柱前衍生化高效液相色谱等度洗脱分析单糖的方法建立_徐瑾

柱前衍生化高效液相色谱等

度洗脱分析单糖的方法建立

徐瑾¹

常州工程职业技术学院

摘要以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为柱前衍生化试剂,建立了高效液相色谱等度洗脱分离分析5种单糖的方法。采用简化的衍生化方法,在流动相:乙腈-醋酸盐缓冲液(0.1mol/L,p H=5.5,V/V=22B78)的色谱分离条件下,5种单糖衍生物可以达到基线分离,检测限分别为0.54~0.90ng,也对方法的线性范围、精密度、稳定性进行了系统的考察。关键词单糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化高效液相色谱等度洗脱

1.前言

近年来,糖类物质在生物学领域的作用已越来越被重视,人们将研究的重点放在糖类物质的定量、定性以及结构分析上,并对此做了大量的研究。因为糖的种类较多,且结构近似,所以无论对哪种糖进行分析,首先必须将分析的对象与其它糖分离开来。另一方面糖类物质几乎没有光学活性,对分离后的物质进行直接光学检测比较困难,结合灵敏度、选择性等方面的问题,人们多采用通过化学标记将糖类物质转变为具有光学活性的物质,然后再进行分离分析的方法。衍生方法与高效液相色谱(HPLC)结合使用不但能提高检测的灵敏度,而且可以改善分离特性。迄今为止,文献报道的用于糖类物质衍生的紫外衍生试剂种类很多[1-3],它们都各有优缺点。近年来出现的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)是一种具有强紫外吸收的衍生试剂,Honda等[4]发现该试剂可以与还原性的糖在温和条件下反应,无需酸催化,不会引起脱甲硅基的作用,产物无立体异构体,在紫外245nm处有强烈的吸收。该方法自应用以来,已得到了不断的完善[3-6]。马定远等[7]在前人的基础上简化了其衍生化方法,建立了单糖组成分析的数据分析方法,并用所建立的方法对一个多糖中的单糖组成进行了分析,获得良好的重复性。鉴于该物质的这些优点,本文采用它对单糖进行柱前衍生,结合HPLC技术,建立了5种常见单糖的等度洗脱分离模式,通过外标法对这5种单糖进行了定量研究。

2.实验部分

2.1仪器

UV200Ò紫外可变波长检测器;P200Ò高压恒流泵;Echrom98工作站(大连依利特科学仪器有限公司);真空过滤器(天津市腾达过滤器件厂);H19321pH计(HANNA);DZF-150型数显小型恒温真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)

2.2试剂

乙腈、甲醇(色谱纯);三氯甲烷、乙酸铵、氢氧化钠(分析纯);PMP(99%,AC ROS);D-半乳糖、D-木糖、鼠李糖(生化试剂);葡萄糖、D -甘露糖(分析纯)

2.3单糖-PMP衍生产物的制备

以葡萄糖(Glucose)为例,将1mol的Glucose 溶于1.5mL的Na OH溶液(0.3mol/L)中,取该溶液150L L与100L L的PMP/甲醇溶液(0.

2006年第2期总第四十八期

常州工程职业技术学院学报

J OUR NAL OF CHANGZ HOU INSTI TUTE OF ENGINEERING TECHNO LOGY

Vol.22006

Jun No148

¹作者简介:徐瑾,硕士。

5mol/L)混合,在70e 下反应30min 。取出后冷却至室温,然后加入150L L 的HCl(0.3mol/L)进行中和,中和后的溶液放入真空干燥箱中,100e 下烘干。烘干后的物质用2mL 的水及2mL 的氯仿溶解,充分振荡后除去有机相,萃取过程重复3次。水相溶液经0.45L m 的滤膜过滤后,用水稀释至一定倍数,进样量10L L 进行HPLC 分析。

2.4HPLC 条件

色谱柱:Hypersil ODS2(150mm @4.5mm i.d.,5L m,大连依利特公司);柱温:室温;流动相:A-醋酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH = 5.5),B -乙腈;流速:1mL/min;UV 检测波长:245nm 。

3.结果与讨论

3.1衍生方法的选择

与其它文献[3-7]的方法不同,无需将待测样品水溶液真空干燥后再进行衍生,直接将待测样品溶解于Na OH 溶液中,衍生试验时移取一定量样品溶液直接进行衍生。但是糖/NaOH 溶液必须在低温下保存。因为常温下保存,数天后衍生产物的峰面积明显减小,并出现了两

个杂峰,可能的原因是糖的醛基在碱性条件下容易氧化。而低温下保存可以有效地避免这种情况的发生。

在大多数文献[3-6]中,HCl 中和衍生溶液后,首先将溶液真空干燥,再用水溶解,萃取完成后的水相再一次进行真空干燥,最后的干燥物用水溶解进行HPLC 的分析。这些步骤以除去衍生反应中剩余的试剂和产生的杂质为目的,因此PMP 衍生方法操作复杂,无法避免各个步骤中衍生产物的损失。有人用PMP 衍生时没有采取任何干燥步骤,直接进行萃取,多余的衍生试剂虽然没有完全除尽,但是由于衍生试剂峰在其它六种单糖的衍生产物峰前流出,所以并不干扰分离分析,这就在很大程度上简化了衍生试验的步骤,衍生产物几乎没有任何损失[7]。本文在采用该方法时发现,在Man 衍生产物的峰后有一个小峰(P MP),等度洗脱无法与其分开(如图1a 所示)。采取一次干燥即可解决这一问题,既达到了简化实验步骤的目的,降低了衍生产物的损失,使得定量实验更加准确,又在最大程度上使衍生试剂峰减小。(如图1b 所示)

。

图15种单糖衍生产物的色谱图

Fig.1HPLC-UV chromatogram of the PMP derivatives of 5small sugars (a)without drying process (b)with drying process

3.2有机萃取剂的选择

柱前衍生需要使用过量的衍生试剂以达到衍生完全的目的,但必须在样品进入HPLC 之前除去过量的衍生试剂,以清除衍生试剂的干扰,延长色谱柱的使用寿命。分别选取常用的有机试剂)))苯、氯仿、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正己烷作萃取剂进行试验,除去衍生反应中产生的杂质和残留衍生试剂。对衍生的最