蓝白斑筛选

α
互 补 的 检 测
实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal 的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对 应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：
• 未转化的菌不具有抗性，不生长；
• 转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；
• 转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。
半乳糖
5-溴-4-靛蓝
蓝色
• 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以 将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-βD-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质 5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌 落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛 选的最直观有效的方法。
• 设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染 色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突 变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N 段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链）， 从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal 产生蓝色物质。
• 操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷) 以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有 X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。
• 以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源 DNA（即目的片断）与含lacz'的载体连接时，会 插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质 粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α 互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分 解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白 色菌落。
• 用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz' 的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶 的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆 位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中， 是外源DNA的选择性插入位点，但其本身 不影响载体编码α肽链的功能活性.
• 虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后， 质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的 Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完 整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的 能力，这种现象即α-互补。
蓝白斑筛选
Hale Waihona Puke Baidu
pGEM-T Easy Vector 载体环形图谱
蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）
• 乳糖：乳糖操纵子的天然诱导物 • IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，是一种乳糖类似物，
比乳糖有更强的诱导作用。 • LacZ基因：编码半乳糖苷酶的基因，能够表达检测剂
• X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。