纤维素酶分子改造技术研究进展

摘 要：纤维素酶是一组可将木质纤维素降解为葡萄糖的复合酶，已广泛应用于生物转化、食品、纺织、造纸、 饲料和洗涤剂等多个行业中。纤维素酶分子改造的研究对于解决当前全球的多种重大问题如能源危机、环境污
染、饲料资源紧张、粮食短缺等具有重要的现实意义。该文综述了纤维素酶分子改造的多种技术，如定点突变技
术、易错 Ｐ百度文库Ｒ、ＤＮＡ 改组等。 关键词：纤维素酶；分子改造；研究进展
内 切 型 β－葡 聚 糖 酶 （Ｅ．Ｃ ３．２．１．４）： 也 称 ＥＧ，胞外酶型的分子量介于 ４７～７６ＫＤａ， 胞内酶 型的分子量介于２３～１１８ＫＤａ［３］；主要作用于 纤 维 素的非晶体区，水 解 β－１－４ 糖 苷 键， 使 得 纤 维 素 产 生大量的非还原断，主要产物有纤维糊精、纤维二 糖、纤维三糖等。
定点突变技术通常与生物信息学结合使用，首 先对待改造纤维素酶进行同源分析，对其分子结构 与功 能 的 关 系 进 行 研 究， 包 括 影 响 ｐＨ、 热 稳 定 性、底物结合区域等结构，之后在模拟软件中进行 突变，预测突变体的结构和新的功能，根据所掌握 的信息，在相应的位点设计含有目标突变的引物进 行突变。方芳等 利 ［５］ 用定点突变技术对糖苷水 解 酶 家族中 ＥＧＶ （ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ Ｖ） 的 耐 热 性 进 行 改 造，在进行同 源 建 模 和 序 列 比 对 后， 将 第 ４９ 位 的 脯氨酸删除，之后将突变体导入毕氏酵母进行研究 分析， 结 果 发 现 在 ７０℃ 环 境 下 处 理 ２ｈ， 突 变 酶 ４９Ｐ （ｄｅｌ） 剩余酶活性 为 ７２．８％， 而 ＥＧＶ 剩 余 酶 活 性 只 剩 ５１．２％， 热 稳 定 性 比 ＥＧＶ 提 高 了 ２１．６％，其他酶性质与 ＥＧＶ 基 本 相 似， 这 说 明 定 点突变技术有效 地 提 高 了 ＥＧＶ 的 热 稳 定 性； 唐 自 钟等 人 ［６］ 利用定 点 突 变 技 术 对 高 酶 活 Ｆ－１０ 突 变 株
外切 型 β－葡 聚 糖 酶 （Ｅ．Ｃ ３．２．１．９１）： 也 叫 ＣＢＨ，分子量 介 于 ３８～１１８ ＫＤａ， 是 纤 维 素 酶 中 重要的组成部分，主要作用于纤维素链中的非还原 端，水解β－１－４糖苷键， 每 次 水 解 都 会 从 纤 维 素 链 上切下一个纤维二糖分子，主要的水解产物有纤维 糊精和纤维二糖。
第３期 ２０１５ 年 ６ 月
ｄｏｉ：１０．１６００６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｔｗｎｔ．２０１５．０３．０１６
台湾农业探索
Ｔａｉｗａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
纤维素酶分子改造技术研究进展
Ｎｏ．３ Ｊｕｎｅ ２０１５
柯 轶，王 娜，林俊涵
（福 建 生 物 工 程 职 业 技 术 学 院 ， 福 建 福 州 ３５００００）
第３期
柯 轶等：纤维素酶分子改造技术研究进展
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内切葡聚糖酶基 因 进 行 定 点 突 变， 将 位 于 第 ９１ 位 的赖氨酸突变为谷氨酸 （Ｋ９１Ｅ），第 ３６９位的赖氨 酸突 变 成 精 氨 酸 （Ｋ３６９Ｒ）， 构 建 了 含 有 Ｋ９１Ｅ、 Ｋ３６９Ｒ 及 Ｋ９１Ｅ／Ｋ３６９Ｒ 等 ３ 个 质 粒 的 工 程 菌， 试 验结果表明３种工程菌所产的内切葡聚糖酶在热稳 定上 都 有 所 提 高， 在 ７０℃ 下 处 理 １ｈ，Ｋ９１Ｅ 剩 余 酶 活 力 为 ３６％， Ｋ３６９Ｒ 剩 余 酶 活 力 为 ３０％， Ｋ９１Ｅ／Ｋ３６９Ｒ 剩余 酶 活 力 为 ４１％， 相 比 而 言， 原 始酶剩余酶活力仅为１２％。 在 酶 的 比 活 力 比 较 中， Ｋ３１Ｅ、Ｋ３６９Ｒ、 Ｋ３１Ｅ／Ｋ３６９Ｒ 的 比 活 力 分 别 为 ２０２Ｕ／ｍｇ、１６２．８Ｕ／ｍｇ、７７．９ Ｕ／ｍｇ， 分 别 比 原 始酶提高了 ３ 倍、２．４ 倍、１．２ 倍。 张 洪 喜 对 ［７］ 纤 维素酶ｃｅｌ １８－７进行体外定点突变，将第 ２１２位上 的 Ａｓｎ 突 变 成 Ａｓｐ 和 Ｈｉｓ， 将 第 １４０ 位 上 的 Ｈｉｓ 突变 成 Ｇｌｎ， 结 果 发 现 ｃｅｌ１８－７ Ｎ２１２Ｄ 的 最 适 ｐＨ 值由原先的 ６．０～６．５ 偏 移 到 ５．５， 在 碱 性 环 境 中 酶活降 低，ｃｅｌ１８－７ Ｎ２１２Ｈ 最 适 ｐＨ 偏 移 到 ６．５～ ７．０，在碱 性 环 境 中 酶 活 提 高，ｃｅｌ１８－７ Ｈ１４０Ｑ 最 适 ｐＨ 偏移到了５．０，对酸碱的耐受性提高了。 ２．１．２ 易 错 ＰＣＲ 易 错 ＰＣＲ 是 体 外 定 向 进 化 常 用技术之一，原理是在目标基因进行复制扩增过程 中，通过改变反应体系、加入锰离子，提高镁离子 浓度等手段，降低复制过程的保真性，随机引入突 变位点，之 后 通 过 筛 选 获 得 有 益 突 变 体。易 错 ＰＣＲ 的关 键 技 术 在 于 如 何 选 择 合 适 的 突 变 频 率， 如果突变频率过高，将导致绝大部分的突变为有害 突变，不利 于 后 期 有 益 突 变 体 的 筛 选。 易 错 ＰＣＲ 与定点突变技 术 相 比 较， 易 错 ＰＣＲ 不 需 要 预 先 知 道目的基因的序 列 （引 物 结 合 部 分 除 外）， 这 有 利 于研究人员对基因序列未知蛋白的研究。
结晶结构，在常温下不易溶于水，也不易溶于一般 的有机溶剂如乙醇、苯、丙酮等，而且其结晶结构 十分紧密，又有其他生物聚合物镶嵌在一起，大大 增加了其降解难度。
纤维素酶是能够将纤维素降解成单糖的一种复 合酶，包括内 切 葡 聚 糖 酶、 外 切 葡 聚 糖 酶 及 β－Ｄ－ 葡萄糖 苷 酶。 在 降 解 纤 维 素 方 面， 它 具 有 特 异 性 高、反应条件温和、绿色无污染等特点，是当今生 物质能研究的热点。但是在工厂化生产中，纤维素 酶也存 在 着 不 足 之 处， 例 如 不 耐 高 温、 降 解 效 率 低、易受产物抑制等，这些不足制约了纤维素酶的 进一步开发利用。分子改造为纤维素酶实现工厂化 生产提供了可能。纤维素酶分子的改造是近年来学 术界的研究热点，该技术的应用有效弥补了纤维素 酶在工业生产上的不足，使纤维素酶在降解纤维素 方面更完善。本文对近年来纤维素酶及其分子改造
受：碎片理论、原初反应假说和协同理论。其中协 同理论是多数研究人员所接受的。协同理论认为， 纤维素酶在降解纤维素的过程中，内切酶、外切酶 和葡萄糖苷酶之间相互协作，共同完成纤维素的降 解 。 ［４］ 但是这一观点也存在的两种争议：一是 认 为 在降解过程，先由 ＥＧ 从纤维素分子内部随机水解 β－１－４糖苷键，产生非还原端，之后 ＣＢＨ 从非还原 端水解产生纤维二糖，最后由 ＢＧ 水解纤维二糖产 生葡萄糖；二是认 为 在 降 解 过 程 中， 先 是 由 ＣＢＨ 水解不溶性纤维素，产生可溶性的纤维二糖和纤维 糊精，之后由 ＥＧ 水解β－１－４糖苷键产生纤维二糖， 最后由 ＢＧ 水解纤维二糖产生葡 萄 糖。 两种争议主 要是内切酶和外切酶作用的先后顺序。
收 稿 日 期 ：２０１４－１２－１５ 作者简介：柯轶 （１９８６－），女，助教，硕士，研究方向：微生物学 ．Ｅ－ｍａｉｌ：ａｋｅ８８８＠ｍｓｎ．ｃｏｍ
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台湾农业探索
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技术的研究进行了综述。
１ 纤维素酶酶系组成及其作用机理
１．１ 纤 维 素 酶 酶 系 组 成 纤维素酶主要来自于细菌和真菌，属于糖苷水
解酶类，是一类复合酶，是由多种能够水解纤维素 中β－Ｄ－糖苷 键 的 酶 组 合 而 成。 根 据 水 解 功 能 的 不 同，可以将纤维素酶中的各种酶分成三大类：内切 型β－葡 聚 糖 酶 （Ｅ．Ｃ ３．２．１．４）； 外 切 型 β－葡 聚 糖 酶 （Ｅ．Ｃ ３．２．１．９１）；β－葡 萄 糖 苷 酶 （Ｅ．Ｃ ３．２．１．２１）。
２ 纤维素酶分子改造技术
纤维素酶分子改造技 术 是 从 ＤＮＡ 层 面 上 使 得 纤维素酶编码区或者上下游调控区内的碱基发生突 变，从而改变纤维素酶空间结构，提高纤维素酶性 能或者提高纤维素酶产量。 ２．１ 提 高 纤 维 素 酶 性 能 的 分 子 改 造 技 术
提高酶性能的分子改造技术主要是改造酶催化 结构和结合域的空间结构或者是氨基酸之间的化学 键，以更好地催化纤维素的水解。常用于提高纤维 素酶性能的分子改造技术主要有定点突变技术、易 错 ＰＣＲ、ＤＮＡ 改组技术。 ２．１．１ 定点突变 定点突变技术是 Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ 发 明 的 ， 他 也 因 此 获 得 了 １９９３ 的 诺 贝 尔 奖 化 学 奖 。 在定点突变发明之前，突变株的产生是通过自然界 或者化学诱变等方法使基因发生变化，但是这些突 变方法通常时间漫长或者不定向突变。而定点突变 技术则可以让突变变得可控，是研究蛋白质结构与 功能之间关系的有效手段，是探索启动子调节位点 的有力工具，是优化、改造基因的便捷方案。定点 突变技术的基本原理是设计一对包含有目标突变的 引物，这个突变可以使单个碱基的改变，也可以使 多个碱基的改变，缺失或者增加。利用这对含有目 标突变的引物去扩增目的基因，这样拷贝后的基因 就包含了所需的突变位点。之后再利用载体将目的 片段导入宿主细胞进行 克 隆， 最 后 通 过 ＤＮＡ 测 序 技术确保目的片段已导入宿主细胞。
β－葡萄糖苷酶 （Ｅ．Ｃ ３．２．１．２１）：也称 ＢＧ，胞 内 酶 型 分 子 量 介 于 ９０～１００ ＫＤａ， 胞 外 酶 型 分 子 量 介于 ４７～７６ ＫＤａ， 主 要 作 用 是 将 短 链 的 纤 维 寡 糖 或者纤维二糖水解成葡萄糖。
１．２ 作 用 机 理 目前有三种纤维素酶水解机理被学术界普遍接
ｃａｎｃｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ
社会的发展离不开能源的供给，但是近年来全 球能源匮乏，天然气、煤炭和石油等能源储备量逐 年下降。Ｌａｈｅｒｒèｒｅ和 Ｃａｍｐｂｅｌｌ两人根据目前石油 开采情况 和 全 球 石 油 储 备 情 况 进 行 分 析， 预 测 从 ２０１０年开始，全球天然气、 石 油 的 开 采 量 将 下 降， 到２０５０年， 全 球 石 油 供 应 量 将 从 目 前 每 年 ２５ 亿 桶，降低至每年５亿桶 。 ［１］ 石油、煤炭等能源 都 是 不可再生资源，所以寻找一种可再生的能源资源迫 在眉睫。纤维素是地球上数量最多的可再生资源， 约占总生 物 量 的 ４０％， 是 一 种 很 好 的 可 再 生 生 物 质能，目前人类每年所消耗的能源仅仅是这部分能 源的１／１０［２］。如 果 可 以 利 用 生 物 转 化 技 术 将 纤 维 素转化成可利用的单糖，并通过生物发酵等后续加 工将单糖转化为乙醇等绿色能源，不仅可以缓解当 今社会的能源危机，还可以减少石油、煤炭等传统 能源燃烧带来的环境污染。但是纤维素具有稳定的
中 图 分 类 号 ：Ｑ８１４
文 献 标 志 码 ：Ａ
文章编号：１６３７－５６１７ （２０１５）０３－００６９－０４
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ
ＫＥ Ｙｉ，ＷＡＮＧ Ｎａ，ＬＩＮ Ｊｕｎ－ｈａｎ （Ｆｕｊｉａｎ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ３５００００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｉｓ ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈａｔ ｃａｎ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｉｎｔｏ ｇｌｕｃｏｓｅ．Ｉｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｍａｎｙ ｆｉｅｌｄｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｆｏｏｄ ａｎｄ ｔｅｘｔｉｌｅ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｉｅｌｄｓ．Ｉｔ ｉｓ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｏｆ ｉｍｐｏｒ－ ｔａｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｓｏｌｖｅ ｔｈｅ ｂｉｇ ｇｌｏｂａｌ ｉｓｓｕｅｓ （ｓｕｃｈ ａｓ ｅｎｅｒｇｙ ｃｒｉｓｉｓ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ，ｆｏｏｄ ｓｈｏｒｔａｇｅ ｅｔ ａｌ）．Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ ｓｏｍｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕａｓｅ，ｓｕｃｈ ａｓ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ，ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｈａｓ ｇｒｅａｔ ｓｉｇｎｉｆｉ－