基因工程载体-噬菌体载体
λ噬菌体载体名词解释
λ噬菌体载体是一种广泛应用于分子生物学和基因工程领域的载体，用于将外源DNA序列引入细菌细胞中。
噬菌体是一种寄生性病毒，可以感染细菌并在其内部复制。
而λ噬菌体是其中最为常见和常用的一种。
λ噬菌体载体通常由数万个碱基对的环状DNA组成，其中包含了多个重要的功能区域。
其中，最重要的功能区域是Origins of Replication（ORI），即复制起始点，负责引导DNA的复制。
此外，载体还包含了选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以便在细菌培养基中筛选带有该载体的细菌。
λ噬菌体载体还含有多个限制内切酶切位点，这些切位点可以用于将外源DNA序列插入到载体的特定位置上。
通过将外源DNA与载体进行限制性内切酶切割，然后使用DNA连接酶进行连接，可以将外源DNA序列插入到载体的DNA链上。
这一过程称为重组。
一旦重组完成，λ噬菌体载体可以通过转化的方式引入到宿主细菌中。
转化是指将外源DNA 导入到细菌细胞中的过程。
一旦载体进入到细菌细胞中，它会在细菌细胞内部复制，并产生大量的噬菌体颗粒。
这些噬菌体颗粒可以感染其他细菌细胞，并将携带的外源DNA序列传递给它们。
λ噬菌体载体在分子生物学和基因工程研究中具有广泛的应用。
它可以用于构建基因文库，即将外源DNA序列插入到载体上，并通过转化的方式导入到细菌细胞中。
这样，研究人员就可以通过筛选和分析细菌细胞中的载体来获得感兴趣的外源DNA序列。
此外，λ噬菌体载体还可以用于基因表达，即将外源DNA序列插入到载体的表达位点上，以便在细菌细胞中大量产生特定的蛋白质。
总之，λ噬菌体载体是一种在分子生物学和基因工程领域中被广泛使用的载体。
它具有多个重要的功能区域，可以用于将外源DNA序列引入到细菌细胞中，并在其中进行复制和表达。
通过利用λ噬菌体载体，研究人员可以进行基因库构建、基因表达和其他相关研究，为生物技术的发展提供了重要的工具和平台。
噬菌体载体的应用原理
噬菌体载体的应用原理1. 背景介绍噬菌体（Phage）作为一类侵染细菌的病毒，不仅是微生物学研究的重要对象，还被广泛应用于分子生物学研究和基因工程领域。
噬菌体载体（Phage vector）则是指将噬菌体进行基因改造，使其能够携带外源基因，并在细菌中进行复制和表达的工具。
噬菌体载体具有高度稳定性、高效载带能力以及可控的基因表达特点，因此在基因工程、基因治疗等领域得到了广泛应用。
2. 噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建主要包括以下几个步骤：2.1 基因插入首先，需要选择合适的噬菌体作为载体，并在其基因组中选择一个合适的位点进行基因插入。
一般而言，选择的位点应该具有低于正常表达基因的水平，以避免影响载体的稳定性和复制效率。
将目标基因构建为重组DNA片段，并将其连接到载体DNA的适当位点上，通常使用酶切和连接技术。
2.2 载体包装插入目标基因之后，需要将噬菌体载体进行包装，以使其能够感染目标细菌并进行复制。
噬菌体包装一般通过混合目标基因与噬菌体DNA前体，然后加入相应的包装酶，通过体外反应来完成。
这样一来，就可以得到包含目标基因的噬菌体颗粒。
3. 噬菌体载体的应用噬菌体载体的应用可分为以下几个方面：3.1 基因工程研究噬菌体载体在基因工程研究中被广泛用于基因克隆、基因转染和基因表达等方面。
通过将目标基因插入噬菌体载体中，并利用噬菌体的感染和复制能力，可以高效地将外源基因导入到细菌中，并进行大规模扩增和表达。
此外，噬菌体载体还可以用于构建和筛选基因文库，以便进行基因功能的研究和探索。
3.2 基因治疗噬菌体载体作为基因传递工具，被广泛应用于基因治疗领域。
通过将治疗相关基因插入噬菌体载体中，可以使其能够有效地传递到患者的细胞中，并在细胞内进行表达，以达到治疗的目的。
噬菌体载体具有较高的基因载载能力和感染效率，这使得其成为一种理想的基因传递工具，对于遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗具有重要意义。
3.3 基因筛选与定向进化噬菌体载体被广泛用于基因筛选和定向进化等研究领域。
基因工程载体
基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到能够自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)确实是携带外源基因进入受体细胞进行繁育和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种要紧类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒〔cosmid〕载体基因工程对载体的要求〔1〕在宿主细胞内能独立复制。
〔2〕有选择性标记。
〔3〕有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不阻碍载体的复制。
〔4〕分子量小，拷贝数多。
〔5〕容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依靠于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞那么不能存活，而宿主即使没有它们也能够正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常显现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA〔cccDNA〕②开环DNA〔open circular,ocDNA〕③线形DNA〔linear,lDNA〕〔二〕质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套操纵细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒〔性质粒或F因子〕甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了操纵细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒〔抗性质粒〕、Col质粒〔细菌素养粒〕。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状〔resistance〕。
Col质粒：细菌素通过与敏锐细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程中常用载体及其主要特点
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
基因工程4-2 (简要) 基因工程的载体
其中 BamH I 切点还可以连接经 Sau 3A 或 Mbo I部分消化的DNA片段，虽然在克隆过程 中载体上的 BamH I 位点被破坏了，但可以选 用EcoR I或Sal I作消化作用，便能回收到克隆 的外源DNA片段。
* 溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌。 （即含有原噬菌体的寄主细胞）
* 原噬菌体 (prophage) ：在溶源性细菌内存在的整合或非 整合的噬菌体DNA（所谓整合是指噬菌体DNA已插入到 寄主细胞染色体DNA之中）。 溶源性细菌具有免疫性，能够不再受同种噬菌体的 侵染，这一现象称为超感染免疫性。
2. EMBL系列载体 是 一类 替 换型载 体，适 用于克 隆长度 为 8~23 的可取代区段的两 侧，各有一段切点相同、方向相反的多克隆位 点，能够被EcoR I、BamH I和Sal I所识别，因 而可用来克隆由这三类限制酶所产生的任何一 种限制片段。
DNA的复制在早期是按形式从双向进行 的，由一个环状分子复制成两个环状分子。若
进入裂解途径的晚期，则进行滚环复制，由一
个环状DNA分子复制成多个 DNA分子连在一
起的线状长多连体分子。
在噬菌体包装时， DNA的多连体分子经过
核酸酶的切割作用，从cos位点处将它分离成单
位长度的单体分子之后，才能够被包装起来。
3. DNA的包装限制问题： 噬菌体的包装能力，控制在野生型 DNA 长度的 75~105% 。在这个范围内的 DNA 可以被 包装成有活性的噬菌体颗粒，而超出这个范围 的就不能形成正常大小的噬菌斑。
用噬菌体作载体时，对外源DNA片段的大 小有比较严格的要求。若按野生型 DNA 分子 长度为48 kb计算，其包装上限为51 kb；由于野 生型的 DNA基因组中必要基因的DNA区段占 28 kb ，所以 载体克隆外源 DNA 片段的理论极 限值是23 kb。一般的载体的包装容量在15 kb 左右。
基因工程载体的分类及其特性
基因工程载体的分类及其特性田文晓 1343001125按照来源和性质分类1、质粒载体①复制：通常情况下一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式不同，有的可决定复制的方式，例如滚环复制和θ复制；在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
②拷贝数：质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数大约为1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
③不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
④转移性：指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。
2、噬菌体载体（包括λ噬菌体、M13噬菌体载体）1)λ噬菌体载体：大的外援插入片段在质粒中不稳定，转导是比转化效率更高的过程，避免出现无插入片段的空载体。
2)M13噬菌体载体：可以对任意克隆基因进行DNA进行诱变，测序方便，可以制备单链测序模板；含有噬菌体DNA的噬菌体颗粒从转化细胞中分泌出来后，可以在生长平板上收集。
①超感染免疫性：溶原性细菌在被噬菌体感染并溶原化后，不会被同种噬菌体再次感染。
②经过若干世代后，溶原性细菌会开始进入溶菌周期，即溶原性细菌的诱发。
此时，原噬菌体从宿主基因组上切离下来进行增殖。
3、粘粒载体（柯斯质粒）①具有λ噬菌体的特性。
柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
基因载体名词解释
基因载体名词解释基因载体是指能够携带外源DNA进入细胞并使其复制繁殖的分子，通常是一种圆形、线性或环形的DNA分子。
基因载体在基因工程和生物技术中扮演着非常重要的角色，可以被用于DNA序列的克隆、表达和传递等方面。
下面是一些常见的基因载体名词解释：1.质粒（Plasmid）质粒是一种环形DNA分子，通常存在于细菌和酵母等微生物细胞内。
质粒可以被用作基因工程的载体，通过插入外源DNA序列来实现基因克隆和表达。
2.噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌细胞内的病毒，可以感染并复制繁殖在细菌细胞内。
噬菌体可以被用作基因工程的载体，通过插入外源DNA 序列来实现基因克隆和表达。
3.表达载体（Expression Vector）表达载体是一种专门用于外源基因表达的基因载体，通常包含有启动子、转录终止子、选择标记等功能元件，可以实现对外源基因的高效表达。
4.病毒载体（Viral Vector）病毒载体是一种基因载体，可以将外源基因导入宿主细胞中，并利用病毒的自身复制机制实现外源基因的表达。
病毒载体可以用于基因治疗、基因疫苗等方面。
5.贝壳素粒子（Shell Vial Particle）贝壳素粒子是一种基于病毒样颗粒（VLP）的基因载体，可以用于疫苗研究和制备。
贝壳素粒子在疫苗制备中具有很高的应用价值，可以实现对多种病原体的有效预防和控制。
6.人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是一种基因载体，可以模拟自然染色体的结构和功能，用于基因治疗、基因修复等方面。
人工染色体可以携带大量的外源DNA序列，并实现稳定的遗传转移和表达。
7.负载（Payload）负载是指基因载体中携带的外源DNA序列，通常包括了目标基因、选择标记、报告基因等。
负载的设计和选择对于基因工程的成功非常关键，需要考虑到载体的适应性、表达效率、稳定性等因素。
8.选择标记（Selection Marker）选择标记是指基因载体中用于筛选转化细胞的标记基因，通常包括了抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
基因工程 考试 重点 噬菌体载体
第二章 DNA重组克隆的单元操作练习题噬菌体载体(练习题)一、填空题1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。
2．第一个报道的全测序的单链DNA 噬菌体是φX174，DNA 长5386 个碱基对，共个基因，为一环状DNA 分子，基因组的最大特点是。
3．λ噬菌体的基因组DNA 为kb，有多个基因。
在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按复制，成熟包装(晚期复制)则是按复制。
它有一个复制起点，进行向复制。
λ噬菌体的DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。
其原因主要是在λ噬菌体线性DNA 分子的两端各有一个个碱基组成的天然黏性末端。
这种黏性末端可以自然成环。
成环后的黏性末端部位就叫做位点。
4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为kb，插入的外源片段最大不超过kb。
5．野生型的M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是和。
6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS 位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。
从酶切点看，插入型为个，取代型为个。
8．野生型的丸噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。
9．M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) (2) (3) 。
10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。
11 ．M13 单链噬菌体基因2 和基因4 之间的IG 区有三个最重要的功能，即(1)(2) (3) 。
12．野生型的M13 有10 个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：和。
13．以λ噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA 的长度是不同的，前者为kb，后者为kb。
14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA 片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。
基因工程的载体种类
基因⼯程的载体种类基因⼯程的载体对于外源基因的复制、扩增、传代乃⾄表达⾄关重要，其必需具备以下条件：①具有有效运载能⼒，能够进⼊宿主细胞；②对多种限制酶有单⼀或较少的切点，最好是单⼀切点，即本⾝是⼀个复制⼦，携带外源基因前后均能在宿主细胞内⾃主复制，或者能够整合到宿主细胞中；③在宿主中能控制外源基因的表达活动；④要有筛选标记，鉴定⽅便，装卸⼿续简单；⑤容易控制，安全可靠。
在基因⼯程（DNA重组）中，使⽤的载体有：①克隆载体（clone vector），即以繁殖DNA分⼦为⽬的的载体；②穿梭载体（shuttle vecto），⽤于真核⽣物DNA⽚段在原核⽣物中增殖，然后在转⼊真核⽣物细胞宿主表达；③表达载体（express vector），⽤于⽬的基因的表达。
现在对载体提出了更⾼的要求，如：⾼拷贝数、具有强启动⼦和稳定的mRNA、具有⾼的分离稳定性和结构稳定性、转化频率⾼、宿主范围⼴、插⼊外源基因容量⼤且可以重新完整地复制与转录、和宿主细胞匹配等。
此外，载体在宿主不⽣长或低⽣长速率时仍能⾼⽔平地表达⽬的基因。
但达到上述要求的载体很少，尤其是当动物细胞作为宿主细胞时，⽬前能⽤的主要时病毒，进⼊宿主的⽬的基因⼀般只能是⼀个基因，⽽以基因组或多个基因同时进⾏重组还有⼀定困难。
⼀、质粒克隆载体除酵母杀伤质粒（killer plasmid）为RNA外，其他质粒多位环状DNA分⼦，每个质粒都有⼀段DNA复制起始点的序列，帮助实现质粒的复制。
质粒⼀般决定抗⽣素的抗性、产⽣抗⽣素酶系、糖酵解酶系、降解芳⾹族化合物酶系、肠毒素及限制-修饰酶系等。
其中严紧型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体同步，并与宿主蛋⽩质合成有关，与DNA聚合酶I活性⽆关，蛋⽩质合成停⽌，质粒与宿主染⾊体复制亦停⽌，故只有1个或少数⼏个拷贝；⽽松弛型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体复制不同步，与蛋⽩质合成⽆关，与DNA聚合酶I活性有关，蛋⽩质合成停⽌，质粒仍可复制，故可以在宿主有10—206个拷贝。
基因载体名词解释
基因载体名词解释基因载体是指用于携带、传递和复制基因的分子或生物体。
在基因工程和生物技术领域，基因载体通常是指能够容纳外源DNA序列的DNA分子或细胞，常被用于基因克隆、基因表达、基因转移等实验和应用中。
常见的基因载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样粒子、大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等。
这些载体被广泛用于基因工程实验和技术，在研究和应用中起到了至关重要的作用。
质粒是最常用的基因载体之一，是一种小型环状DNA分子，可以自主复制和传递，对于分子克隆和基因表达都非常有用。
质粒通常具有选择性标记基因（如抗生素抗性基因），可以通过选择性培养来筛选出带有目标基因的质粒。
此外，质粒还可以携带其他附加基因元件，如启动子、终止子、启动子和信号序列等，在基因表达中发挥重要作用。
另一种常见的基因载体是噬菌体，是一种感染细菌的病毒。
噬菌体可以携带外源DNA序列，并在细菌中进行复制和表达。
噬菌体可以用于高效地产生大量目标蛋白，因此在基因表达和蛋白生产中具有广泛应用。
此外，还有噬菌体样粒子，它是由噬菌体的基因组包裹在蛋白质壳中构成的粒子，可以携带大片的外源DNA序列，并在细胞中进行复制和表达，常用于基因克隆和基因转移实验。
在真核生物中，常用的基因载体包括酵母和昆虫细胞。
酵母是一种单细胞真核生物，具有较高的基因组稳定性和蛋白表达能力，在基因工程和蛋白生产中被广泛运用。
昆虫细胞也具有较高的蛋白表达能力，被广泛用于重组蛋白的产生和应用。
总的来说，基因载体是在基因工程和生物技术领域中不可或缺的工具，能够携带外源DNA序列，并在细胞中进行复制、传递和表达。
基因载体的选择和设计对于实现特定的实验目标和应用需求至关重要。
植物基因工程中的λ噬菌体载体
•右臂：长约10kb，控 制溶菌和溶原生长最重 要的调控基因和序列、 以及λDNA复制起始均 在这区域内。
➢ 基因组长约50kb ，至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似 性成簇排列。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生 长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 植物基因工程中的λ噬菌体载体
植物基因工程中的λ噬菌体载体
λ早使用的载体 系统，其主要优点是插入片段的装载容量大，适合于 全长的eDNA克隆，不仅质量高、代表性好，而且重组 噬菌体颗粒的感染活性在替换或插入某些标志基因，如上述的可 供蓝白筛选lacZ’序列和多克隆位点等。
• 建立重组λDNA分子的体外包装系统。
• 与一般的质粒载体不同, 噬菌体转染前需要利用噬菌体外 壳蛋白和噬菌体DNA加工酶组成的混合物(包装抽提物
• )在体外将连接好的DNA线性分子包装成噬菌体颗粒
植物基因工程中的λ噬菌体载体
植物基因工程中的λ噬菌 体载体
2020/11/20
植物基因工程中的λ噬菌体载体
载体（vector）是把一个有用的目的DNA片段通过重 组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工 具。 植物基因工程技术中尤为重要的是载体，不同目的 基因需要采用不同的载体。 组成植物基因工程载体系统常见的几种载体有：
右臂，填充片断的存在会影响连接效率， 必须纯化左臂和右臂。
植物基因工程中的λ噬菌体载体
（3）外源片断与载体的连接 • 通过载体的粘性末端，将载体连接成多联
体，以利于将两个cos位点之间的片断装入 噬菌体颗粒
植物基因工程中的λ噬菌体载体
（4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染力 的噬菌体颗粒
基因工程-2-载体ppt课件
1.柯斯载体的组成
由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。
2.柯斯载体的特点
① 带有抗药性标记 ② 带有质粒的复制起始点 ③ 带有多个限制酶的单一切点 ④ 带有λ噬菌体粘性末端片段
3.cosmid载体的优点
insert) form URA3 auxotrophy selectable marker (yeast) yeast centromeric sequence ARS1 yeast origin of replication
第二节 噬菌体载体
一、 λ噬菌体载体
1. λ噬菌体结构特点: ①线性双链DNA分子 ②可在E.coli中大量繁殖 ③具非必需区(约1/3长度） ④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端
⑷ 建立λDNA的体外包装。
噬菌体的包装过程
主要外壳蛋白质 是基因E的产物
连环DNA
头部前体
基因A的产物在cos 位点切割噬菌体 DNA
基因W和FII 的产物组装 蛋白质加完 包含在外壳中的 整的尾部 基因D的产物
λDNA的体外包装
头部基因 （琥珀突变型）
转录复制 蛋白质合成
体外包装的重组DNA比裸 露的DNA导入受体细胞的 效率高100-10000倍
2.酵母菌质粒载体的特点
①含有E.coli质粒的复制起始序列。
②含有酵母的筛选标记（如LEU2） ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
④酵母菌稳定型质粒载体
着丝粒
Type bacterial origin promoter selectable marker
selectable marker
一 基因工程的基本元件 ------载体
质粒载体
Ch04基因工程的常用载体-噬菌体和病毒载体
4. M13载体的构建 （1）选定克隆区域 1）M13基因间隔区（intergenic region, IG区） 514 nt (5501-6014)
4
M13 6.4 Kb
2）酶切位点 IG区内有两个 BsuI(HaeIII)（GG↓CC）位点 其余8个BsuI位点分布在其它部位
基因4
M13 IG区序列
第四章 基因工程载体
邢万金 内蒙古大学生命科学学院生物学系
第二节 噬菌体载体
一、单链噬菌体载体
单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13、f1、fd 等噬菌体 pIII(5) pVIII(2700) pVII
pVI(5) +DNA
M13丝状噬菌体
pIX(5)
1. M13单链噬菌体DNA的基因组织
（3）常用的 pBluescript 载体 pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-） SK：表示lacZ′ 的转录方向是沿MCS上的 SacI → KpnI KS：反向（ KpnI → SacI ，MCS相反） +（f1+）：单链复制起始方向背离 lacZ′， 能回收lacZ′ 的编码链（+） -（f1-）：能回收lacZ′ 的非编码链（-）
5. 对M13mp1载体的改进 M3mp2：在LacZα中引入单一酶切位点EcoRI M3mp1的LacZα的第6氨基酸有个EcoRI星号位点： ATGACCATGATTACGGATCCA TACTGGTACTAATGCCTAAGT O
O N N CH3 NH2
CH3 Eco RI* H2 N-Met Thr Met Ile Thr Asn Ser------N-甲基-N-亚硝基脲 l M13mp 2 ATGACCATGATTACGAATTCA 5 ′ ATGACCATGATTACGAATTCA5′ATGACCATGATTACGGATTCA----7250 bp GT TACTGGTACTAATGCTTAA 3 ′ TACTGGTACTAAhr Asp Ser------4
质粒载体和噬菌体载体特点
质粒载体和噬菌体载体特点《质粒载体和噬菌体载体：基因工程的“小助手”大比拼》嗨，小伙伴们！今天咱们来聊聊基因工程里的两位重要“小助手”——质粒载体和噬菌体载体，这俩家伙可是有着各自的超级特点呢！首先说说质粒载体，这家伙就像是一个便携式的基因小仓库。
你看啊，它通常是个环状的DNA小分子，就像个小圆环在细胞里面自在地游来游去。
质粒载体最棒的一点就是它非常容易操作。
科学家们就跟摆弄小玩具似的，可以轻松地把要研究的基因片段插进去。
它的结构相对简单，就像一个简单改装就可以入住的小房子。
而且，它在细菌里能够大量复制，就像小老鼠生小老鼠一样，一下子就能生出好多带有目标基因的子孙后代，特别适合基因的扩增。
不过呢，质粒载体有时候也有点像个小迷糊。
它可没有自己专门的导航系统进入细胞。
大多数时候是借着转化这种方式悄悄混进细菌细胞里，这就好比一个没有邀请函的人乱闯派对，有时候就会被细胞这个“保安”给赶出来或者直接忽视掉。
再看看噬菌体载体，哇，这家伙可就像是个基因工程界的“特种兵”。
噬菌体嘛，天生就是专门入侵细菌的高手。
它的样子说起来有点奇特，像个专门为攻击细菌而设计的小飞船。
噬菌体载体主要特点就是它的感染效率特别高。
就像一个身手矫健的刺客，总能准确找到目标细菌并且轻易地把自己携带的基因注入其中。
这一点可把质粒载体羡慕坏了。
但是呢，噬菌体载体也不是完美无缺的。
因为它本身天然就是细菌的“敌人”，这身份太特殊啦，如果处理不好就容易引起细菌的防御反应。
这就好比你去人家那里偷东西，人家肯定要设各种机关防着你呀。
而且，噬菌体的基因结构相对复杂些，就好像是一个复杂的高科技装备，想要改装它，让它携带特定的基因片段，就需要更高的技巧。
所以，操作噬菌体载体就有点像摆弄那些高端的、按钮多得让人眼花的电子产品，一不小心就搞砸啦。
无论是质粒载体还是噬菌体载体，在基因工程的大舞台上都有着不可替代的角色。
就像在一个魔法世界里，质粒载体是那种比较乖巧的小精灵，平时默默地干活，完成基因的保存和简单传递任务；而噬菌体载体则像个有点叛逆但能力超强的魔法士兵，能在特殊任务中发挥奇效。
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3、λ-DNA的物理图谱
λ-DNA为线状双链DNA 分子，两端各有一个12核苷 酸的互补单链（粘性末端） GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA，称为 cos区，全长48.5kb。
特点是功能相近的基因在基 因组中聚集在一起。
主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体 颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。
溶源性生长(lysogenic pathway) 噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中
去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。
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噬菌体
cos位点
A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR
cos 位点
A
结构区 重组区 调控区
EcoRI
R
A
裂解区
R
目的基因
插入型
置换型
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λ噬菌体的基因组结构
头部基因
尾部基因
功能不明区
AWBCDE FZUVGHMLKIJ
b2
COS
溶源化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌 COS att int xis gam red cIII N cI cro cII O P Q S R
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T4 Bacteriophage
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噬菌体
1. 噬菌体的生物学特性
烈性噬菌体,只具有溶菌生长周期
温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期
溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然 后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装， 最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。
E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。
换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。
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（3）凯伦噬菌体载体
既有插入型；又有替换型 在基因工程实验中的用途十分广泛 承受外源DNA的能力：几个kb到23kb
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（左右臂连接）
（三段自身连接） （插入片段）
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（2） 溶原周期：
温和噬菌体（temperate phage)
感染细菌后，将自己的DNA整 合到细菌的染色体DNA中。形 成这一过程称为溶源化
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2、 噬菌体的结构和其核酸类型：
结构：无尾部结构的二十面体型、
具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、
5’-CG
GGGCGGGCGACCTC3;
GC-5’
3’-GCCCCGCCGCTGGA
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（二）λ噬菌体载体的主要类型 （1） 插入式载体
一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的 派生载体。 （2） 替换型载体（取代型载体）
具有成对的克隆位点，在这 两个位点之间的λDNA 区段可以被外源插入的DNA片段所取代。 （3） 凯伦噬菌体载体
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λ噬菌体
组成特点：
双链线状DNA分子，
全长50kb，
含65个基因，
在其分子两端各含有12
个碱基的互补单链，是天
然的粘性末端，被称为
COS位点。
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λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长
溶菌性生长（lytic pathway） 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿
第二节 噬菌体载体
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噬菌体载体 （phage vectors）
一、噬菌体载体
二、单链噬菌体载体
三、噬菌粒载体
四、柯斯质粒载体
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一、噬菌体载体
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（一）噬菌体的一般特性 噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）
结构：
蛋白质外壳内包裹 着DNA（双链、单 链、线性、环状 等）。
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（2）λ 替换型载体（取代型 e.g. EMBL3载, 体DA）SH
• 外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体 的感染和复制非必要的片段 (~ 20 kb)
• 高感染效率 (109 转化株/ug 载体 DNA, 比质 粒高100-倍)
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替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和 复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如 Charon 4A、 λEMBL 3/ 4、Charon40等载体，这些 载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整 的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作 为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段， 再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染
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由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短 于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的 活性就急剧下降。因此只包装它的野生型 DNA（48.5KB）的75%~105%左右的Ｄ ＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度之 和在39～53kb之间。
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（三）体外包装
λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经 过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将
重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感
染方式导入细胞的频率可达 106~108/μgDNA，而以转染（translation） 的方式导入的频率仅为103~105/ μgDNA。
λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA （约48.5 kb）的75%~105%。
溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主 细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。
整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细
菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA
被称为原噬菌体。
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噬菌体的生活周期
分为两种： （1） 溶菌周期：
烈性噬菌体（virulent phage)
生长非必须区段 cI基因：溶源过程控制基因。
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The phage cos ends
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’ Circular form
Cleavage (during packaging)
Ligation (after infection)