补益营卫方药对衰老人皮肤成纤维细胞数量及增殖周期的影响

补益营卫方药对衰老人皮肤成纤维细胞数量及增殖周期的

影响

何多谊1,周小平1,刘韬1,徐武清1

（宁夏医科大学中医学院，银川 750004）

摘要:目的观察经补益营卫药物血清刺激后，衰老人皮肤成纤维细胞数量和增殖周期的变化规律。方法体外培养正常人皮肤成纤维细胞，当人皮肤成纤维细胞衰老时，加入不同浓度的药物血清配制成的细胞培养液，对衰老人皮肤成纤维细胞进行培养，通过细胞计数法连续观察细胞数量的变化；采用流式细胞术观察细胞增殖周期。结果补益营卫药物血清高、中、低剂量组中，细胞数量和S期细胞比例均增高，且均高于对照组，但以高剂量组细胞数量和S 期细胞增高比例最明显。结论补益营卫方药促进衰老人皮肤成纤维细胞增殖,且增殖程度随着药物血清浓度的增高而相应增高。

关键词:营卫；成纤维细胞；细胞增殖；细胞周期

Influence of the recipe of supplementing Ying-wei on the proliferation and cell cycle of the aging human skin fibroblasts

HE Duo-yi1, ZHOU Xiao-ping1, LIU Tao1,XU Wu-qing1

(Chinese Medicine College of Ningxia Med. Univ. , YinCHuan 750004) Abstract：Objective To observe the influence of the drug serum of supplementing Ying-wei on the proliferation and cell cycle of the aging human skin fibroblasts Methods normal human skin fibroblasts are cultured in vitro,When the normal human skin fibroblasts are decrepit,we add cell culture medium which is preparated by the drug serum with different concentrations to cultured the aging human skin fibroblasts,to observe continuously the cells’changes in the number through cell counting,we observe the cycle of cell proliferation by flow cytometry. Results Among supplementing Ying-wei drug serum with different levels of high, medium and low dose groups, the amount and the percentage of S phase cells in cell cycle of the aging human skin fibroblasts are increased significantly, and also higher than that of control group, but the high dose group are increased the most obvious.Conclusion The recipe of supplementing Ying-wei can promote the proliferation of the aging skin fibroblast, and which is increased with the increasing of drug serum concentrations of the recipe.

Key words: Ying-wei; fibroblasts; cell proliferation; cell cycle

基金项目:国家自然科学基金项目（编号：30960479），宁夏医科大学特殊人才科研启动项目（T2007—

XT200711）

作者简介：何多谊（1982—），男，湖南人，在读硕士研究生，从事中医临床基础研究。E-mail：842829901@

通讯作者：周小平（1975—），男（回族），宁夏人，副教授，硕士研究生导师。E-mail：zhxp1999@

营卫具有“熏肤、充身、泽毛、温分肉、充皮肤、肥腠理、司开合”的作用，与皮肤生理病理有十分密切的关系。营卫的盛衰与皮肤衰老有密切联系[1]。皮肤成纤维细胞是皮肤的重要组成细胞。本实验拟通过补益营卫观察其对衰老人皮肤成纤维细胞数量及细胞周期的影响，为补益营卫延缓皮肤衰老提供实验支持。

1 材料

1.1 细胞株来源

人皮肤成纤维细胞株（ＨＳＦ）：来源于中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库，昆明细胞库（KCB）编号：KCB 200505S。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM培养基（Invitrogen公司，美国）；FBS（Hyclone,北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司）；胰蛋白酶（Gibco公司,美国）；DMSO（Sigma公司，美国）；青霉素、链霉素（华北制药股份有限公司）；碘化丙啶(PI)（Sigma公司,美国）；流式细胞仪(BD公司,美国)；CO2孵箱(XX-50-Ⅰ型,沈阳伟明医疗设备厂)；超净工作台(SW-CJ-1F型,苏州安泰空气技术有限公司)。

1.３药物

补益营卫方药由人参5g、生黄芪15g和炙甘草7g组成。中药购自宁夏医科大学中医门诊部，水煎两次，浓缩至终浓度为4g/ml，置4℃冰箱冷藏备用。

2 方法

2.1 含药血清制备

雄性清洁级SD大鼠60只，体重300±50g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证编号：scxk(京)2006-0009。动物随机分为补益营卫低剂量组、中剂量组、高剂量组３组，每组20只。各给药组依次按照1.5g∕Kg、3g∕Kg、6g ∕Kg灌胃，每日一次，连续一周，第8天末次给药1小时后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，无菌操作进行心脏采血，室温静置2小时，2500rpm离心15min，取出血清，超净台无菌过滤，56℃灭活30分钟，-80℃冰箱中保存备用。用时以DMEM培养基将血清稀释为10％的培养液。

2.2 人皮肤二倍体成纤维细胞的培养及分组

人皮肤二倍体成纤维细胞株用DMEM培养基，10%胎牛血清，100ｕ/ml青霉素，100u/ml链霉素，200μg/ml L－谷氨酰胺，37℃，5%CO2恒温培养。根据文献[2,3]，HＳF细胞41代以后成纤维细胞的超微结构改变明显，46代后的细胞老化明显，以