蛋白质序列分析

肽和蛋白质的直接测序法目前，肽和蛋白质的测序有三种策略：①根据基因测序的结果，从cDNA演绎肽和蛋白质序列，这种策略简单、快捷，甚至可以得到未分离出的蛋白质或多肽的序列信息。

但是，用这一策略得到的一级结构不含蛋白质翻译后修饰及二硫键位置等信息；②直接测序策略；③质谱测序与生物信息学搜索相结合的策略。

第①种策略可参考分子生物学的有关专著，第③种策略将在本书蛋白质组与蛋白质组分析一章中介绍，本章介绍直接测序策略。

1953年，Frederick Sanger在对牛胰岛素的研究中首先提出氨基酸直接测序的概念，迄今为止，已通过直接测序阐明了几千种蛋白质的氨基酸序列。

在蛋白质序列测定中，因为可以得到的蛋白质样品十分有限，而且蛋白质包含的20种不同的氨基酸表现出不同的化学功能和化学活性，在测序过程中每一次变性或裂解所发生的一系列副反应，将使测定过程变得十分复杂，在蛋白质序列测定中由于没有类似于DNA序列测定中采用的PCR技术可应用，因此，与DNA 序列测定相比，蛋白质序列测定在许多方面要复杂得多。

其基本的测序过程如下所述。

确定不同的多肽链数目首先应该确定蛋白质中不同的多肽链数目，根据蛋白质N-端或C-端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可确定蛋白质分子中的多肽链数目。

如果是单体蛋白质，蛋白质分子只含一条多肽链，则蛋白质的摩尔数应与末端残基的摩尔数相等；如果蛋白质分子是由多条多肽链组成，则末端残基的摩尔数是蛋白质的摩尔数的倍数。

肽链的裂解当蛋白质分子是由二条或二条以上多肽链构成时，必须裂解这些多肽链。

如果多肽链是通过非共价相互作用缔合的寡聚蛋白质，可采用8 mol L-1尿素，6 mo1 L-1盐酸胍或高浓度盐等变性剂处理，使寡聚蛋白质中的亚基裂解；如果多肽链之间是通过共价二硫键交联的，可采用氧化剂或还原剂断裂二硫键。

然后再根据裂解后的单个多肽链的大小不同或电荷不同进行分离、纯化。

太长的多肽片段不能直接进行序列测定，一般肽片段长度不超过50个左右残基的肽段，当肽段超过这个长度时，由于反应的不完全以及副反应产生的杂质积累将影响测定结果，因此，必须通过特定的反应将它们裂解为更小的肽段。

通过两种或几种不同的断裂方法（即断裂点不同）将每条多肽链样品降解成为两套或几套重叠的肽段或肽碎片，每套肽段分别进行分离、纯化，再对纯化后的每一肽段进行氨基酸组成和末端残基的分析。

使肽链中某些特殊位置上的肽键发生断裂，可采用化学反应或酶反应裂解产生若干能够进行测序的小片段。

一般将蛋白质样品分为两等份，采用不同的试剂裂解产生两套不同的片段，两套片段在测序完成后，根据他们之间的重叠情况即可重新排序。

1 酶解法蛋白质通过蛋白水解酶的裂解后将产生若干能够代表每个蛋白质特性的肽片段，用于特定的蛋白质裂解的蛋白水解酶包括外肽酶和内肽酶，裂解肽链的N-端或C-端的氨基酸可采用外肽酶，而内肽酶则用于切断肽链中某个特定部位。

表10.5为常用的蛋白水解酶。

表10.5 用于蛋白质部分裂解的蛋白酶蛋白酶酶切位点内肽酶：胰蛋白酶R n-1=Arg，Lys R n≠Pro胃蛋白酶R n=Leu，Phe，Trp，Tyr，Val R n-1≠Pro糜蛋白酶R n-1=Phe，Trp，Try R n≠Pro内肽酶GluC R n-1=Glu外肽酶：亮氨酸氨肽酶R1≠Pro氨肽酶所有N-端残基羧肽酶 A R n≠Arg，Lys，Pro R n-1≠Pro羧肽酶 B R n=Arg，Lys R n-1≠Pro羧肽酶 C 所有C-端残基具有高度专一性的胰蛋白酶是最常用的内肽酶，当下一个残基不是Pro时，胰蛋白酶可催化裂解肽链中羧基端（C端）带有正电荷的残基（Arg和Lys），如式(10.15)。

将胰蛋白酶消化所获得的特征片段图谱与数据库进行比较，即可进行蛋白质的鉴定，因而被作为一种对已知蛋白质进行鉴定的方法。

(10.15)在除去裂解位点后，即除去Lys或Arg支链上的正电荷，这个位点上的肽将不再被胰蛋白酶切断。

例如，用甲基马来酸酐衍生Lys残基，产生一个不带正电荷的Lys支链，则胰蛋白酶不能将其识别作为一个裂解位点，式(10.16)；而在加上裂解位点后，即在其他氨基酸支链上引入正电荷，会产生一个可被胰蛋白酶识别的新裂解位点。

例如，采用如2-溴乙胺使Cys发生氨基烷基化反应，在Cys支链中引入了一个正电荷，则胰蛋白酶能将其识别作为新裂解位点，式(10.17)。

通过上述两种方式，就能够更充分地发挥胰蛋白酶对蛋白质的裂解特性。

(10.16)(10.17)与胰蛋白酶相比较，内肽酶的专一性略差，所产生的肽片段小，与其它肽片段的重叠程度不够，肽片段在蛋白质序列中重新排列时的位置则可能发生错误。

对Arg和Lys含量较高的蛋白质，则可采用限制胰蛋白酶水解的方式，亦即通过改变反应条件，缩短反应时间，使酶与肽链接触的机会减小，从而获得符合测序要求的肽片段。

2 化学降解法许多化学反应也可用于专一性地裂解肽键，例如，为裂解所有Met残基，可在温和酸性的反应条件下，采用溴化氰（CNBr）在C端对Met残基进行专一性的裂解，形成肽基高丝氨酸内酯，如式(10.18)(10.18)总的来说，为满足测序的要求，有时需要采用不同的处理方法来进行多肽链的裂解，才能得到足够小的多肽片段。

二硫键的裂解二硫键（Disulfide bond）在两个Cys残基之间形成，可出现在一条多肽链中不同的氨基酸残基之间，也可出现在不同多肽链中的氨基酸残基之间。

测序之前，必须裂解存在于多肽链中或不同多肽链之间的二硫键以便于分离和展开亚基，同时，蛋白质原有结构的分解也使测序中采用的蛋白质分解试剂能够更好地发挥作用。

裂解反应最好在变性条件下进行，例如，通过加入盐酸胍或诸如SDS等变性剂，使紧密结合的蛋白质结构展开而暴露出所有的二硫键，然后加入氧化剂或还原剂使二硫键裂解。

常用的氧化剂是过甲酸，它能使蛋白质中所有的Cys残基均被氧化为磺基丙氨酸（无论是否通过二硫键连接），式(10.19)。

由于磺基丙氨酸在酸碱条件下都稳定，因此可通过产生的磺基丙氨酸数量推断Cys残基总量。

(10.19)该方法的明显缺点是过甲酸会导致Met残基氧化为甲硫氨酸亚砜和砜，式(10.20)，也可使Trp残基的吲哚侧链部分降解。

(10.20)二硫键也可以用大大过量的二硫苏糖醇（DTT）或巯基乙醇还原为巯基，如式(10.21)，式(10.22)所示。

但是，产生的巯基（-SH）必须用烷基化试剂（例如碘乙酸）处理，以防止二硫键的重新形成, 式(10.23)。

所产生的烷基化衍生物在后续测序步骤中的肽裂解条件下十分稳定。

(10.21)(10.22)(10.23)氨基酸组成分析在裂解二硫键后，需要对每个多肽链中氨基酸的组成进行测定。

一般将分离、纯化后的多肽链样品分为两部分，一部分样品经过完全水解，测定其氨基酸组成，并计算出氨基酸各种残基的含量；另一部分样品则进行N-端或C端测序。

一个未知蛋白质的氨基酸组成，可以通过测量氨基酸残基的相对百分比并与数据库进行比较而确定。

其测量可通过两个步骤来完成，首先通过酸水解、碱水解或酶水解等方式裂解蛋白质中所有的肽键，继而分离游离氨基酸并进行定量测定。

在二硫键裂解之后，蛋白质不同亚基可通过电泳方法如SDS-PAGE或色谱方法如SEC或RP-HPLC等进行分离。

由于每一个氨基酸残基具有大约110Da的分子质量，根据每个亚基分子质量的大小，即可确定氨基酸残基的数量。

以往，一般采用SDS-PAGE或SEC等方法确定蛋白质的分子质量，生物质谱法因为准确度更高、分析速度更快，现在越来越被普遍采用。

在酸催化水解中，要寻找理想的水解条件是比较困难的，因为要裂解所有的肽键，必须对氨基酸残基的降解平衡进行综合考虑。

一般情况下，不同氨基酸的降解反应是在各自不同的条件下进行，实际的氨基酸组成是从不同的降解实验中推断得到的。

通常，为防止氨基酸中的硫被空气氧化，在真空条件下对多肽用6MHCl 进行处理，反应混合物需要在100～120℃保温24小时，而Leu、Val、Ile等脂肪氨基酸则可能需要较长的反应时间才能完全水解。

但是，在这样的反应条件下，部分氨基酸残基会发生降解，Trp将被完全降解。

此外，在酸催化水解中，Asn和Gln分别转化为Asp和Glu并消去NH4+。

对这些氨基酸，必须测定Asx（Asn+Asp）、Glx（Gln+Glu）和NH4+（Asn+Gln）的总含量并进行比较。

碱催化水解一般仅用于特殊情况下，多肽在100℃条件下与4MNaOH反应4～8小时，Arg、Cys、Ser、Thr被分解，其它的氨基酸则被脱胺基和外消旋。

正因如此，应用碱水解测定Trp含量就受到了限制。

由于具有高度的专一性，内肽酶和外肽酶都可用作催化某些肽键水解的酶，Asn、Gln、Trp等含量的测定常常采用酶法。

为保证所有肽键的完全水解，一般都采用这些酶的混合物进行催化水解。

但是酶本身也是蛋白质，在反应条件下也可以发生降解而污染反应混合物，所使用的酶浓度不能过高，大约在1%左右。

上面几种方法都可应用于某些氨基酸的定量测定。

但是，要保证使所有的肽键完全水解，而又不引起氨基酸残基的降解，单独采用任何一种方法都不能满足这个要求。

因此，要实现多肽中的所有氨基酸的定量测定，可采用两种或三种水解方法的联合应用。

水解完成后所得到的游离氨基酸混合物采用离子交换色谱或RP-HPLC进行分离，然后根据洗脱时间进行鉴定，根据峰面积或峰高进行定量测定。

为增加分析的灵敏度，可以采用丹磺酰氯（dansyl chloride）、Edman 试剂（PITC）、邻苯二醛（OPA）及2-巯基乙醇等试剂对氨基酸进行柱前或柱后衍生化，形成具有强荧光性的加成化合物之后进行检测，如本章§10.1节所述。

肽段氨基酸序列的测定肽和蛋白质序列测定（Protein Sequencing）直接测序策略的步骤通常包括：第一，采用化学法或酶法从蛋白质多肽链的N端或C端将氨基酸残基依次从蛋白质或多肽的末端切割下来；第二，对每次切割下来的氨基酸残基进行正确的鉴定，氨基酸残基的鉴定通常采用在氨基酸残基上衍生一个生色基团，利用高效液相色谱法进行分离鉴定。

随着生物质谱法、自动化技术和生物信息学的不断发展，尤其是生物质谱法中生物分子的电离技术的改进，使蛋白质序列测定技术已经发生了革命性的变化，蛋白质序列分析的时间大大缩短。

N-端序列分析（Edman降解）1．Edman降解分析原理蛋白质和多肽的N端分析可通过与丹磺酰氯（dansyl chloride）、氨肽酶（aminopeptidase）或Edman试剂（异硫氰酸苯酯，phenyl isothiocyanate，PITC）的反应进行分析。

其中，1950年由P. Edman公布的氨基酸序列测定技术，即运用苯异硫氰酸酯与氨基酸的反应（Edman反应）进行N端分析特别有用。