生物技术制药第二版总结教材

生物技术制药第一章绪论要求：1、熟悉生物技术制药的基本概念2、熟悉生物技术药物的特点3、了解生物技术领域及生物制药产业的发展现状1、生物技术制药:就是利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程技术、等来研究和开发药物，用来诊断、治疗和预防疾病的发生。

2、生物技术药物（biopharmaceutics）是利用生物体、生物组织、细胞或其他组分，综合应用生物学与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的基本原理与方法加工制造而成的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。

特性药理学特性1、药理活性高2、治疗的针对性强，治疗的生理、生化机制合理，疗效可靠3、毒副作用小，营养价值高4、生理副作用常有发生理化与生物学特性1、生物材料中含量低，杂质多，分离提取工艺复杂2、生物活性物质结构复杂、稳定性差3、生物材料易染菌、腐败4、生物技术药物制剂有特殊要求3、传统生物技术的技术特征是酿造技术4、近代生物技术的技术特点是微生物发酵技术5、现代生物技术的技术特征是以基因工程为首要标志6、生物医药产业的特点：生物医药产业投资大、风险高、周期长。

收益高第二章基因工程制药基因工程的概念。

基因工程的原理和技术。

基因工程制药——6大步骤掌握：基因工程、载体的概念；基因工程的原理；常用载体和表达系统的类型。

2、熟悉：基因工程制药的基本流程；目的基因制备、链接的方法；重组基因导入宿主的方法；重组子筛选和鉴定的方法；质粒不稳定的原因、分析方法和提高稳定性的方法。

3、了解：生物技术药物的下游分离和纯化技术。

复习1. 基因工程药物制备的一般过程。

2. 基因工程常用的载体有哪些？各有什么特点？3. 获得目的基因常用的四种方法是（）、（）、（）和（）。

✓1、基因工程（g enetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后代✓2、原理：1、提高外源基因的剂量——分子遗传学原理2、筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等——分子生物学原理3、修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序列、mRNA非编码区、密码子等——分子生物学原理4、基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产——生化工程学原理3、理论方面的三个重要的发现1、生物遗传物质—DNA的发现2、DNA双螺旋结构和半保留复制机理的建立3、遗传信息传递方式的确立4、技术上三个重要成果1、基因工程的工具酶DNA连接酶限制性内切酶逆转录酶思考：被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。

逆转录酶是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶特点：逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：⑴以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链⑵具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板，催化合成cDNA双链。

2.基因工程载体3.基因的体外重组技术5、重组子转化的成功标志着基因工程的诞生。

6、基因工程的操作流程1、分：分离目的基因2、切：对目的基因和载体适当切割3、接：目的基因与载体连接4、转：重组DNA转入受体细胞5、筛：筛选出含有重组体的受体细胞6、表：目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改造生物●7、基因工程制药的基本过程获得目的基因构建运输载体组建表达系统表达系统培养产物分离纯化●8、目的基因的获得（一）从基因组中直接分离目的基因1、密度梯度离心法2、单链酶法3、分子杂交法4、酶切法直接分离目的基因（二）PCR直接扩增目的基因聚合酶链式反应高温变性低温退火适温延伸（三）反转录法合成目的基因构建cDNA文库调取基因（四）化学合成目的基因从反应机理上分为：1、磷酸二酯法2、磷酸三酯法3、亚磷酸三酯法4、自动化合成法9、—运载体的构建✓载体（Vecto r）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。

✓常用载体来源分类：1、质粒载体质粒（plasmid）:是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子。

人工质粒载体必须包括三部分：一个DNA复制起始区，两个遗传标记基因和一些限制性内切酶位点。

2、噬菌体载体λ噬菌体：（1）λ噬菌体宿主为E.coli 2）有溶原、溶菌两种生活方式：溶原方式：λDNA整合到宿主DNA进行复制；溶菌方式：可释放出λDNA进行壳蛋白包装增殖。

优点1）对外源基因的容量较大（可达20多个kb）（2）重组体DNA可在体外包裹成噬菌体颗粒，具有更高的侵染宿主能力，要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。

（3）宿主范围窄，更安全（4）可利用包装限制性（对DNA分子大小的限制）对重组子分子进行正选择，利于重组子的筛选3、病毒载体4、人工染色体载体用途分类：1、克隆载体能使插入的外源DNA序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为克隆载体。

常见:质粒、噬菌体2、表达载体使插入的外源DNA序列转录翻译，表达出多肽链，这样的载体称为表达载体。

具有复制子，筛选标记，位于多克隆位点的上下游具有转录效率较高的启动子，起始密码子和核糖体结合位点，转录终止子结构．3、穿梭载体这类载体中含有来源不同的复制子结构，既具备原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因,故能在两种受体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进行复制和表达．10、基因表达载体的构建1、用一定的_限制酶___切割质粒，使其出现一个切口，露出_黏性末端2.用__同一种限制酶___切断目的基因，使其产生__相同的黏性末端3..将切下的目的基因片段插入质粒的___切口___处，再加入适量DNA连接酶_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）11、重组工程菌的构建、筛选与鉴定●1、目的基因与载体DNA的链接1）黏性末端连接法2）钝性末端连接法3）钝性末端连接人工合成的接头4）同聚物末端连接法●2、将重组体导入宿主细胞（1）转化2）转导3）转染●3、重组子的筛选与鉴定（1）抗药性检测筛选法（2）显色检测异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）可诱导LacZ基因片段编码β-半乳糖苷酶氨基端片段,与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补，又称α互补。

当培养基中有IPTG时，使含此质粒的菌在X-gal培养基上形成蓝色菌落。

（3）限制酶切图谱检测（4）PCR扩增检测（5）原位杂交检测（6）外源蛋白质功能检测12、表达系统的构建与基因表达1、最佳的基因表达体系：生物活性高、表达产量高、表达产物稳定、表达产物容易分离纯化。

2、宿主细胞常用两大类：原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。

✓质粒的不稳定性原因1）分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。

（2）结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失而导致工程菌性能的改变。

✓质粒稳定性的分析方法1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数A；（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数B；（3）计算出B/A的比值。

该比值能够反映出质粒的稳定性。

提高质粒稳定性的方法1）分阶段培养法（2）在培养基中加入抗生素，形成选择性压力（3）通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施第三章动物细胞工程制药1、动物细胞培养技术培养方法和培养条件细胞的冻存与复苏2、动物细胞融合技术动物细胞融合的过程和方法3、单克隆抗体技术单克隆抗体的概念；单抗制备的原理和方法4、动物细胞的大规模培养1、培养的方法1、原代培养2、传代培养2、营养条件1、动物细胞的培养基的种类和组成：培养基的基本要求促生长因子激素营养成分渗透压pH 无毒、无污染培养基的基本要求1）营养成分：氨基酸单糖维生素无机离子与微量元素2）促生长因子及激素各种激素、生长因子的功能：①维持细胞的功能②保持细胞的状态（分化或未分化）3）渗透压4）pH大多数细胞适宜pH为7.2～7.4，培养基应具一定的缓冲能力5）无毒、无污染3、血清的主要成分和作用主要成分：血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等主要作用：1、提供基本营养物质2、提供激素和各种生长因子3、提供结合蛋白4、对培养中的细胞起到某些保护作用4、动物细胞合成培养基种类：1、MEM ：仅含12 种必需氨基酸、谷氨酰胺，8 种维生素及必要的无机盐，由于成分简单，易于添加某种特殊成分适于某些特殊细胞培养。

2、DMEM：在MEM 培养基的基础上研制的。

与MEM 比较增加了各种成分用量，分高糖型（低于4500g/L）和低糖型（低于1000g/L）高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难低肿瘤细胞。

3、IMDM：含有42 种成分，与DMEM 比较增加了许多非必须氨基酸及一些维生素，增加了羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），葡萄糖含量为高糖型。

适合细胞密度较低、细胞生长困难的情况，如细胞融合之后杂交细胞的筛选培养，DNA 转染后转化细胞的筛选培养。

4、RPMI1640：其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。

是目前应用最为广泛的培养基之一。

5、动物细胞的种质保存细胞的冻存与复苏冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。

1.细胞冻存2.细胞复苏：在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）✓冻存和复苏的原则：慢冻快融原因：当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶导致细胞损伤甚至死亡。

甘油或二甲基亚砜可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，可使细胞内水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

融化速度快，还可使迅速通过最易受损的-5－0度冷冻速率：慢冻（？）复苏速率：快融（？）冷冻保护剂：5－15％甘油或二甲基亚砜（DMSO）（？）冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）●为什么要加冷冻保护剂对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冻存物。