有机溶剂中酶催化活性研究进展

有机溶剂中酶催化活性研究进展摘要：酶在有机溶剂中催化作用的研究日益受到重视，其应用范围也越来越广。

本文就有机介质中酶催化的影响因素进行了探讨，并归纳出提高酶活性的一系列方法，最后简要介绍了有机溶剂中酶的应用。

关键词：有机溶剂；酶催化一直以来，人们认为“生物催化必须在水溶液中进行”、“有机溶剂是酶的变性剂、失活剂”，而1984年，Klibanov[1]提出:“只要条件合适，酶在非生物体系的有机溶剂中同样具有催化功能”的理论使酶学概念发生了革命性的改变，并由此开创了非水相生物催化（非水酶学）的新时代。

1 有机溶剂中酶催化反应的优势研究表明，有机溶剂中的酶和水溶液中的酶一样具有高度的底物选择性。

此外，还有以下一些特点[2, 3]: （1）绝大多数有机化合物在非水系统内溶解度很高；（2）根据热力学原理，一些在水中不可能进行的反应，有可能在非水系统内进行；（3）有机溶剂可促使热力学平衡向合成方向（如酯合成、肽合成等）移动，如脂肪酶在水中催化脂肪水解，而在有机溶剂中则催化酯合成；（4）在有机溶剂中，所有有水参与的副反应（如酸酐水解）将受到抑制；（5）在有机溶剂中酶的热稳定性显著提高，可通过提高温度加速催化反应进行；（6）从非水系统内回收反应产物比水中容易；（7）在非水系统内酶很容易回收和反复使用，不需要进行固定化；（8）在有机溶剂中不易发生微生物污染；（9）更为重要的是，低水环境可用于稳定具有未知催化性质的构象异构体，以及在水中寿命极短的酶反应中间体。

目前，有机溶剂中酶催化的上述优势使得非水酶学研究成为生物化学、有机化学、生物工程等多种学科交叉的研究热点。

迄今发现能在有机溶剂中发挥催化功能的酶有十几种，主要集中于脂肪酶研究，催化的反应类型包括氧化、还原、酯合成和酯交换、脱氧、酞胺化、甲基化、羟化、磷酸化、脱氨、异构化、环氧化、开环聚合、侧链切除、缩合及卤代等。

2 影响酶催化活性的因素一直以来有机相酶催化的研究非常活跃，但到目前为止仍处于实验研究阶段，离工业化应用还有一定的距离，最大的原因就是酶在有机溶剂中活性较低。

一般而言，有机溶剂中的酶活性要比水溶液中低2-6个数量级。

因此，确定影响有机溶剂中酶活性的因素，设法提高有机溶剂中酶活性表达是当今酶学研究的重点。

2.1必需水有机溶剂中酶的催化必需在其分子周围有一单层水分子直接或间接地通过氢键、疏水键、静电作用、范德华力等以维持酶的活性结构，这部分水叫必需水[3]，所需水量因酶而异，表示方法也经历了多个阶段。

非水酶学发展初期，普遍采用百分水含量来表示含水量，后来Halling[4]提出了热力学水活度a w这一表示方法，因为水解平衡时，各相的a w值相等；体系的改变伴随着水活度的变化，故通过a w值可以推断酶的活性。

可通过液上气体与一干燥柱循环来调节反应介质液上水活度[5]；还可采用水活盐对来控制水活度，这种被普遍采用并行之有效。

一些对水比较敏感的有机相酶促反应（如:肽的合成），可用水模拟物代替水，目前常用的水模拟物有甲醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃等，它们对水敏性酶促反应意义特别大。

2.2 有机溶剂一般认为，有机溶剂主要从三个方面来影响酶催化活性：（1）有机溶剂影响酶反应过程中底物和产物扩散，从而间接地影响酶活性；（2）有机溶剂“剥夺”酶分子表面必需水导致酶活力下降；（3）有机溶剂直接与酶接触作用，通过破坏维持酶蛋白活性构型的氢键、疏水键等作用，抑制酶活性或使酶失活。

由于溶剂的极性能直接导致酶脱水失活，因此Colja Laane[6]采用溶剂疏水性参数LogP值来评价有机溶剂对酶的影响程度，这一参数广泛使用。

何平[7]等探寻疏水性参数（logP）不同的有机溶剂对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的影响时发现低logP(logP≤-0.24)有机溶剂在低体积分数(ψ≤10%)时可激活或稳定木瓜蛋白酶及其固定化酶活性，而在高体积分数(ψ≥30%)时对酶活有抑制作用；中logP(0.28≤logP≤1.31)有机溶剂对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性具有显著抑制作用；高logP(logP≥1.80)有机溶剂在低体积分数(ψ≤10%)时抑制木瓜蛋白酶及其固定化酶活性，但在高体积分数(ψ≥30%)时酶活性升高。

然而酶的相对反应速率与溶剂LogP之间并不呈现线性关系[8]。

据此，Zhen Yang 等提出分配系数(Partitioncoefficients，P)作为溶剂选择标准，并发现产物分配系数（Pp）与底物分配系数（Ps）比率（Pp/Ps）与酶相对反应速率之间有良好的线性关系。

分配系数直接反映底物和产物在有机溶剂中的溶剂化，故作为描述酶在有机介质中活性是十分有效的。

此外，作为有机溶剂变性强度参数变性量(Dena-ture capacity，DC)等也被用于评价有机溶剂对酶活性影响，可见，单一参数无法全面表征酶活性的变化，因此，选择有机相酶催化的有机溶剂时必须从不同方面来考虑。

2.3 酶有机溶剂中，酶的利用形式一般有三种:酶粉、化学修饰酶和固定化酶。

Giacomo Carrea[9]等人比较了脂蛋白脂酶以不同形式（酶粉、聚乙二醇（PEG）与酶粉、PEG冷冻干燥酶粉、PEG共价修饰酶、硅藻土吸附酶）加入甲苯后其酶活性的变化；结果表明，酶的形式对酶活性有极大的影响。

其中，PEG 共价修饰酶活性最高，在以乙烯基月桂酸为酰化剂时，其相对酶活性达到100%；硅藻土吸附酶活性为70%；而酶粉、PEG与酶粉酶活性均小于1%。

化学修饰酶由于改变了理化性质，提高了酶的最大反应速率和酶分子对底物的亲和力从而影响酶的活性[10]。

用糖脂修饰的SOD在有机溶剂中的酶活性甚至比水中还高。

在酶表面涂渍保护膜，降低有机溶剂与酶的直接作用也可起到提高酶活性的作用，如表面活性剂[11]、脂质等。

固定化酶在有机介质中酶活性提高，为了解释该现象，Kyeong Kyu Kim[12]研究了B. cepacia产的脂酶的晶体结构，他发现脂酶的活性中心存在一个“盖子”覆盖了脂酶的活性位点，自由酶的活性位点呈现“关闭”状态，而被固定化的酶在载体表面呈现“开放”的形式，即酶活中心的“盖子”没有覆盖酶的活性位点，酶活就获得了提高。

2.4 缓冲液酶冷冻干燥时的缓冲液对有机相酶催化活性有极重要的影响，缓冲液有四个重要因子:（1）pH；（2）缓冲液类型；（3）缓冲液的量；（4）水的浓度。

通过研究不同pH条件下冷冻干燥酶在同一有机溶剂中的酶活性表明，酶在有机溶剂溶液的催化最适pH与在水溶液中极为相近。

酶在有机溶剂中的活性取决于其冷冻干燥前最后存在过的水溶液的pH值（pH记忆效应），一般说来，如果冷冻干燥前溶解酶的缓冲溶液具有酶在水溶液的最适pH值, 那么酶的最适离子化状态将会在冷冻干燥后保持，在有机介质中表现出来的活性也最大[13]。

由于不同缓冲液对酶表面微弱的物理效应、在结晶和冷冻干燥过程中冰冻水溶液的相行为、与残余水之间相互作用、与酶或底物间相互作用等的不同使得酶活性在冷冻干燥后相差上千倍。

2.5 盐效应Yuri L. Khmelnitsky [14]等研究枯草杆菌蛋白酶在正已烷中的转酯化反应时发现：酶活性随着KCI浓度升高而急剧上升。

这种现象在其它酶中也有出现，如A-胰蛋白酶与95%KCI冷冻干燥，Kcat/Km 值可增加50倍。

学者认为盐诱导酶活性的机理有两个:盐保护酶免受有机溶剂毒害；冷冻干燥过程中，盐可以保持酶的天然构型。

后一种解释被广为接受。

Yuri L. Khmelnitsky发现，当盐浓度较低时，冷冻干燥蛋白酶构成的固体催化颗粒具有疏松结构；当盐浓度较高时，催化颗粒象盐晶体一样，具有刚性结构，对酶起保护作用。

所以，他认为酶在盐基质中之所以保持较高的酶活性，是由于盐基质对有机溶剂致使酶失活提供一种保护效应。

也有学者认为盐诱导催化活性是由冷冻干燥时间与酶水含量决定的。

酶活性随冷冻干燥时间增加而增加，水含量低于最适含量，则迅速降低。

显然不同的催化效率是基于盐的结合与冷冻干燥过程双重结果。

可见，盐效应机制有待进一步研究。

2.6 配体、冷冻干燥剂、赋形剂酶在冻干前可用配体、冷冻干燥剂为酶作印迹，使酶以一种高活性构象形式被冻干并在有机介质中得以保持，这种现象称之为分子印迹。

Alexander M. Klibanov[15]研究了四种蛋白酶和三种脂肪酶与配体共存的水溶液经冷冻干燥的酶活性，发现比没有配体的活力大大地提高。

配体增加酶活性原因在于:（1）配体对酶的印迹效应，使得酶的活性构象在固态形式或有机溶剂中得以保持，而由于水的柔性，印迹构象在水溶液中易失去；（2）配体保护酶在冷冻干燥过程中免受失活。

非配体的冷冻干燥剂如:山梨醇、木糖醇、海藻糖、甘露醇以及PEG等在酶冷冻干燥之前加入酶水溶液中，也能极大地提高酶在有机相催化活性，其作用机制与配体相同。

赋形剂与酶混合冷冻干燥后也极大地提高了酶活性，机理是基于赋形剂能缓解酶在冷冻干燥时失活，赋形剂所激发的酶活性通过用无水有机溶剂洗掉赋形剂后消失，这与配体作用机理有所不同。

2.7 超声辐射、抑制剂随着对有机相酶催化的研究深入，所知影响有机相酶催化活性因素越来越多，如:超声辐射、酶抑制剂等。

超声波作为一种机械能量形式，可以改变物质组织结构、状态及功能。

在适宜的条件下，低强度的超声辐射对酶有一定的激活作用，这种激活作用随着时间的增加而愈加明显。

目前利用超声技术对酶进行处理主要有两种方式：一种是超声预处理，即首先在超声介质中对酶进行超声处理，酶回收处理后再置于反应介质中进行酶促反应；另一种是直接对反应介质中的酶进行超声处理，超声处理与酶促反应同时进行[16]，目前普遍采用的后一种处理方式。

吴虹[17]等人在研究超声作用下的酶促废油脂转酯反应的过程中也报道了反应前对酶进行超声预处理能在一定程度上缩短酶被激活所需的时间，并使其充分激活,从而加速酶催化反应。

具有两亲特性的表面活性剂、胆汁盐、金属离子对酶活性也有一定的影响，表面活性剂在合适的浓度下，能促进酶活性及稳定性的提高，而胆汁盐和金属离子在低浓度时不仅不能提高酶活性，反而在浓度较高时，有显著的抑制作用。

这些工作有待进一步深入研究。

3 提高酶在有机溶剂中活性的策略如何提高酶在有机溶剂中的活性，促进其在工业界的广泛应用是近年来研究热点。

目前，在这方面已有不少重大突破，根据上述影响酶活性的因素及其造成酶在有机溶剂中活性显著下降主要原因，并提出了使酶在有机介质中的活性激活的一系列有效办法，其中不少方法成本低，可按比例扩大，能使酶反应速度提高102-105倍，接近其在水溶液中的酶活性。

3.1克服质量传递的限制目前，用于有机溶剂的酶制剂通常是从水溶液里经冷冻干燥制备出来的粉末/颗粒，这些酶粉悬浮在有机相里，造成底物向酶的扩散受到限制；此外，酶分子互相叠合也容易造成一些酶分子的活性中心被周围的酶分子封闭，使底物分子难以靠近。