蛋白质分离技术(全)

1) 盐浓度（即离子强度）：
• 离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，绝大多数蛋白质和酶， 在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性 盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶 现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的 静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。 • 为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加 入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、 NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。
• 1） 先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、 反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶 法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离 心得到含有膜蛋白的粗组分。
• 2 ）用特殊的去污剂选择性的分离。在多数情 况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构 中溶解下来。
三、分离与纯化
• 从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯 净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化， 这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两 步进行。
（一）材料的选择与预处理
• 选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含 量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植 物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题， 只要能达到实验目的即可。
• 实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要 除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需 要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽 可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。若不立即进行实验 或加工，应冷冻保存。
2.物理法： • 1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后 放于室温 ( 或40 ℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞 内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 • 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和 细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 • 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法 。在 1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小 孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。
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4. 膜蛋白的提取
• 膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜 非常重要的生物学功能。 • 根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为 两大类型：外周膜蛋白和内在膜蛋白。 (1) 外周膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表 面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚 至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。 (2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂 (detergent)使膜溶解后才可分离出来。
溶解度
分子大小 带电特性 吸附特性
对配体分子 的亲和性
（一）粗分级分离
主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂 沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂 蛋白分开。 优点：简便、处理量大、既能除去大量杂质， 又能浓缩蛋白质。 缺点：分辨率低，产品杂质多。
1. 盐析（中性盐沉淀）
• 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过 程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、 多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。 • 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• 2) pH值：蛋白质、酶的溶解度和稳定性与pH值有 关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6 ～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定 范围内，通常选择偏离等电点的两侧。
• 3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋 白质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。 • 4) 防止蛋白酶的降解作用：加入抑制剂或调节提 取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解 酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的 降解作用。
（一）分离纯化的意义
①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与 功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本 质有重大意义。 ②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业， 需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、 麦芽糖、糊精以及糖浆等。
③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。
④基因工程的需要
• 5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解， 一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大 量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等 物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当 数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需 基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气 接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的 二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入 少量巯基乙醇或二硫苏糖醇以防止巯基氧化。
• 膜蛋白 即内在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的 基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白 等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。 • 膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶 用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐， Triton-100，Tween-80, SDS等表面活性剂。
分离膜蛋白的方法（原则性）
（二）分离纯化的要求
1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作 为研究一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系 的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制 剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质 制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物 活性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有 不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
• （NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4
0℃ 70.6 4.9 1.6
20℃ 75.4 18.9 7.8
80℃ 95.3 43.3 93.8
100 ℃ 103 42.2 101
一、 引言
第十节
蛋白质 的分离与纯化
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理 三、蛋白质（酶）分离 与纯化 四、层析技术 五、电泳技术 六、离心技术
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
（二）细胞的破碎
• 分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原 来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原 来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方 法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生 物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破 碎。 • 组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的 实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。
（四）提取
• 组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内
含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件 下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保 持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备 物的分解破坏，这就是提取。
1. 影响提取的因素
• 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； • 由固相扩散到液相的难易； • 溶剂的pH值和提取时间等。 通常：
• 蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋 白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶 解度，电荷等建立起来的。
常用的蛋白质分离纯化技术
依据性质 方 用于粗分
盐析、等电点沉淀、 有机溶剂沉淀
透析、超过滤
法 用于细分 分配层析
密度梯度离心、凝 胶过滤 电泳、离子交换层析 吸附层析 亲和层析、金属 螯合层析
• 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此 法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如 此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
3. 化学与生物化学方法： • 1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的 pH和适当的温 度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯 酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 • 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的 稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞， 将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 • 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
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①成本低，不需要特别昂贵的设备。
②操作简单、安全。
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③对许多生物活性物质具有稳定作用。
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。 • 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。
• 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水 化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；
碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； • • 温度升高，溶解度加大； 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持 其生物活性。
2. 水溶液提取
• 蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。用水溶液提取生物大分子应注 意的几个主要影响因素是： •
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
（三）细胞器的分离
• 细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞 还有叶绿体。 • 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了 防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需 先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。 • 细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在 适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠 檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经 过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次 分步离心后，即可获得所需组分。
3. 有机溶剂提取
• 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较 多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中， 常用不同比例的有机溶剂提取。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等， 这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性 和亲脂性。 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有 一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采 用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并 兼有除去杂质提高纯化效果的作用。 例如，胰岛素。
（三）分离纯化的一般程序
生物大分子的分离纯化一般可分为 以下几个阶段： ①材料的选择和预处理 ②破碎细胞及提取（有时还需要进 行细胞器的分离） ③分离纯化：包括粗分级分离和细 分级分离 其中前两个阶段为生物大分子分离 纯化的前处理。
选择材料 破碎细胞 提取 分离纯化 分析及鉴定
二、 蛋白质（酶） 分离纯化的前处理
+
带正电荷蛋白质 （疏水胶体）
带负电荷蛋白质 （疏水胶体） 蛋白质聚集沉淀
⑵ 中性盐的选择
• 常用的中性盐中最重要的是 (NH4 ) 2SO4，因 为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： • 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高 的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于 酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而 盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。 由下表可以看到， 硫铵在0℃时的溶解度， 远远高于其它盐类：
• 1. 机械法： • 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器 中，加入少量石英砂研磨或匀浆。 • 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎， 然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组 织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
水化膜 + + + + + + + + + 带正电荷蛋白质 （亲水胶体） 脱水 + + + + +  （亲水胶体） 脱水 阴离子 不稳定蛋白颗粒 阳离子 碱 酸 带负电荷蛋白质 （亲水胶体） 脱水