益气活血方对肝星状细胞LX-2增殖和凋亡的影响

益气活血方对肝星状细胞LX-2增殖和凋亡的影响

马力天;李洁;张毅;任秦有;丁井永;赵参军;杜江河;李佩;毛立挺

【摘要】目的探讨中药“复方益气活血方”(Yiqihuoxue prescription)对肝星状细胞LX-2增殖和凋亡的影响.方法体外培养肝星状细胞LX-2,浓度分别为

1.125,

2.228,

3.31,

4.37,

5.41 mg/ml益气活血方作用于LX-2细胞24h,48h,然后用MTT比色法检测细胞的增殖情况,选取合适的益气活血药物浓度

(1.125,2.228,6.432 mg/ml)用流式细胞术检测益气活血药作用24 h后对LX-2细胞凋亡的影响.结果①MTT检测结果显示,不同浓度的益气活血方用于LX-2细胞24h和48h后,能够抑制LX-2细胞增殖(P＜0.05),24h抑制率随药物浓度的增加而提高.48 h时,当药物浓度达到3.31 mg/ml后,其抑制作用不随药物浓度的增加而增强(P＞0.05).②流式细胞术检测显示,益气活血方(浓度分别为1.125,2.228,6.432 mg/ml),可明显促进LX-2细胞凋亡.结论益气活血方能抑制LX-2细胞的增殖,促进LX-2细胞凋亡,其抑制作用呈时间-剂量依赖性.

【期刊名称】《山西医科大学学报》

【年(卷),期】2015(046)006

【总页数】4页(P528-531)

【关键词】益气活血方;LX-2细胞;增殖;凋亡

【作者】马力天;李洁;张毅;任秦有;丁井永;赵参军;杜江河;李佩;毛立挺

【作者单位】解放军68222部队营卫生所,陇西748000;第四军医大学唐都医院中医科暨中西医结合肿瘤科;解放军451医院内分泌科;第四军医大学唐都医院中医科暨中西医结合肿瘤科;第四军医大学唐都医院中医科暨中西医结合肿瘤科;第四军医

大学唐都医院中医科暨中西医结合肿瘤科;第四军医大学唐都医院中医科暨中西医

结合肿瘤科;解放军68313部队卫生队;解放军68222部队卫生队;解放军68222

部队卫生队

【正文语种】中文

【中图分类】R575

肝纤维化(liver fibrosis，LF)是肝内结缔组织的异常增生，导致肝内弥漫性细胞外

基质过度沉淀的病理过程，是许多慢性肝病发生发展过程中的重要特征，如肝细胞癌［1］和肝硬化［2］。多种原因可以导致LF的发生，如病毒感染、乙醇摄入、肝内脂肪沉积、糖尿病、毒物等［3，4］。肝纤维化的特征是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积。肝纤维化的发病机制非常复杂，目前主要认为肝星形细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活，转化为成肌纤维细胞和成纤维细胞［5-8］，合成分泌大量ECM在LF的发病过程中起了主要作用。肝纤维化是一种可逆的损伤修复反应［9］。HSC的激活是本病发展的中心环节，因此，主要在以下几个方面进行肝纤维化的治疗:①去除原发病因;②围绕HSC进行治疗，如通过抑制PDGF和TGF-β来抑制HSC的活化、直接抑制HSCs的活性和抑制ECM的合成和分泌等。但是由于肝纤维化发病原因极其复杂，西药在治疗方面效

果并不理想且费用昂贵。而祖国医学在这方面有其独特的优势，不仅有价格优势，而且不良反应较少。

根据其临床表现，属于中医“积聚”等病症范畴，大量的研究表明［10-12］，中药在治疗本病方面有疗效好，且毒副作用小的优势。因此，我们选择中药复方益气活血方(Yiqihuoxue prescription)，以人肝星状细胞LX-2为靶细胞，用MTT法

观察不同剂量药物对其增殖的影响，用流式细胞术观察药物对细胞凋亡的影响，体

外研究其对LX-2细胞的抑制作用，为进一步研究其导致LX-2细胞凋亡的机制提

供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

MTT试剂(晶彩生物有限公司)、Bio-rad酶联免疫检测仪、DMEM高糖培养基(Gibco公司，美国)、四季青胎牛血清。LX-2细胞由第四军医大学细胞工程学研

究中心边惠洁教授赠予，美国 Bection Dickinson公司流式细胞仪，750 g多功

能粉碎机、渗滤柱、旋转蒸发仪、循环水式多用真空泵。

1.2 LX-2细胞的培养及传代

将LX-2细胞培养在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的细胞孵箱中，每天换液1次。在倒

置显微镜下观察细胞密度为80%-90%时，以胰酶37℃消化2-3 min传代。

1.3 实验药物的制备

精选黄芪15 g、人参10 g等益气药物，莪术15 g、当归10 g等活血药物共17

味中药组成复方益气活血方(购自西安市诚信药材行)。

制备过程:(1)提挥发油:①用750 g多功能粉碎机将益气血活血方中当归、莪术，过1号筛，直至全部粉碎完毕。②先将益气活血方中当归、莪术按1∶1的比例加入

渗滤柱中，第1次加入1 500 ml的石油醚，以60滴/min的速度开始滴，直至滴完，然后再加入2次石油醚，每次500 ml，以同样的滴速滴完;③将渗滤出的石油醚+药油装入1 000 ml的烧瓶中，每次500 ml，用旋转蒸发仪进行蒸发，直至石油醚全部回收完成，将留下的挥发油装入玻璃瓶中，密闭备用;④将渗滤柱中的药

粉倒出，使石油醚挥发完毕，干药粉保存备用。(2)熬药:每剂250 g加水500 ml，按传统煎药法文火煎煮30 min取药液，以恒温水浴锅浓缩成含生药1.25 g/ml的汤剂，真空包装，4℃冰箱保存。以上工作由第四军医大学唐都医院药剂科中药制

作车间完成。

1.4 药物浓度的选择及稀释

一个60 kg的病人，其体液量占总重量的20%，即12 L，熬成的药物浓度为:1.25 g/ml，按照成年人每天服用50 ml计算，假定全部吸收，则其体内药物浓度

为:(50 × 1.25)/12 000=5.21 mg/ml，但是药物不可能被全部吸收，所以在我们进行MTT实验时，选择药物浓度略低于5.21 mg/ml，因此选择的药物浓度为1.125，2.228，3.31，4.37，5.41 mg/ml。在用流式细胞术检测细胞凋亡时，选择药物浓度为1.125，2.228，6.432 mg/ml。

由于1.25 g/ml的药物很黏稠，所以在加药时要进行稀释，其稀释方法为:将100 μl的益气活血药物溶于1 000 μl的培养基中(含10%FBS和双抗)，稀释后药物浓度为113.63 mg/ml。药物稀释后，用0.22 μm孔径的滤器对其进行过滤除菌。

1.5 MTT法检测LX-2细胞的增殖情况

对数生长期的LX-2细胞，胰酶消化后，1 000 r/min离心5 min，用高糖DMEM(含10%胎牛血清)将细胞浓度调为5×104 cell/ml细胞悬液后，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100 μl(即每孔5 000个细胞)，放在37℃、5%CO2的细胞培养箱中，待细胞贴壁长至底面积的50%后，更换培养基，并且每孔分别加入过滤后的益气活血药物，使终浓度达到1.125，2.228，3.31，4.37，5.41 mg/ml;每一浓度设 4个复孔，另设空白对照组，此外，设立单加药物和培养基，不加细胞的对照组(观察药物是否会与MTT反应)。单独作用24，48 h后，去除培养基，每孔加20 μl，5 mg/ml MTT 溶液，孵育 4 h，每孔加入二甲基亚砜150 μl，在微型混合器上振荡10 min后于全自动酶标仪上测定490 nm OD值。实验重复3次，取均值计算增殖抑制率。增殖抑制率=(1-药物组OD值/对照组OD值)×100%。

1.6 流式细胞术检测细胞的凋亡情况