激光扫描共聚焦显微镜参考文档
激光共聚焦原理范文
激光共聚焦原理范文激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种应用激光光源和共聚焦光路原理的现代显微镜，其基本原理是利用激光光源产生的激光束，通过聚焦物镜将激光束聚焦到样品上，并收集样品反射、透射或荧光发射的激光信号，经过共聚焦光路的滤波和光电倍增器放大后，通过扫描装置控制光束在样品不同位置的扫描，最后通过成像系统将信号转化为图像。
下面详细介绍激光共聚焦显微镜的原理。
1.光路结构激光共聚焦显微镜的光路结构主要由激光器、激光光束系统、共聚焦光学系统和光学检测系统组成。
激光器通常采用氩离子激光器或氮气激光器等可产生高能量、窄谱宽激光束的光源。
激光光束系统由准直器、束整形器和聚焦器组成，主要用于产生、整形和准直激光光束。
共聚焦光学系统由物镜和扫描装置组成，其主要作用是将激光光束聚焦到样品上，并进行扫描。
光学检测系统主要由物镜、分光器、光学滤光器和光电倍增器等组成，用于收集并检测样品反射、透射或荧光发射的激光信号。
2.激光共聚焦光学系统原理激光共聚焦光学系统由聚焦镜头和扫描装置组成。
聚焦镜头由物镜和扫描镜组成，物镜用于将激光光束聚焦到样品的局部区域，扫描镜用于控制激光光束在样品上的扫描。
聚焦镜头的光学轴与激光光束保持一致，其焦点与样品接触面构成一个共聚焦点，也称为焦斑。
激光光束通过聚焦镜头后，其径向和轴向分辨率都很高，使得显微镜在透射成像的同时，还能够进行光学切片和三维重建。
扫描装置通过控制扫描镜的运动，使激光光束可以在样品平面上进行扫描，从而实现对样品不同位置进行扫描成像。
3.光学检测系统原理光学检测系统主要用于收集并检测样品反射、透射或荧光发射的激光信号。
光学信号经过物镜和分光器后进入光学滤光器，滤光器可以选择性地透过或屏蔽特定波长的激光信号。
经过滤光器的激光信号最后进入光电倍增器，通过电子放大器将光信号转化为电信号，再通过数模转换器转化为数字信号，最终通过计算机处理并生成图像。
激光扫描共聚焦显微镜
1、 选择好适宜的荧光探针。 原则上讲,无论是荧光素还是荧光标记抗体均 可用于LSCM 。如果打算用2种以上荧光标记物,要 注意它们是否激发光波长及发射光波长能区别开， 还要注意是否与LSCM的激发器相匹配，要根据现有 的激发波长来选择荧光标记物。
• 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合 考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找 出最适的荧光探针。
6.观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤
细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观 察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期 处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观 察过的样品还可以继续用于其他的研究。 这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为 重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
7. 生化成分精确定位观察配合专用的分子探 针，对于要检测的成分不仅可以定位到细 胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子 水平。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜：以激光作为激发光源，采用 光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫 描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.
形态学研究：组织细胞 标本的抗原免疫荧光检 测，凋亡检测…
目的结构是用荧光探针标记的， 都可以用激光共聚焦显微镜观察
分子生物学：荧光原位杂交对DNA 和RNA定量，外源基因在真核细胞 的表达及定位，蛋白质相互作用 (FRET)…
4. 采 用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光 束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的 光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的 衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无 法相比的。
5.光电倍增管：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成 电 信号，相当于相机中的CCD或胶卷。 PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录 的 结果通过信号强度和填充颜色表示。PMT单位用电压值V 表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图 像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降。
激光扫描共聚焦显微镜（LaserScanningConfocalMicroscopy
激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy, LSCM)成像技术目的结构是用荧光探针标记的，都可以用激光共聚焦显微镜观察形态学研究：组织细胞标本的抗原免疫荧光检测，凋亡检测…分子生物学：荧光原位杂交对DNA和RNA定量，外源基因在真核细胞的表达及定位，蛋白质相互作用(FRET)…活细胞动态荧光测量：细胞内Ca2+、Cl-等离子的动态分布及定量，细胞连接间的信息传递(FRAP)…成像基础：荧光成像主要原理：利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测。
z sections = imagesyzx激光共聚焦显微镜的设计特点：Laser：经过照明针孔后形成点光源，光源方向性强、发散小、亮度高、颜色纯、单色性强Beamsplitter(光束分离器)：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。
Pinhole (照明针孔和探测针孔)：最大限度的阻挡非聚焦平面以及聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品焦点位置PMT (PhotoMultiplier Tube, 光电倍增管)：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成电信号，相当于相机中的CCD或胶卷PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录的结果通过信号强度和填充颜色表示PMT单位用电压值V表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降激光扫描共聚焦与传统荧光显微镜的主要区别： 激光扫描共聚焦显微镜只接收共焦点处荧光。
普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光，来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收。
影响来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率（焦平面以外的荧光结构模糊、发虚）。
CCDPMTFV1000 (Olympus)：多个荧光通道(405, 458, 488, 515, 543, 633)，可同时检测多个荧光标记一个透射光通道，透射光图像为非共焦图像激光扫描共聚焦显微镜的主要应用No.1 免疫荧光染色(单标、双标、多标)细胞浆、核、膜抗原的分布、半定量分析 几种抗原的共定位抗原与细胞器的共定位抗原转位No. 2 荧光标记活细胞内成分：氯离子荧光探针：MQAE[N -(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide]细胞内pH的荧光探针：BCECF AM[2’,7’-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester]活性氧荧光探针：DCFH-DANO荧光探针：DAF-FM DA[3-Amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetateNo. 3 荧光标记各种亚细胞结构：细胞内微丝：荧光染料标记的毒蕈肽(phalloidin)细胞膜荧光探针：DiI 即DiIC18(3) [1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，红]和DiO即DiOC18(3) [dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate，绿] 内质网探针：荧光标记的glibenclamide高尔基体探针：荧光标记的C5-ceramide。
激光共聚焦显微镜中文说明书
激光共聚焦显微镜中文说明书12020年4月19日激光共聚焦显微镜FV1000(倒置显微镜IX81) 简易使用说明书2 2020年4月19日32020年4月19日开启系统 1.打开计算机.2.打开激光器.(打开钥匙开关.) 2-1.多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm) ON2-2氦氖绿 (543 nm) ON2-3氦氖红 (633 nm) ON 3.打开汞灯电源开关. 4.登陆 Windows XP 系统.User ID: Administrator Password: fluoview5.双击快捷方式：打开 FV10-ASW 应用软件.5231文档仅供参考，不当之处，请联系改正。
42020年4月19日User ID: AdministratorPassword: Administrator* 系统软件的启动需要等待一定时间.显微镜镜下观察 微分干涉差观察1.使用手控面板选择物镜. (参照Memo .)2.插入起偏镜.3.插入微分干涉滑块.*DIC元13 24手控面板用此旋钮进行微分涉法对比度的调.4.点击FV10-ASW软件中的图标.Note1:使用TD滑块控制卤素灯的光强；Note2:检查滤色片转盘的位置是否为“6.DICT”，如果不是，用手柄按下DICT 图标5.标本聚焦Memo显微镜镜下观察荧光观察52020年4月19日619日1.使用手控面板选择物镜.2.点击FV10-ASW 软件中的图标.3.使用手控面板选择荧光滤色片.(参照Memo .)4.标本聚焦.2Hand switchMemo 关于荧光滤NIB ： 蓝色激/ 绿色荧（FIT 、 EGFP 等WIG ： 绿色激/红 色 荧（Rhodamin 、 DsRed 等72020年4月19日扫描模式扫激光输出的调节明场观察( 显微镜镜下观察) 荧光观察( 显微镜镜下观察 ) 扫描的按钮 选择 XYZ,XYT 或 XYL 每个通道的调节 共聚焦的孔径大小 卤素灯的光强调节 Kalman方式 染料选择 光路图取图条件的保存 调出取图条件TwinScanner设定图像的拇指索引图像显示窗口内存中所显示的文件Lambda扫描的设定 物镜 聚焦时间间隔和时间计数( 用于 XYT 或 XT 扫描)λ 扫描带宽选择描速82020年4月19日文档仅供参考，不当之处，请联系改正。
激光扫描共聚焦显微镜讲课文档
•乳腺上皮细胞主要细胞器的检测
•37℃预热、 终浓度为50nmol/L的M-7512工作液，37℃染色40min；
•37℃预热、终浓度为 1μmol/L 的 E-34251 工作液，37℃染色 30min
•10μg/ml 的 Hochest 33258 复染 5min
•图像采集与数据处理
农业的应用:
Jasplakinolide解聚微丝的实时观察
第二十四页，共31页。
•Zaslavskaia et.al, Martek Biosciences, MD, June 15, 2001 第二十五页，共31页。
November 2001; Volume 128 (21): pp 4301-4314. Courtesy: Jose-Eduardo Gomes, University of Oregon, USA
Nature, 25 April 2002, pg 854
第二十六页，共31页。
第二十七页，共31页。
• GFP-MAP4
Cyr
架 （ 美 国 实融 验合 室蛋 ）白
表 达 显 示 微 管 骨
第二十八页，共31页。
•奶山羊发育中乳腺上皮细胞主要细胞器的变化
•为研究奶山羊乳腺的胚后形态发育，采用活细胞荧光标 记法结合激光共聚焦显微技术，观察奶山羊乳腺发育中 主要细胞器的变化。 •根据奶山羊乳腺发育特点，采样时点分为：妊娠期 1 月、3 月、5 月； 泌乳期 10 日、30、60 日、120 日；退化期 3 日、 7 日、21 日，共计 10 个时点。
2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象
• 荧光显微镜的缺点:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的同时采 集
OLYMPUS激光共聚焦显微镜说明0906
2， 技术特点 同类产品相比有如下技术特点和优势： 1）光学最小分辨为 0.12um,有实例为证。
2）测量的重复性为：3n-1=0.02um, 在同类产品中精度最高。 3）测量数据有权威机构认证，OLS4000 测量精度是由日本品质保证机构严格的追溯体系来 保证，可以提供高可靠性的测试数据。
1
4）光学放大倍数范围：108X---17280X, 108 倍：更宽的视野，可迅速找到测试部位； 17280 倍：突破光学显微镜的放大极限； 5）20X/50X/100X 物镜档次采用显微镜中最高档的―――平场复消色差物镜，
数值孔径（分辨率最高）最大，可以观察更大角度的斜面。
6） 迅速找到测试部位：在操作界面可轻松控制的 100 X 100mm 电动载物台，大画面高倍清 晰图像，小画面低倍宽视野定位图像，即使是在高倍观察时也不会迷路。
2
7） 便于操作，降低污染或破坏样品可能性的 6 孔电动物镜转盘
8） 多样化的观察方式 明场，明场微分干涉，激光共焦，激光共焦微分干涉
3
9） 可以克服同一画面内有不同反射率的双共焦光学系统
双共焦系统
10）
INR（智能降噪Biblioteka 演算方式11）内置减振机构，再不用配笨重的防振台
4
3， 检测内容 1）高分辨率二维形态观察，真实色 2 维观察； 2）高分辨率三维形貌观察，真彩三维形貌观察， 3）高精度测量：线宽，高度测量，线粗糙度，面粗糙度，面积，体积测量，几何测量，直 径/半径测量，圆周长，颗粒分析，膜厚测量等。
OLYMPUS 激光共聚焦显微镜-OLS4000
1， 主要性能指标
激光光源 物镜 光学放大倍率 观察范围 载物台 二维分辨率 Z 轴最小移动分辨率 X 轴方向测量重复精度 Z 轴方向测量重复精度 半导体激光器 (λ = 405 nm ) 5X / 10X 为 半复消色差物镜 20X / 50X / 100X 为 LEXT 专用复消色差物镜 108X-17280X 128X128 微米-2560X2560 微米 100X100mm 超声波电动载物台 0.12 m 0.01 m (光栅尺刻度为 0.0008 m) 3n-1=0.02 m (条件为使用 MPlanApo100 物镜) =0.012 m。 (条件为使用 MPlanApo100 物镜) 日本工业安全标准 2 级
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1
stage (before dividing into 2-cell embryo)
Differential Interference Contrast (DIC; Nomarski)
Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM)
1、LSCM的根本结构
荧光显微镜系统及样品台
激光光源
扫描器
图象存储及处理系统
控制
计算机控制系统
LSCM各局部相互关系示意图
共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较
激光扫描共聚焦显微镜 普通光学显微镜
激光光源 共轭聚焦原理和装置
场光源 干扰
计算机数字图象处理分析系统
照相
Light Microscopy
〔5〕、连续分光设计系统〔或其它光谱别离系统〕
〔6〕、光谱扫描功能 〔7〕、扫描速度及速度调节
〔8〕、扫描方式
XYZtλ任意组合 ①点扫描 ②线扫描 ③Xλ扫描 ④平面扫描
⑤XYλ、XZλ扫描 ⑥xyz, xyzt扫描 ⑦局部放大 扫描 ⑧光谱模式下，多通道同时扫描。
〔9〕、扫描旋转、光学放大〔变倍〕
OLYMPUS 尼Pe康rk（inEnlimkoenr)
高通量共聚焦显徽细胞图像 分析测定系统
GE Healthcare
时间分辨激光共聚焦显微成 像系统
德国耶莱公司
德国ZEISS激光共聚焦显微 镜
德国 ZEISS
德国ZEISS激光共聚焦显微 镜
德国ZEISS
型号
Pathway415、 Pathway435 800系列
1〕蛋白质、单糖和多糖探针； 2〕细胞器探针； 3〕核酸探针； 4〕细胞活性探针； 5〕膜和受体探针； 6〕细胞膜电位和细胞内pH探针； 7〕金属探针； 8〕分子的特殊基团结合探针； 9〕其他
Leica SP5 II激光扫描共聚焦显微镜使用说明书
Set up acquistion parameters and acquire an image1. Beam Path Settings in the central Work area: there are 3 ways toconfigure excitation and emission parametersA. use a preseti. click on Load/Save single settingii. select a Leica or User Settings (for multichannels, thedefault is simultaneous scan, see below for sequentialscan)B. reuse a setting from a previous scani. open a previous experimentii. in the Experiments tab, click to select the desirablescaniii. right-click to choose Apply Setting or hit Apply buttonat the bottomC. assemble from scratchi. set laser poweractivate the shutterset power level of the desirablelaser line, 5 % is a good startingpointii. select the beam splitter (dichroic)selections for different laser linesbeam splitter\laser line (nm)RT 30/70 for backscatter or reflectionSubstrateTD 488/561/633DD 458/514RSP 500DD 488/561spectra or details for the beam splitters are in the Appendix405✓✓458✓✓✓476✓✓✓✓488✓✓✓✓514✓✓561✓✓✓633✓✓iii. setup the detectorselect the emission band: drag the lower and upper bounds or double click the slider to enter the begin and end wavelengthsCaution : Drag the sliders slowly or else they will jam!click on PMT n to adjust PMT Gain* and Offset*; good starting values are 800 and 0,respectivelyselect a LUT as default activate the PMT2. select the Acquire Operating step on top left, click the Acquisition tab to set up the data formatA. Acquisition mode paneldefaults to xyz simultaneous scan seq. button enables sequential scan Tile scan, and Mark and Find Best Focustop left side of the viewer display Window: activate the Glow (OU) LUT via the Quick LUT button which cycles through the default , Glow (OU) , and grey LUTsii. adjust offset so the pixels in the area you think should be darkest just turn green,click the button on Acquistion Mode on the upper left to open the Sequential Scan panelclick to toggle displaying the Tile Scan windowgo Livemove the prep/stage to the left boundary of the region of interest, focusclick to mark the current positionrepeat the last 2 steps for the top, right, and bottom boundries, the software will calculate theMark and Findclick to toggle displaying the Mark and Find windowif there are existing coordinates, you can save or clear them firstmove the prep/stage to the desirable area and focus on the object of interestclick to mark the current position, which will be listed as positionNrepeat the above 2 steps to mark more positions as needed, i.e., positionN+1, N+2... etc.you can go back to any position by selecting it from the drop down listAppendixContentDMI 6000 inverted microscope: basic controls • modes of operation • using immersion objectives beam splitter spectra • working with lif files • scannersoft ware ov erv iew and layoutLAS AF user int erfaceDMI 6000 inv ert ed microscopeCont rolsfocus knob on either side of microscope (z-Wide)commonly used functions are controlled by 5 sets of buttons1. left rear variable function buttonsCHG TL ◑: switch to transmitted light, TL and rotate through different modes TL_BF(bright field), _DIC, _POL (polarization)CHANGE CS: toggle between confocal SCAN and the last selected TL modeCOMBI ◑: epifluorescent + DICZ COARSE Z FINE: toggle z control2. left front: Illumination ManagerTL/IL: toggle between TL and IL(incident-light i.e., epifluorescence)AP: aperture diaphragm for TLINT : light intensity, press both togetherto toggle between Coarse and Fine modeFD: field diaphragm for IL3. fronttop row switches should not be activated,or else it may block viewing through thebinocular, to rectifypress the leftmost button to selectbinocularpress the rightmost button todeselect the supplementalmagnification changerSHUTTER: for epifluorescentilluminationbottom 6 buttons: for selecting specific cube (DAPI, GFP, DsRed) for epifluorescence;press the middle 2 buttons together to display the programs assigned to the variablefunction buttons4. right rear variable function buttonsCHGOBJ ↻: rotates the objective turret oneposition clockwise in the current mode (dry orimmersion)CHGOBJ ↺: same as above butcounterclockwiseDRY/IMM: toggles between dry and immersionmode5. right front: Focus buttonsZ ↑: moves the Z drive up when a upper focus stop hasbeen setZ ↓: moves the Z drive downSET + Z ↑: toggles set and unset upper focus stopSET + Z ↓: toggles set and unset lower focus stopSmartMove remote control for stage movements, as observed in theviewer display window of the software1. X2. Y3. Z (focus, z-wide)4. left button set selects Precise or Fast XY movement5. right button set selects FINE or COARSE focus controlfront LCD panel displays the current status1. Contrasting method e.g., TL, FLUO, orSCAN; and IL SHUTTER status2. Objective lens and Magnification, see fronttop buttons above3. Illumination and Apertures4. Camera Ports/Eyepieces, see front topbuttons above5. Focus controlNote:display on the right shows z at0 µm with upper focus stop set andlower focus stop unsetif upper focus stop is unset, display will indicate --.-- mm andindicates lower focus stop is setModes of operat ionTL1. press CHG TL ◑ to rotatethrough BF, DIC, and POL2. adjust intensity (INT) andaperture (AP) as needed3. optional, press CHG CS toscan mode thus shutofftransmitted light4. a knurled wheel (arrowhead)on the left side below theobjective turret adjusts theDIC shear; it's a rather tightspace!IL/epifluorescence1. turn on FLUO (fluorescent light source)2. press the button for the desirable cube, see the front buttons in Controls3. press Shutter to illuminate specimen4. adjust the intensity (INT) and field diaphragm (FD) as needed5. press Shutter to block illumination when done viewinglocate the area of interest with a dry objective and focusclick to bring up the Mark and Find interfaceclick to record the current position: positionNpress and hold Z ↓ to lower the turret completelyobjective to focusclick to dismiss the Mark and Find interface manual (not recommended)TD 488/561/633DD 458/514 is similar to the TD 458/514/594shown hereDD 488/561beam split t er spect raRT 30/70 is 30% reflection and 70% transmissionSubstrate is just plain glass (50/50)RSP 500 is a 500 nm long pass filterTD and DD are triple and double dichroics (transmission bands in blue)working wit h lif fileuse ImageJ and Bio-Formats plugins, see details on using ImageJuse the free Leica LAS AF Lite application from Leica's ftp depository , Windows only scannerdwell time at several common scan speed settingsline frequency (Hz)horizontal scan duration (s)dwell time (µs)max min100.184.949.71000.018.5 5.04000.025 2.1 1.26000.0017 1.40.810000.0010.90.5。
激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书
激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书[激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书]引言：本操作指南为用户提供激光扫描共聚焦显微镜的详细操作流程及相关注意事项。
在使用本设备之前，请仔细阅读本指南，以确保能够正确、安全地操作设备，并获得最佳的成像效果。
一、设备介绍激光扫描共聚焦显微镜是一种先进的显微镜技术，结合了共聚焦成像和激光扫描技术，可以实现高分辨率、三维成像及活细胞观察等功能。
本设备由以下主要部分组成：1. 共聚焦显微镜主体：包括光源系统、光学系统、扫描系统、探测器等核心部件。
请勿对主体进行任何未经授权的拆卸或修改。
2. 控制系统：用于控制设备的开关、成像参数设置、图像采集及处理等功能。
在操作设备之前，请确保控制系统处于正常工作状态。
二、准备工作在操作激光扫描共聚焦显微镜之前，请进行以下准备工作：1. 检查设备：确保设备的电源线、信号线、光纤等连接线路良好，无损坏或松动情况。
2. 准备标本：根据需要观察的样本类型，准备适当的标本片，并在标本片上施加适当的荧光染料。
3. 调整镜片：根据需要选择适当的镜头，并按照设备说明进行安装和调整。
三、操作步骤以下为基本的操作流程，具体步骤可能会因设备型号和厂家而有所不同，请根据实际情况进行操作：1. 打开设备电源：将电源开关置于“开启”位置，待设备启动完全后，检查设备各部分是否正常。
2. 设置成像参数：通过控制系统，设置激光波长、放大倍数、成像模式等参数。
根据标本类型及观察需求，合理选择参数设置。
3. 校准镜片：根据设备说明书，进行扫描头和标本之间的焦距调整，保证成像过程中的清晰度和准确度。
4. 开启激光：根据标本需要，选择相应的激光波长，并逐一打开相应激光。
5. 定位标本：通过显微镜目镜进行初步观察，调整位置和焦距，使标本位于成像区域。
6. 开始扫描成像：在控制系统中选择扫描图像模式，点击“开始扫描”按钮，启动扫描成像过程。
7. 图像采集和处理：根据需要，可设置图像采集的帧数、分辨率等参数，并在采集图像后进行必要的图像处理和分析。
激光扫描共聚焦显镜2010-11-28
六、激光扫描共聚焦显微镜技术教学实验
1、激光扫描共聚焦显微镜系统的结构、开发机 操作及注意事项；（由负责LSCM的曹老师给学 生讲解） 2、激光共聚焦显微镜观察细胞核和线粒体膜的定 位；（为学生实验，由代课老师指导操作 1、取悬浮培养的对数生长期L1210细胞（密度约为：1×106个细胞/mL）; 2、离心收集（2500rpm/min，5min），弃上清； 3、0.01M （pH为7.0左右）的PBS洗细胞两次(2500rpm/min，5min) 弃上清； 4、用500µL的PBS重悬细胞，加入1µL的线粒体荧光探针（罗丹明123）（终浓度为5 µg/mL）， 轻轻吹匀，37℃，避光孵育20min; 5、PBS洗两次，弃上清； 6、再用100µL的PBS重悬细胞，加入1µL的活细胞核荧光染料Hoechst 33324（终浓度为1 µg/mL ）；室温，避光孵育10min; 7、PBS洗两次，弃上清，用50µL左右的PBS重悬细胞； 8、滴片（20µL），激光共聚焦显微镜下观察。
图 显示 LSCM的结构示意图
四、LSCM的基本功能
（1）多荧光探针标记样品高清晰度、高分辨率图像的采集； （2）无损伤连续光学切片图像的采集— 显微“CT”； （3）三维图像重建； （4） 时间序列扫描： XYt 、XYZt 和 Xt 扫描，通常指共聚显微镜系统沿着时间轴对活体细胞和活体组 织内被标记物变化的动态跟踪； (5) 感兴趣区域的扫描； （6）定位、定量测定； （7）图像处理。
3、动态观察 在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、 和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用LSCM观察心肌 或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或pH的动态变化。 4、数据、图像的数字化 用计算机代替了普通的照相机,得到的图像是数字化的,可及时输 出或长期储存,而且还可进一步加工处理。 5、定量测量 首先应用专一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测 成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光 强度值,可得出特定成分的含量比。
激光扫描共聚焦显微镜
荧光与透射光同时成像
动态观测
• 激光共聚焦显微镜的一大特点就是可以对 活细胞进行连续扫描，实现实时动态观测 。这样可记录细胞在外界某种条件的刺激 下瞬时发生的变化。
• 常用的有检测细胞内游离Ca 离子变化、细 胞内PH值变化，等等。
Ca离子动态检测
• 荧光染料：Fluo-3AM。 • 此染料可特异性标记细胞内游离Ca离子，
多色荧光标记检测
普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光， 要观测多种荧光标记的样品需要多次观测 ，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以 多激光多通道同时扫描，多通道同时探测 。
绿色：SYBR 14染色，活精子 红色：PI染色，死精子
牛精子
绿色：MitoTracker Green
紫色：Hoechst 33342
荧光强度
分层扫描（切片扫描）
• 按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小
，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中 相当薄的一层被探测到，而其他层面不影 响成像。
分层扫描（切片扫描）
• 当观测较厚样品时，普通透射光不能透过 样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方 法来观测。
发射光
入射光 被检测层面
整个样品 白光（不能透过）
• 利用专用图象处理软件，还可以实现其他 许多数据分析。
分层扫描（切片扫描）
GFP与PE双色标记3D扫描
细胞“CT”片
3D模拟
Z轴分析
植物切片三维重建
细胞测量
周长
面积
长度
常用荧光探针介绍
细胞活性探针 细胞器探针 细胞骨架探针 核酸探针 细胞内离子探针
细胞活性探针
• 活细胞探针：吖叮橙（AO）
BacLight
Bacterial Viability Kit
激光扫描共聚焦显微镜操作说明书
激光扫描共聚焦显微镜操作说明书操作说明书激光扫描共聚焦显微镜是一种高端的显微镜设备，具有高分辨率、高灵敏度的特点，广泛用于生物学、医学、材料科学等领域。
为了正确且有效地操作激光扫描共聚焦显微镜，本操作说明书将为您提供详细的指导。
一、设备介绍激光扫描共聚焦显微镜由以下主要部分组成：1. 显微镜主体：负责接收样本的光信号，并进行扫描成像。
2. 激光系统：提供高能量、高稳定性的激光光源，用于激发样本的荧光信号。
3. 探测系统：用于接收样本的荧光信号，并将其转化为图像信号。
4. 控制系统：提供对显微镜参数进行调节和设置的功能。
二、注意事项在操作激光扫描共聚焦显微镜之前，请确保您已熟悉以下注意事项：1. 安全操作：激光光源具有较强的激光辐射，请佩戴适当的激光防护眼镜并避免直接暴露于激光光束下。
2. 样本准备：样本应事先处理好并放置在适当的载玻片上，确保样本表面平整，避免气泡或杂质的干扰。
3. 导入样本：轻轻将载玻片插入显微镜主体的样本台中，并用调节旋钮精确定位样本。
4. 参数设置：根据实验需要，设置合适的激光功率、放大倍数和扫描速度等参数，确保获得清晰的图像。
5. 镜头清洁：定期清洁显微镜镜片，避免灰尘或污渍影响成像质量。
注意使用专用的镜头清洁纸和清洁液。
三、操作步骤基于激光扫描共聚焦显微镜的特点，以下为一般操作步骤的指导：1. 打开设备电源，等待设备启动并进行自检。
2. 调节放大倍数：通过显微镜主体上的放大调节旋钮，调节适当的放大倍数，以便观察到合适大小的图像。
3. 确定激光功率：在控制系统中，设置合适的激光功率以激发样本的荧光信号，避免过高的功率导致样本损伤。
4. 调整扫描速度：通过控制系统中的扫描速度调节器，设置合适的扫描速度，以获得清晰且稳定的图像。
5. 对焦样本：使用显微镜主体上的对焦调节旋钮，将样本调焦至最清晰状态。
6. 开始扫描：通过控制系统中的扫描启动按钮，启动扫描功能，并观察图像显示区域是否居中和清晰。
激光扫描共聚焦显微镜操作手册
激光扫描共聚焦显微镜（A1R-si）操作指南目录第一章：Ti-E 显微镜操作2-7 显微镜光路调节和照明注意事项 6Ti-E 物镜，DIC 插片，DIC 棱镜对照表7第二章：共聚焦开关机8-10 第三章：共聚焦图像拍摄1-38NIS-Elements C 软件开启和操作界面简介1-15NIS-Elements C 的实时图像获得基本操作16-23图像拍摄24-27探测模式（标准探测器）设置28-38 第四章: 图像的保存和查看39-42 第五章：图像分析43-46 附件一、多维拍摄功能和操作方式介绍47-51附件二：图像格式批量转换操作52-53第一章Ti-E 显微镜操作指南（一）认识显微镜各个部件（1）滤光片：包括D---毛玻璃；NCB---色温（8）滤色块转盘（包括DIC 检偏器）；平衡片；ND---减光片；“G IF”---绿色滤（9）手动荧光光闸；光片和用于PFS 的红外滤光片；（10）电动焦距调节旋钮；（2）视场光阑；（11）ND 减光片；（3）聚光器升降旋钮；（12）遥控器；（4）起偏器（DIC 用）；（13）透射光电源；（5）聚光器对中旋钮；（14）汞灯荧光光源；（6）孔径光阑；（15）PFS 控制器（7）聚光器模块（包括明视场，DIC）；（16）HUB 控制器遥控器示意图(根据具体配置有些图标可能不显示)1）物镜切换按钮；2）滤光块，DIC 检偏器切换按钮；3）DIC 检偏器快速切换按钮；4）光路端口切换按钮；5）PFS 开关控制按钮；6）聚光器转盘切换按钮；7）透射光源控制按钮*。
*请注意：CNTL 按钮灯亮，则可以通过遥控器或电脑控制软件来调节透射光源强度，此时显微镜底座左侧光源开关和调节旋钮锁定；CNTL 功能关闭，可以通过显微镜底座开关和旋钮来控制透射光源。
前面板示意图1）状态显示屏；2）PFS 开关按钮和PFS 聚焦状态指示灯（需要选购PFS 部件）；3）光路端口切换按钮；4）中间变倍旋纽；侧面板示意图1）调焦旋钮2）粗微调切换按钮3）物镜切换按钮；4）滤光块，DIC 检偏器切换按钮5）透射光光源开关（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此按钮无效）；6）透射光量度调节旋钮（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效）；7）物镜复位；8）物镜向下移动2 毫米；注意：在使用显微镜之前，要把主机底座右后端的黑色HUB 控制器（显微镜示意图15 位置）右侧的电源开关打开。
激光扫描共聚焦显微镜
扫描速度慢
相对于传统的显微镜， 激光扫描共聚焦显微镜 的扫描速度较慢，需要 更长的时间来获取图像。
荧光衰减
荧光染料在长时间的光 照下会逐渐衰减，影响 图像的质量。
改进方向
降低成本
通过改进技术和降低制造成本，使更多 的实验室和研究机构能够使用激光扫描
共聚焦显微镜。
发展多色成像技术
利用多色荧光染料或光谱分离技术实 现多色成像，以便同时观察多个标记
物或细胞成分。
提高扫描速度
研究更快的扫描技术和算法，提高图 像的获取速度。
增强自动化和智能化
开发自动化和智能化的操作系统，减 少人工干预和操作时间，提高实验效 率。
05 激光扫描共聚焦显微镜与 其他显微镜的比较
传统显微镜
光源
传统显微镜使用普通光源，如灯泡或反射镜，提供均匀照明。
分辨率
受限于光的衍射极限，传统显微镜的分辨率相Байду номын сангаас较低。
其他现代显微技术
原子力显微镜（AFM）
01
利用原子间相互作用力进行成像，适用于表面形貌和物理性质
的测量。
扫描隧道显微镜（STM）
02
利用量子隧穿效应进行成像，适用于表面电子结构的测量。
光学 tweezers 技术
03
利用光束操纵微小粒子，实现细胞和分子水平的操控和观察。
06 激光扫描共聚焦显微镜的 未来发展与展望
激光扫描共聚焦显微镜
目录
• 激光扫描共聚焦显微镜简介 • 激光扫描共聚焦显微镜技术原理 • 激光扫描共聚焦显微镜操作流程 • 激光扫描共聚焦显微镜优缺点 • 激光扫描共聚焦显微镜与其他显微镜的比
较 • 激光扫描共聚焦显微镜的未来发展与展望
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)
2）细胞膜用 NBDPC染色（绿），
3）线粒体用 Mitotracker标记 （红）
如何改善图像质量
1、“更多信号！”
1）、 通过减慢扫描速度 2）、 使用“平均”方法 3）、 增加发射滤镜的带宽 4）、 加大针孔直径； 注意：光学切片的厚度也会相应地增大。 5）、 增大激发能（激光功率）； 注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。
2、“更多细节！”
1）、使用较高数值孔径 (NA) 的物镜 2）、增加“帧大小” = 每条线的像素值 + 每帧的线条数 3）、优化扫描焦距 (Z) 4）、增加动态范围
3、“更可靠！”
1）、使用多轨 2）、提供预定义配置。 3）、可同时定义和使用任何形状的多个研 究区。
Cultured cells, multiple fluorescence
原理 优缺点
激光共聚焦显微镜的基本结构
扫描系统
（1）、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和显微 镜相连，与所接显微镜一体化设计
（2）、检测器数量 （3）、共聚焦针孔
50-300微米
（4）、扫描分辨率及灰度级
（5）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）
（6）、光谱扫描功能 （7）、扫描速度及速度调节
1）蛋白质、单糖和多糖探针； 2）细胞器探针； 3）核酸探针； 4）细胞活性探针； 5）膜和受体探针； 6）细胞膜电位和细胞内pH探针； 7）金属探针； 8）分子的特殊基团结合探针； 9）其他
（三）仪器使用步骤
（1）、选择激光器类型 （2）、选择相应的滤片 （3）、根据实验目的选择适当软件 （4）、按软件要求设置有关参数，进行观 察和分析。
仪器名称
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显微CT与三维重组
11
3D reconstruction
12
三.动态测量
游离Ca2+, Mg2+ 、K+、Na+测量
pH值的检测 ?自由基的检测
13
?相对 测量
Channel 1
Int.
160.00
120.00
80.00
40.00
0.00 200.00
Channel 2
Int. 80.00
2
Fluorescent Microscope Confocal Microscope
Arc Lamp
Laser
Excitation Diaphragm Excitation Filter
Ocular
Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Objective
Objective
18
荧光共振能量转移（ FRET）技术
? 生物大分子结构和功能研究
? 免疫分析 ? 核酸杂交分析 ? 蛋白质间相互作用研究
D
A
D
A
r >2R0
r <2R0
r: 分子间距离 R0: 分子间发生50%能量转移的距离
19
?检测 以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出 FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。
? 荧光显微镜的缺点:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的 同时采集
2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作. 5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度. 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠
?序列的扫描测量
? F/F=(F-F base )/(Fbase -FBG)
14
四.细胞膜电位的测量
标记膜电位探针(慢反应）：
JC1
510nm
530/590nm
Dioc5(3)
548nm
573nm
Dioc6(3)
484nm
快反应探针：
500nm
Di-4-ANEPPS 496nm
703nm
Di-4-ANEPPS 498nm 细胞膜静息膜电位： -70mV
5
激光共聚焦显微镜的应用
? 单、双、三 ,四色标记检测。 ? 精确的一、二、三、四维观察。 ? 高品质的荧光成像、透射成像、物体表面
反射成像。 ? 静态和动态观察 (CA2+,pH,膜电位,膜流动
性等)。 ? 定性以及定量分析。 ? 光谱扫描,ROI扫描. ? 特殊的光反应 (FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED
激光扫描共聚焦显微技术
Laser scanning confocal microscopy
?
1
激光扫描共焦显微镜的设计特点: ? 1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole ? 2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共
焦点即被探测点，被探测点所在的平面为 共焦平面 ? 3.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 ? 4. 激光作为光源 ? 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探 测多个被标记物
Emission Filter
Emission Pinhole Filter
3
人眼分辨率：
0.2mm
光学显微镜分辨率：0.25mm
电子显微镜分辨率：0.2nm
共焦显微镜分辨率：0.18mm
4
? 电子显微镜的缺点：
1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难. 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象
等)。
6
激光共聚焦显微成像技术的应用
单标，双标和三标图像
明场，DIC, 相差和透射光图像
出色的反射光图像
时间分辨和快速扫描动态图像
7
一.定位、定量
?免疫荧光标记（单标、双标或三
标）的定位、定量
如：细胞膜受体或抗原的分布，
微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与
共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化
Time
Recovery of fluorescence
Zero time
10 seconds
FRAP( Fluorescence recovery after photobleaching)原理
30 seconds
16
荧光光漂白后的回复： FRAP ? 生物膜脂质分子的侧向扩散； ? 胞间通讯的研究； ? 胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等 ? 细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。
?细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位杂交-fitc + PI
?荧光原位杂交： 染色体基因定位
?单细胞凝胶电泳
?GFP的表达
?活细胞或活体组织静息游离Ca2+ 的分布与定量
?活细胞内pH的定定量
8
Immuno-fluorecence label
713nm
线粒体膜电位：-150mV
以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针
15
? 五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after
photobleaching ）
%F
Intense laser Beam
Bleaches Fluorescence
Hela green- 中心体 red- 纺锤体
9
二.光学切片和三维重组
光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能 ，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机 图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维 效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的 空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的 关系。
60.00
40.00
20.00
0.00 200.00
Physiology Chart (Time: 11:40:49)
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
?程序化测量：用timelapse 中的编程按钮可进行不同时间
17
六．荧光能量共振转移 ( fluorescence Resonance Energy Transfer)
能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递， 或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能 量供体，能量的接受者叫能量受体。
荧光能量共振转移的条件 ?两个荧光分子：供体-FL1 ，受体-FL2 ?供体与受体的距离在2-7nm ?供体的发射波长与受体的激发波长一致