，主要包括微生物细
胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞
的定向进化等。
分子定向进化
• 分子定向进化是在分子水平上进行定
向进化的过程。通过从细胞内提取或者通
过PCR等方法获得目标分子的基因，在体
• 概念断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突 变的技术过程。
DNA重排技术的基本过程
两条以上正突变基因
酶切
DNA随机片断
无引物PCR
酶切
突变本过程
基因家族若干同源基因 酶切 DNA随机片断 无 酶切
进化酶
DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点
• 相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过 程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物 PCR等步 • 不同点： DNA家族重排技术从基因家族的若干同 源基因出发进行DNA序列的重新排布，而DNA重 排技术则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上 的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。
三、基因家族重排技术
• 概念：又称为基因家族改组技术，是从基 因家族的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割成随机片断，经过不加引物的多次 PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排 布而引起基因突变的技术过程。
基因家族：是来源于同一个祖先，由一个基因通过基因重复而产生两 个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们结构相似、功能相关、进化 上同源。
•
特点
• 基因突变发生在单一分子内，为无性进化。
• 操作简便、随机突变丰用于较小基因
的定向进化。
• 因此要控制好突变率，一般一个目的基因错配碱基数目应 控制在2~5个
的过程，以各种细胞为进化对象，通过人工随机
突变，改良细胞的各种特征，主要包括微生物细
胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞
的定向进化等。
分子定向进化
• 分子定向进化是在分子水平上进行定
向进化的过程。通过从细胞内提取或者通
过PCR等方法获得目标分子的基因，在体
• 概念断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突 变的技术过程。
DNA重排技术的基本过程
两条以上正突变基因
酶切
DNA随机片断
无引物PCR
酶切
突变本过程
基因家族若干同源基因 酶切 DNA随机片断 无 酶切
进化酶
DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点
• 相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过 程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物 PCR等步 • 不同点： DNA家族重排技术从基因家族的若干同 源基因出发进行DNA序列的重新排布，而DNA重 排技术则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上 的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。
三、基因家族重排技术
• 概念：又称为基因家族改组技术，是从基 因家族的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割成随机片断，经过不加引物的多次 PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排 布而引起基因突变的技术过程。
基因家族：是来源于同一个祖先，由一个基因通过基因重复而产生两 个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们结构相似、功能相关、进化 上同源。
•
特点
• 基因突变发生在单一分子内，为无性进化。
• 操作简便、随机突变丰用于较小基因
的定向进化。
• 因此要控制好突变率，一般一个目的基因错配碱基数目应 控制在2~5个
第八章 酶分子定向进化(提纲)2013
第八章酶分子定向进化一、酶分子定向进化的目的为什么要研究酶的定向进化?天然酶的局限性在机体外复杂体系中，酶催化的精确性较低存在产物抑制稳定性差，活性低，催化效率低有些缺乏有商业价值的催化功能及其它性质现代生物工程的要求能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料利用基因工程、蛋白质工程的原理和计算机技术对天然酶进行改造或构建新的非天然酶具有重要研究意义和应用前景。
二、酶分子的改造酶分子的理性设计：在研究天然酶及其突变株时，通常先获得酶分子特征、空间结构以及结构与功能的关系等方面信息，这些用各种生物化学、晶体学光谱学等方法来解决，然后根据这些信息进行酶分子的改造，这就是酶分子的理性设计。
酶分子的非理性设计：不需准确知道酶蛋白结构与功能等信息，直接通过随机突变、基因重组、定向选择或筛选等方法进行酶分子的改造，称为酶分子的非理性设计。
问题：定向进化是不是定点突变？澄清一个事实：定向进化不是定点突变定向进化：突变筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的、化学的、生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR 技术为基础的。
什么是酶的定向进化?从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。
酶分子定向进化研究的历史萌芽阶段：20 世纪60 年代Sol Spiegelman 利用RNA 噬菌体Q 巧妙地在体外模拟了自然进化的过程奠基阶段：20 世纪80 年代建立了一种在基因水平上、用非合理设计方法改造酶分子的新思想发展阶段：20 世纪末期易错PCR 和DNA 改组方法被成功开发，标志着酶分子定向进化技术的成熟如何使酶分子定向进化?定向进化=随机突变+正向重组+选择或筛选三、酶分子定向进化的基本策略和方法定向进化的基本策略一般而言，定向的分子进化有三种方法：（1）连续随机突变继之筛选出最佳改进的单一突变体，使每个循环含1-2 有益突变的积累。
酶工程 1~10章题目及答案
第一章绪论试题精选一、名词解释1、酶2、酶工程3、核酸类酶4、蛋白类酶5、酶的生产6、酶的改性7、酶的应用8、酶的专一性9、酶的转换数二、填空题1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_蛋白类酶_和核酸类酶_两大类。
2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是_核糖核酸，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是_蛋白质_。
3、进行分子内催化作用的核酸类酶可以分为_自我剪切酶_，_自我剪接酶_。
4、酶活力是_酶量_的量度指标，酶的比活力是_酶纯度_的量度指标，酶的转换数的主要组分是_酶催化效率_的度量指标。
5、非竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm_减小_，米氏常数Km__不变_。
三、选择题1、酶工程是（C）的技术过程。
A、利用酶的催化作用将底物转化为产物B、通过发酵生产和分离纯化获得所需酶C、酶的生产与应用D、酶在工业上大规模应用2、核酸类酶是（D）。
A、催化RNA进行水解反应的一类酶B、催化RNA进行剪接反应的一类酶C、由RNA组成的一类酶D、分子中起催化作用的主要组分为RNA的一类酶3、RNA剪切酶是（B）。
A、催化其他RNA分子进行反应的酶B、催化其他RNA分子进行剪切反应的R酶C、催化本身RNA分子进行剪切反应的R酶D、催化本身RNA分子进行剪接反应的R酶4、酶的改性是指通过各种方法（A）的技术过程。
A、改进酶的催化特性B、改变酶的催化特性C、提高酶的催化效率D、提高酶的稳定性5、酶的转换数是指（C）。
A、酶催化底物转化成产物的数量B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数D、每摩尔酶催化底物转化为产物的摩尔数四、判断题（V）1、相同的酶在不同的pH条件下进行测定时，酶活力不同。
（V）2、竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm不变，米氏常数Km 增大。
（X）3、催化两个化合物缩成一个化合物的酶称为合成酶。
（X ）4、RNA剪切酶是催化RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。
酶的定向进化-文档资料
2019/8/8
DNA
单一基因
重 组 原 理 图 示
2019/8/8
3.外显子改组技术
• 外显子改组(exonshuffling)类似于DNA改组, • 两者都是在各自含突变的片段间进行交换,
与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分 子间内含子的同源性带动,而DNA改组不受 任何限制,发生在整个基因片段上。外显子 改组更适用于真核生物,并可获得各种大小 的随机肽库。
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2019/8/8
• 2006年, Ryota等为基因片段重组这一思 想增添ndomInsertional - deletionalStrand
2019/8/8
4.基因家族重排技术
2019/8/8
2019/8/8
酶分子的定向进化
2019/8/8
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶分子的定向进化
概念：模仿自然进化过程的人工进化策略。不需要事先了解 蛋白质的结构和作用机制，去获得期望功能或全新功能的蛋 白质或DNA。如从一个靶基因或一群相关家族基因或DNA 开始，用突变或重组等此方 法正在发展中。
• Exchangemutagenesis, RAISE) 。
该方法主要由三个步 骤组成,即基因破碎; 添加随机短序列; 重新组装。
2019/8/8
酶定向进化的基本过
酶基因
随机abea基因
2019/8/8
筛选
正突变基因
进化酶
目前酶定向进化的主要策略
• 1.易错PCR 技术 • 是指利用TaqDNA聚合酶不具有3’-5’ 外切酶活力，或改
变正常PCR的反应条件的技术 在进行PCR 扩增目的基因 时，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，导致 目的基因发生随机突变。是一种非重组型构建突变的 方法。2019/8/8
DNA
单一基因
重 组 原 理 图 示
2019/8/8
3.外显子改组技术
• 外显子改组(exonshuffling)类似于DNA改组, • 两者都是在各自含突变的片段间进行交换,
与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分 子间内含子的同源性带动,而DNA改组不受 任何限制,发生在整个基因片段上。外显子 改组更适用于真核生物,并可获得各种大小 的随机肽库。
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2019/8/8
• 2006年, Ryota等为基因片段重组这一思 想增添ndomInsertional - deletionalStrand
2019/8/8
4.基因家族重排技术
2019/8/8
2019/8/8
酶分子的定向进化
2019/8/8
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶分子的定向进化
概念：模仿自然进化过程的人工进化策略。不需要事先了解 蛋白质的结构和作用机制，去获得期望功能或全新功能的蛋 白质或DNA。如从一个靶基因或一群相关家族基因或DNA 开始，用突变或重组等此方 法正在发展中。
• Exchangemutagenesis, RAISE) 。
该方法主要由三个步 骤组成,即基因破碎; 添加随机短序列; 重新组装。
2019/8/8
酶定向进化的基本过
酶基因
随机abea基因
2019/8/8
筛选
正突变基因
进化酶
目前酶定向进化的主要策略
• 1.易错PCR 技术 • 是指利用TaqDNA聚合酶不具有3’-5’ 外切酶活力，或改
变正常PCR的反应条件的技术 在进行PCR 扩增目的基因 时，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，导致 目的基因发生随机突变。是一种非重组型构建突变的 方法。2019/8/8
酶的定向进化ppt课件
2019/12/25
酶分子改造技术的分类 • 一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰，
定点突变等；二是利用基因的可操作性，通过模 拟自然界的演化进程进行非合理化设计方案。
酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计 方式。
2019/12/25
酶分子定向进化的历史
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
• Exchangemutagenesis, RAISE) 。
该方法主要由三个步 骤组成,即基因破碎; 添加随机短序列; 重新组装。
2019/12/25
酶定向进化的基本过
酶基因
随机/25
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2019/12/25
• 2006年, Ryota等为基因片段重组这一思 想增添ndomInsertional - deletionalStrand
筛选
正突变基因
进化酶
DNA
单一基因
重 组 原 理 图 示
2019/12/25
3.外显子改组技术
• 外显子改组(exonshuffling)类似于DNA改组, • 两者都是在各自含突变的片段间进行交换,
与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分 子间内含子的同源性带动,而DNA改组不受 任何限制,发生在整个基因片段上。外显子 改组更适用于真核生物,并可获得各种大小 的随机肽库。
2019/12/25
4.基因家族重排技术
2019/12/25
2019/12/25酶分源自的定向进化2019/12/25
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶分子改造技术的分类 • 一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰，
定点突变等；二是利用基因的可操作性，通过模 拟自然界的演化进程进行非合理化设计方案。
酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计 方式。
2019/12/25
酶分子定向进化的历史
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
• Exchangemutagenesis, RAISE) 。
该方法主要由三个步 骤组成,即基因破碎; 添加随机短序列; 重新组装。
2019/12/25
酶定向进化的基本过
酶基因
随机/25
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2019/12/25
• 2006年, Ryota等为基因片段重组这一思 想增添ndomInsertional - deletionalStrand
筛选
正突变基因
进化酶
DNA
单一基因
重 组 原 理 图 示
2019/12/25
3.外显子改组技术
• 外显子改组(exonshuffling)类似于DNA改组, • 两者都是在各自含突变的片段间进行交换,
与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分 子间内含子的同源性带动,而DNA改组不受 任何限制,发生在整个基因片段上。外显子 改组更适用于真核生物,并可获得各种大小 的随机肽库。
2019/12/25
4.基因家族重排技术
2019/12/25
2019/12/25酶分源自的定向进化2019/12/25
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶的定向催化课件
酶的包容性） l (b)大小与特定的筛选容量相适应
酶的定向催化课件
21
2、突变体基因的构建策略
l DNA随机酶切片段拼接 l 单链DNA随机拼接（提高不同亲代基因的同源片段重组形成嵌
合体基因的效率） l 限制性酶切片段随机拼接（防止PCR扩增产生相同的亲代基因）
酶的定向催化 l 插入片段的装载容量大450BM-3，最适底物为C12-C18 的脂肪酸，对短链烷烃羟化活力较低两轮易错 PCR，最佳突变酶的比活提高了5倍Adv. Synth. Catal., 2001, 343: 601-606
酶的定向催化课件
31
（6）荧光产物筛选
通过定向进化，将P450cam的萘羟化活力提高20倍野生 型酶以O2为氧化剂，需要NADPH，而突变酶以H2O2为 氧化剂，无须辅酶。
酶的定向催化课件
23
l （2）质粒载体系统
l 计上有（或基因家族）原有的核苷酸序列， 创造新基因，并赋予表达产物以新功能。
l 分子育种。
酶的定向催化课件
13
（a)单个基因的DNA改组
l 从突变体基因库中分离出来的 DNA片段用脱氧核糖核酸酶I随 机切割得到的随机片段经过不 加引物的多次PCR循环。
l 在PCR循环过程中，随机片段 之间互为模板和引物进行扩增， 直到获得全长的基因，这导致 来自不同基因片段之间的重组。
酶的定向催化课件
5
二、酶分子定向进化的历史
Sol Spiegelman
在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q进行实验，
是第一次在分子水平上定向改造单一分子。
酶的定向催化课件
6
l 1981年，B.G.Hall等定向改变E.coliK12中ebg酶的底物专 一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。
《酶的定向进化》课件
蛋白酶的定向进化
总结词
通过定向进化技术，优化了蛋白酶的特异性，使其能够更有效地水解特定底物， 从而提高目标产物的产量和纯度。
详细描述
在蛋白酶定向进化过程中，通过合理设计突变位点和选择压力，成功获得了具有 更高特异性的突变体。这些突变体能够更准确地识别和切割底物，避免了副反应 的发生，提高了目标产物的产量和纯度。
员。
03
酶定向进化的实例
脂肪酶的定向进化
总结词
通过定向进化技术，成功提高了脂肪酶的耐热性和稳定性，使其在高温和酸碱 条件下仍能保持较高的活性。
详细描述
在脂肪酶定向进化过程中，通过随机突变和选择压力的方法，成功筛选出具有 更高活性和稳定性的突变体。这些突变体在高温和酸碱条件下表现出更高的酶 活性，有助于提高工业生产效率和降低能耗。
未来通过酶定向进化技术，有望进一 步提高酶的性能，满足人类生产和生 活需求。
05
总结与展望
研究成果总结
01
酶的定向进化技术已经取得了 显著的成果，成功应用于多个 领域，如生物制药、环保和能 源等。
02
通过定向进化技术，酶的活性 和选择性得到了显著提高，为 解决一些重要的工业催化问题 提供了有效途径。
03
酶的定向进化技术还为酶的结 构与功能关系研究提供了更深 入的认识，有助于进一步优化 酶的性能。
研究方法总结
酶的定向进化技术主要采用高通量筛选、DNA改组和合理设计等方法，这些方法在 不断发展和完善中。
高通量筛选能够快速发现具有优良性能的突变酶，是定向进化实验中的关键环节。
DNA改组技术通过引入大范围的基因重组，创造更丰富的突变库，有助于发现具有 更高性能的突变酶。
《酶的定向进化》 PPT课件
酶工程-08-酶定向进化
33/169
8.2.2 基因体外随机突变方法--易错PCR技术
易错PCR特点：
操作简便00bp）的定向进化
34/169
8.2.2 基因体外随机突变方法 二、DNA重排技术
DNA重排（DNA shuffling）技术又称DNA改组技术，是从 两种以上的同源正突变基因出发，用酶切成随机片段，经过不 加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基 因突变的技术过程。
15/169
细胞定向进化
细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化的过程 ，以各种细胞为进化对象，目的是改良细胞的各种 特征，主要包括微生物细胞的定向进化、动物细胞 的定向进化、植物细胞的定向进化等。
基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技术相结合 ，对细胞进行基因组重排，从而大幅度增加细胞的 正突变频率。
非理性设计（定向进化） 无需知道蛋白结构和功能关系，直接筛选适合（催化） 功能的蛋白酶，再了解这些高活力酶蛋白对应的结构
23/169
新酶设计的策略
24/169
第二节 酶基因体外随机突变
25/169
8.2 酶基因体外随机突变 获取新基因的方法
环境样品
产酶微生物的筛选
微生物的分子鉴定
微生物发酵产酶
只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换、 删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，因而对 酶功能的改造较有限。
本法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互 关系也较清楚的酶。当对酶结构不甚了解时，定 点突变就无能为力了。
12/169
定向进化
定向进化是模拟自然进化的过程，进行人 工随机突变，并在特定的环境条件下进行 选择，使进化朝着人们所需要的方向发展 的技术过程。
进化酶
8.2.2 基因体外随机突变方法--易错PCR技术
易错PCR特点：
操作简便00bp）的定向进化
34/169
8.2.2 基因体外随机突变方法 二、DNA重排技术
DNA重排（DNA shuffling）技术又称DNA改组技术，是从 两种以上的同源正突变基因出发，用酶切成随机片段，经过不 加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基 因突变的技术过程。
15/169
细胞定向进化
细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化的过程 ，以各种细胞为进化对象，目的是改良细胞的各种 特征，主要包括微生物细胞的定向进化、动物细胞 的定向进化、植物细胞的定向进化等。
基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技术相结合 ，对细胞进行基因组重排，从而大幅度增加细胞的 正突变频率。
非理性设计（定向进化） 无需知道蛋白结构和功能关系，直接筛选适合（催化） 功能的蛋白酶，再了解这些高活力酶蛋白对应的结构
23/169
新酶设计的策略
24/169
第二节 酶基因体外随机突变
25/169
8.2 酶基因体外随机突变 获取新基因的方法
环境样品
产酶微生物的筛选
微生物的分子鉴定
微生物发酵产酶
只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换、 删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，因而对 酶功能的改造较有限。
本法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互 关系也较清楚的酶。当对酶结构不甚了解时，定 点突变就无能为力了。
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定向进化
定向进化是模拟自然进化的过程，进行人 工随机突变，并在特定的环境条件下进行 选择，使进化朝着人们所需要的方向发展 的技术过程。
进化酶
第八章酶的定向进化
二、DNA改组技术
• 在酶分子无性进化策略中，一个具有正向突变的基因在下 一轮易错PCR过程中继续引入的突变是随机的，而这些后 引入的突变仍然是正向突变的概率是很小的。因此人们开 发出DNA改组等基因重组策略．将已经获得的存在于不同 基因中的正突变结合在一起形成新的突变基因库。
DNA改组(DNA shuffling)
• 该技术不仅可加速积累有益突变, 而且可实现目的蛋白多种特 性的共进化, 所以无论在理论上, 还是在实际应用中, 均优于连 续易错PCR。
DNA 改组 原理
实例
• β-内酰胺酶是一种水解头孢类抗生素的微生物酶, Stemmer] 等运用DNA shuffling技术对β-内酰胺酶进行改造，每次循环 后从中筛选出数百个酶活力提高的突变体DNA序列用于下次 循环。经过3次循环获得一个赋予宿主细胞对头孢菌素抗性提 高16000倍的突变体。
• 目前已利用定点突变技术对天然酶蛋白的催化效率、抗氧 化性、底物特异性、热稳定性及拓宽酶反应的底物范围、 改进酶的别构效应等进行了成功的改造。
酶的合理设计
定点突变的缺点
• 只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换、删除或 插入，不改变酶蛋白的高级结构，因而对酶功能的改造较 有限。
• 本法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较 清楚的酶。当对酶结构不甚了解时，定点突变就无能为力 了.
第一节 酶定向进化的特点
• 适应面广 • 目的性强 • 效果显著
第二节 酶基因随机突变的方法
• 一、易错PCA重组, DNA改组）技术为代表的有 性突变
一、易错PCR技术为代表的无性突变
• 无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶 基因库以便筛选。主要的手段包括易错PCR、盒式诱变、随 机定位诱变等。
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Single gene shuffling library of point mutants
.
Family gene shuffling library of chimeras
Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis
43
2008年诺贝尔化学奖介绍
评论
生物学有些现象只能在打碎细胞以后才能做，所以实际 上是从“死物”上来推测生物的情况。而下村修、钱永健 和马丁· 沙尔菲发明的用荧光分子标记其他分子的方法，使 科学家们能在活细胞、活生物上直接观察一些生物现象。 所以，可以说是把一些“死物学”变成了真正的“生物学 （北大饶毅）
• 难点
• 突变库容量大，一般达到106，工作量巨大
• 关键
• 高通量筛选：通量大，效率高
• 方法
平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表 面展示法
35
8.3 突变基因的筛选
• （一）定向选择环境条件的设立 • 例：为提高酶的热稳定性，可以在较高的温 度下培养重组细胞，并在每一次“突变－筛 选”的循环中逐步提高培养温度
Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences
Contents of chapter 8
8.1进化的应用308.2 突变基因的构建8酶的定向进化
酶定向进化的概念： 模拟自然进化（随机突变和自然选择） 的过程，在体外进行酶基因的人工随机突 变，并在人工控制条件的特殊环境下进行 定向选择，得到具有优良催化特性的酶的 突变体。所得到的酶称为进化酶。
9
酶的定向进化
• 主要过程： 1、随机• 基因重组（of chapter 8
8.1进化的应用
34
8.3 突变基因的筛选
• 目标
• 根据定向进化要求，形虫体内植入 绿色荧光蛋白质
绿荧光水母—通过体内绿色 荧光蛋白发光
44
绿色荧光蛋白的应用
分子标记：GFP标记的微管结构
45
3、噬菌体表面展示法
利用丝状噬菌体的外 膜结构蛋白与某些 特定的外源蛋白或 多肽分子形成稳定 的复合物，使外源 蛋白或多肽富集在 噬菌体表面的一种 分子展示技术
46
26
27
基因家族重排技术（1998,Crameri）
• 单一酶分子基因：进化过程中集中有利突变 速度较慢
• 基因家族：由于基因之间存在显著差异，所 得突变库体现了基因多样性和增加了有利突 变的概率 • 由于定向进化的高效性，被认为是DNA改组 的发展方向
28
单基因重排Vs基因家族重排技术
.. . . . .... .
利用自身荧光激发特性
生成产物本身是具有荧光激发特性的物质
利用荧光报告基因 辣根过氧化合物酶和单加氧酶的融合基因： 原理：萘→萘酚→醌类化合物（能激发荧光） 绿色荧光蛋白基因：获2008年诺贝尔化学奖
42
2008年诺贝尔化学奖介绍
获奖
2008年度诺贝尔化学奖授予日本科学家下村修、美国科 学家马丁· 沙尔菲，以及美国华裔科学家钱永健。他们三人 因为在绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）研究和应用方面做出的突 出贡献将各分得2008年度1／3的诺贝尔化学奖奖金。
定向选择： • 先把随机突变获得的突变基因做成基因文 库，再从中筛选出有用的突变基后筛选出完整的进粒、噬菌体载体、黏粒质 粒、噬菌体质粒）
蛋白质与酶工程
Chapter 8 Enzymatic Directed Evolution
第八章 酶的定向进化
3
酶工程：酶（酶制剂）的生产、改性和
应用的技术过程。
生产
• 微生物发酵产酶 (Chap. 2) • 动植物细胞培养产 酶(Chap. 3) • 酶的提取与分离纯 化(Chap. 4)
改性
4、酵母表面展示法
• 通过锚定在酵母细胞表面的特点蛋白质与 某些外源蛋白质或多肽形成稳定的化合物， 使外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的 一种分子展示技术。 • 凝集素
Contents of chapter 8
8.1进化的应用
• 酶分子修饰 (Chap. 5) • 酶/细胞/原生质体 固定化 (Chap. 6) • 酶非水相催化 (Chap. 7) • 酶定向进化 (Chap. 8)
应用
• 酶反应器 (Chap. 9) • 酶的应用 (Chap. 10)
4
物种的自然进化
5
定向进化（directed evolution）
3、突变基因的筛选（获得正突变）
Contents of chapter 8
8.1进化的应用
11
8.1 酶基因的随机突变
随机突变的技术 • 无性突变技术：
易错PCR (error-prone PCR)
• 有性突变技术：
• 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ • 提高Mg2+浓度
15
1、易错PCR
• 优点：操作简便，随机突变的定向进化
• 难点：要控制好突变率
16
1、易错PCR
连续易错PCR： 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。
DNA 改组 (DNA shuffling)
交错延伸PCR 随机引物体外重组 基因家族重排
12
PCR
13
1、易错PCR
• Taq酶不具有3’5’ 方向的 外切酶活性，有一定的错配 几率（5×10-5） • 易错PCR：提高PCR过程 的错配几率
14
1、易错PCR
方法：
• 改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降 至5％-10％），同时加入dITP来代替被减少的 dNTP；
• 极端环境：高盐、低温、高浓毒物质
38
1、平板筛选方法
（2）依据颜色变化筛选
反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚
脂肪酶筛选
39
1、平板筛选方法 （3）依据透明圈大小筛选
淀粉酶的进化：淀粉平板培养基
豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基
40
2、荧光筛选法
41
2、荧光筛选法
7
酶的定向进化
• 基于序列的理性设计：分子修饰
利用已知酶分子的空间结构、结构和功能之间关系， 以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改造； • 利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：定向进化 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基 因重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因， 并定向筛选出所需突变酶；
（1994，Stemmer)
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
20
DNA shuffling
How DNA shuffling is done in the tube
Random fragmentation of a pool of related genes; Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers);
36
8.3 突变基因的筛选
• （二）高通量筛选：通量大、效率高，可迅 速判断哪些是正突变 平板筛选法 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 酵母细胞表面展示法
37
8.3 突变基因的筛选
1、 平板筛选
（1）依据细胞生长情况筛选
• 热稳定性：温度梯度和高温环境
• 抗生素耐受性：抗生素浓度梯度
• pH稳定性： pH梯度
17
2、DNA改组 (DNA shuffling)
• DNA割成随机片段，经过不加引物 的多次PCR循环，获得重新排列的突变 DNA的过程。
有性进化：DNA改组方法（1994，Stemmer)
18
正突变
19
DNA重排原理图
24
交 错 延 伸 突 变 法 PCR
25
随机引物体外重组(1998, Arnold)
• RPR (Random-priming in vitro recombinatoion)
• 在以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物， 先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段。 • 去除模板后，在随后的PCR反应中，它们互为 引物和模板进行合成，伴随组合，再组装成完 整的基因长度。
PCR amplification with primers of reassembled products
21
DNA shuffling
方法：从正突变基因库中分离得到的DNA序列用酶随 机切割，得到的随机片断经不加引物的多次PCR循环， 获得全长基因，实现优势突变的组合； 特点：遗传变化仅发生在来自不同基因片断之间的 重组，所以称为有性进化； 优点：将已有的正突变基因结合，正突变效率高； 缺点：无引物PCR之前必须把DNase I去除干净，以 防突变基因的被切割；
• 自然进化
随机突变 自然选择 Vs.
• 定向进化
人工随机突变 人工定向选择
基因的定向进化 蛋白的定向进化 酶的定向进化 细胞的定向进化 。。。
6
酶的定向进化
Vs. • 理性设计 rational design 找出酶的关键 结构，有目的 地改造
• 定向进化
不需要事先知道 酶的空间结构、 活性位点等
22
不需加DNAI的DNA重排技术
• 交错延伸PCR • 随机引物体外重组技术
23
交错延伸PCR(1997, Arnold)