激光扫描共聚焦显微镜参考文档
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2
Fluorescent Microscope Confocal Microscope
Arc Lamp
Laser
Excitation Diaphragm Excitation Filter
Ocular
Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Objective
Objective
?细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位杂交-fitc + PI
?荧光原位杂交： 染色体基因定位
?单细胞凝胶电泳
?GFP的表达
?活细胞或活体组织静息游离Ca2+ 的分布与定量
?活细胞内pH的定量、膜电位的测量
?活细胞内自由基水平的定量
8
Immuno-fluorecence label
17
六．荧光能量共振转移 ( fluorescence Resonance Energy Transfer)
能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递， 或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能 量供体，能量的接受者叫能量受体。
荧光能量共振转移的条件 ?两个荧光分子：供体-FL1 ，受体-FL2 ?供体与受体的距离在2-7nm ?供体的发射波长与受体的激发波长一致
713nm
线粒体膜电位：-150mV
以源自文库均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针
15
? 五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after
photobleaching ）
%F
Intense laser Beam
Bleaches Fluorescence
激光扫描共聚焦显微技术
Laser scanning confocal microscopy
?
1
激光扫描共焦显微镜的设计特点: ? 1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole ? 2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共
焦点即被探测点，被探测点所在的平面为 共焦平面 ? 3.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 ? 4. 激光作为光源 ? 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探 测多个被标记物
18
荧光共振能量转移（ FRET）技术
? 生物大分子结构和功能研究
? 免疫分析 ? 核酸杂交分析 ? 蛋白质间相互作用研究
D
A
D
A
r >2R0
r <2R0
r: 分子间距离 R0: 分子间发生50%能量转移的距离
19
?检测 以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出 FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。
Hela green- 中心体 red- 纺锤体
9
二.光学切片和三维重组
光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能 ，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机 图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维 效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的 空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的 关系。
10
显微CT与三维重组
11
3D reconstruction
12
三.动态测量
游离Ca2+, Mg2+ 、K+、Na+测量
pH值的检测 ?自由基的检测
13
?相对 测量
Channel 1
Int.
160.00
120.00
80.00
40.00
0.00 200.00
Channel 2
Int. 80.00
? 荧光显微镜的缺点:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的 同时采集
2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作. 5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度. 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠
5
激光共聚焦显微镜的应用
? 单、双、三 ,四色标记检测。 ? 精确的一、二、三、四维观察。 ? 高品质的荧光成像、透射成像、物体表面
反射成像。 ? 静态和动态观察 (CA2+,pH,膜电位,膜流动
性等)。 ? 定性以及定量分析。 ? 光谱扫描,ROI扫描. ? 特殊的光反应 (FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED
Emission Filter
Emission Pinhole Filter
3
人眼分辨率：
0.2mm
光学显微镜分辨率：0.25mm
电子显微镜分辨率：0.2nm
共焦显微镜分辨率：0.18mm
4
? 电子显微镜的缺点：
1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难. 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象
?序列的扫描测量
? F/F=(F-F base )/(Fbase -FBG)
14
四.细胞膜电位的测量
标记膜电位探针(慢反应）：
JC1
510nm
530/590nm
Dioc5(3)
548nm
573nm
Dioc6(3)
484nm
快反应探针：
500nm
Di-4-ANEPPS 496nm
703nm
Di-4-ANEPPS 498nm 细胞膜静息膜电位： -70mV
Time
Recovery of fluorescence
Zero time
10 seconds
FRAP( Fluorescence recovery after photobleaching)原理
30 seconds
16
荧光光漂白后的回复： FRAP ? 生物膜脂质分子的侧向扩散； ? 胞间通讯的研究； ? 胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等 ? 细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。
60.00
40.00
20.00
0.00 200.00
Physiology Chart (Time: 11:40:49)
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
?程序化测量：用timelapse 中的编程按钮可进行不同时间
等)。
6
激光共聚焦显微成像技术的应用
单标，双标和三标图像
明场，DIC, 相差和透射光图像
出色的反射光图像
时间分辨和快速扫描动态图像
7
一.定位、定量
?免疫荧光标记（单标、双标或三
标）的定位、定量
如：细胞膜受体或抗原的分布，
微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与
共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化
Fluorescent Microscope Confocal Microscope
Arc Lamp
Laser
Excitation Diaphragm Excitation Filter
Ocular
Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Objective
Objective
?细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位杂交-fitc + PI
?荧光原位杂交： 染色体基因定位
?单细胞凝胶电泳
?GFP的表达
?活细胞或活体组织静息游离Ca2+ 的分布与定量
?活细胞内pH的定量、膜电位的测量
?活细胞内自由基水平的定量
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Immuno-fluorecence label
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六．荧光能量共振转移 ( fluorescence Resonance Energy Transfer)
能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递， 或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能 量供体，能量的接受者叫能量受体。
荧光能量共振转移的条件 ?两个荧光分子：供体-FL1 ，受体-FL2 ?供体与受体的距离在2-7nm ?供体的发射波长与受体的激发波长一致
713nm
线粒体膜电位：-150mV
以源自文库均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针
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? 五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after
photobleaching ）
%F
Intense laser Beam
Bleaches Fluorescence
激光扫描共聚焦显微技术
Laser scanning confocal microscopy
?
1
激光扫描共焦显微镜的设计特点: ? 1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole ? 2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共
焦点即被探测点，被探测点所在的平面为 共焦平面 ? 3.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 ? 4. 激光作为光源 ? 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探 测多个被标记物
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荧光共振能量转移（ FRET）技术
? 生物大分子结构和功能研究
? 免疫分析 ? 核酸杂交分析 ? 蛋白质间相互作用研究
D
A
D
A
r >2R0
r <2R0
r: 分子间距离 R0: 分子间发生50%能量转移的距离
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?检测 以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出 FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。
Hela green- 中心体 red- 纺锤体
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二.光学切片和三维重组
光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能 ，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机 图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维 效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的 空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的 关系。
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显微CT与三维重组
11
3D reconstruction
12
三.动态测量
游离Ca2+, Mg2+ 、K+、Na+测量
pH值的检测 ?自由基的检测
13
?相对 测量
Channel 1
Int.
160.00
120.00
80.00
40.00
0.00 200.00
Channel 2
Int. 80.00
? 荧光显微镜的缺点:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的 同时采集
2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作. 5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度. 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠
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激光共聚焦显微镜的应用
? 单、双、三 ,四色标记检测。 ? 精确的一、二、三、四维观察。 ? 高品质的荧光成像、透射成像、物体表面
反射成像。 ? 静态和动态观察 (CA2+,pH,膜电位,膜流动
性等)。 ? 定性以及定量分析。 ? 光谱扫描,ROI扫描. ? 特殊的光反应 (FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED
Emission Filter
Emission Pinhole Filter
3
人眼分辨率：
0.2mm
光学显微镜分辨率：0.25mm
电子显微镜分辨率：0.2nm
共焦显微镜分辨率：0.18mm
4
? 电子显微镜的缺点：
1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难. 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象
?序列的扫描测量
? F/F=(F-F base )/(Fbase -FBG)
14
四.细胞膜电位的测量
标记膜电位探针(慢反应）：
JC1
510nm
530/590nm
Dioc5(3)
548nm
573nm
Dioc6(3)
484nm
快反应探针：
500nm
Di-4-ANEPPS 496nm
703nm
Di-4-ANEPPS 498nm 细胞膜静息膜电位： -70mV
Time
Recovery of fluorescence
Zero time
10 seconds
FRAP( Fluorescence recovery after photobleaching)原理
30 seconds
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荧光光漂白后的回复： FRAP ? 生物膜脂质分子的侧向扩散； ? 胞间通讯的研究； ? 胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等 ? 细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。
60.00
40.00
20.00
0.00 200.00
Physiology Chart (Time: 11:40:49)
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
?程序化测量：用timelapse 中的编程按钮可进行不同时间
等)。
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激光共聚焦显微成像技术的应用
单标，双标和三标图像
明场，DIC, 相差和透射光图像
出色的反射光图像
时间分辨和快速扫描动态图像
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一.定位、定量
?免疫荧光标记（单标、双标或三
标）的定位、定量
如：细胞膜受体或抗原的分布，
微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与
共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化