细胞种板技术
miR-802靶向调控PI3K
·论著·miR-802靶向调控PI3K/Akt信号通路促进肝细胞癌血管新生的机制研究刘文豪倪敏沈甫明金涌【摘要】目的探究miR-802在肝细胞癌（HCC）细胞中的表达及其对肿瘤血管新生的影响及作用机制。
方法通过转染miR-802 agomir、miR-802 antagomir上调或抑制人HCC细胞系SMMC-7721中miR-802的表达水平。
将SMMC-7721细胞分为NC组（正常培养细胞）、miR-802 agomir组（转染miR-802 agomir）和miR-802antagomir组（转染miR-802 antagomir）。
采用小管形成实验和Transwell实验检测过表达miR-802的SMMC-7721细胞上清液对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）成管能力及迁移能力的影响。
采用蛋白质印迹法检测miR-802 agomir组中磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平。
采用免疫荧光实验检测过表达miR-802对VEGF生成的影响。
结果与NC组相比，miR-802 agomir组HUVEC细胞的成管能力及迁移能力均显著增强，miR-802 antagomir组HUVEC细胞的成管能力及迁移能力均显著降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。
与NC组相比，miR-802 agomir组SMMC-7721细胞中VEGF生成量增加，p-PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达水平均显著升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。
结论 miR-802可通过调控PI3K/Akt信号通路促进VEGF的释放，参与血管新生，从而促进HCC的发生和进展。
【关键词】肝细胞癌；miR-802；血管新生；PI3K/Akt信号通路DOI: 10. 3969/j. issn. 1673-534X. 2024. 01. 009Mechanism of miR-802 targeting PI3K/Akt signaling pathway in promoting angiogenesisof hepatocellular carcinoma LIU Wenhao, JIN Yong. School of Pharmacy, Anhui Medical University,Hefei 230032, China; NI Min, SHEN Fuming. Department of Pharmacy, Tenth People's Hospital of TongjiUniversity, Shanghai 200072, China【Abstract】 Objective This paper attempts to investigate the expression of miR-802 in hepatocellular carcinoma cells and its effect on tumor angiogenesis and mechanism of action. Methods Theexpression of miR-802 in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 was up-regulated or inhibited by transfection of miR-802 agomir and miR-802 antagomir. SMMC-7721 cells were divided into the NC group (normal cultured cells), the miR-802 agomir group (transfected with miR-802 agomir), and the miR-802 antagomir group (transfected with miR-802 antagomir). The effects of SMMC-7721 cell supernatant overexpressing miR-802 on the tube-forming and migratory abilities of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were detected by using tubule formation assay and Transwell assay. The expression of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), phosphorylated PI3K (p-PI3K), protein kinase B (Akt), phosphorylated Akt (p-Akt), and vascular endothelial growth factor (VEGF) was detected by western blotting in the miR-802 agomir group. Immunofluorescence assay was used to detect the effect of overexpression 基金项目：上海市崇明区“可持续发展科技创新行动计划”项目（CKY2022-24）作者单位：230032 安徽合肥，安徽医科大学药学院（刘文豪、金涌）；200072 上海，同济大学附属第十人民医院临床药学部（倪敏、沈甫明）通信作者：金涌，of miR-802 on VEGF production. Results Compared with the NC group, the tube-forming and migratory abilities of HUVEC cells in the miR-802 agomir group are enhanced, and the tube-forming and migratory abilities of HUVEC cells in the miR-802 antagomir group are reduced, with statistically significant differences (P＜0.05). Compared with the NC group, the production of VEGF of SMMC-7721 cells in the miR-802 agomir group is increased, and the protein expression of p-PI3K, p-Akt, and Akt is elevated, with statistically significant differences (P＜0.05). Conclusion miR-802 can promote the release of VEGF through regulating the PI3K/Akt signaling pathway, and then participate in angiogenesis, thus promoting the occurrence and progression of hepatocellular carcinoma. 【Key words】 Hepatocellular carcinoma; miR-802; Angiogenesis; PI3K/Akt signaling pathway原发性肝癌是中国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（ICC）和混合型肝细胞癌-胆管癌（cHCC-CCA）这3种不同病理类型，其中HCC患者占75%～85%[1-2]。
生物药物研发中的细胞培养技术使用方法
生物药物研发中的细胞培养技术使用方法细胞培养技术在生物药物研发中扮演着至关重要的角色。
随着科技的不断进步和对生物药物市场需求的提高，研究人员对细胞培养技术的使用方法进行了深入研究和不断优化。
本文将详细介绍生物药物研发中常用的细胞培养技术使用方法。
一、细胞培养技术概述细胞培养技术是指将活体细胞放入细胞培养基中，经过一定的条件培养和维持来繁殖和生长。
它为药物研发提供了可控的环境，并能模拟体内生理条件，是制备大量生物药物的关键步骤之一。
二、细胞培养技术的基本步骤1.细胞株的选择：根据研究的需求和目标，选择适合的细胞株进行培养。
常见的细胞株有动物细胞、细菌细胞和真菌细胞等。
细胞株的选择应考虑其生长速度、稳定性和产物表达能力。
2.培养基的配制：根据细胞株的要求，配制适合其生长的培养基。
培养基通常由营养物质、生长因子、血清和抗生素等组成，以提供细胞繁殖和生长所需的营养和环境。
3.细胞的传代：细胞在培养基中生长到一定程度后，需要进行传代以保持其活力和生长状态。
传代的方法可以通过培养皿法、悬浮培养法等进行。
4.细胞培养条件的控制：合理的细胞培养条件对细胞生长和产物表达至关重要。
包括温度、湿度、pH值和气体成分等。
不同细胞株和表达系统对这些条件的要求有所不同，需要根据实际情况进行优化调整。
5.细胞培养过程监测与控制：细胞培养过程中的监测和控制是保证培养的稳定性和一致性的重要步骤。
监测常用的指标包括细胞密度、生长速率、细胞新陈代谢产物和细胞器官结构等。
根据实时数据，可以对培养条件进行调整以提高产物表达和培养效果。
三、常用的细胞培养技术1.传统细胞培养技术：传统的细胞培养技术主要应用于初步筛选和鉴定活体细胞株。
其操作简单，但培养周期长，细胞的生长速度较慢。
2.悬浮细胞培养技术：悬浮细胞培养技术广泛应用于生物制药领域。
悬浮细胞培养技术中，细胞以单个或成团状存在于培养基中，培养中的悬浮细胞可以快速繁殖并产生大量的生物药物。
贴壁细胞培养完整版
贴壁细胞培养HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】贴壁细胞培养一、克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法（一）用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。
5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）操作：①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。
Mix。
）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。
12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。
②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，，，饱和湿度条件培养箱内孵育μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO27天。
板种细胞问题(不均匀)
细胞不均匀的问题原因：1.培养液量少，由于瓶体内液体有向边缘吸的特性，所以造成中间低洼，细胞容易聚集，建议多加液体2.接种后不要摇晃，传统的思想认为摇一摇能使细胞均匀，但是事实上在摇晃的时候由于剪应力等多种因素的影响，细胞反而分布不均。
解决方案：1)接种到培养瓶的细胞，轻轻地让细胞悬液流遍整个瓶底；2)接种到培养皿或者培养板的细胞，用枪头对准中央加，让细胞悬液自行流遍整个孔，若有少量区域未能覆盖到细胞悬液，可用枪头轻轻牵引悬液，千万不要摇。
细胞悬液铺满后，不宜立刻放入孵箱中，我一般静置>15min，这样接种的细胞很均匀。
3)培养皿划“十”字交叉轻轻混匀（力度不易太大，否则剪切力损伤细胞），重复一次。
轻轻放入孵箱即可。
（1）平底和圆底（U型和V型）培养板的区别和选择：贴壁细胞一般用平底培养板。
悬浮型细胞的培养一般用V型。
U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞。
V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。
（2）细胞培养常见问题与解答问：我看到培养板有4、6、12、24、48、96孔几种规格，但不知道到底什么实验用哪种规格。
答：要根据你具体的实验要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，细胞爬片一般用24孔等，要具体根据你实验来定。
问：我想测吸光度用酶标仪，用多孔细胞培养板行吗？请问酶标板多孔细胞培养板有什么区别？答：用多孔细胞培养板测吸光度肯定可以拉，我们经常用它来做样品的蛋白定量和MTT检测。
区别：酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，但也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不能用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测，它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。
常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2-3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。
若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。
具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。
细胞传代、换液、给药和种板
[实验器材] 0.25%胰酶、胎牛血清、F-12培养基、PBS、培养瓶、5ml白枪头、15ml、50ml离心管[实验步骤]1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；2、将培养基、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，5、用适量PBS清洗细胞表面，并弃去PBS；6、加入适量胰酶消化细胞，此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消化；待消化完全后，用胰酶2倍体积的完全培养基中止消化，将细胞移入离心管1000rpm，5min离心；7、弃上清，加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱；8、收拾物品，整理实验台，做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，30min后关闭细胞的换液[实验器材]培养基、胎牛血清、50ml离心管、5ml白枪头、PBS(白枪头、离心管提前高压)[实验步骤]1、将培养基、PBS、离心管放入超净工作台，紫外灯照射30min。
将胎牛血清从-20℃放入37℃水浴锅内，完全溶解后拿出。
2、用50ml离心管配置适当浓度的血清培养基。
3、将细胞拿出，吸去培养基，用3mlPBS洗2次，各瓶加入4ml血清培养基。
4、整理洁净台！细胞的给药[实验器材]培养基、胎牛血清、50ml离心管、5ml白枪头、PBS(白枪头、离心管提前高压)、皮质酮、咖啡因[实验步骤]1.将培养基、PBS、离心管放入超净工作台，紫外灯照射30min。
将胎牛血清从-20℃放入37℃水浴锅内，完全溶解后拿出。
2.用50ml离心管配置适当浓度的血清培养基。
3.在15ml离心管中配置皮质酮及咖啡因浓度梯度。
4.按2ml/孔加入6孔板中，做好标记。
细胞计数方法------细胞计数板法
细胞计数方法------细胞计数板法实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。
2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104个/ml(注：当细胞很多时，可在四个格中选一定数目较平均的小格，由于每大格中有16个小格，然后计左侧和上方的细胞数，求出每小格的细胞数，取平均值m，m ×16即每个格的平均值。
所以，细胞密度=m×16×104个/ml)说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而 1ml=1000ul=1000mm3（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
）================================================细胞计数板的使用一、血球计数板-基本构造血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。
计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
HepG2细胞培养方法
HepG2细胞培养方法细胞复苏：材料：HepG2细胞、RPMI-1640、胎牛血清、PS（青霉素+链霉素）35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜试剂配制：100ml完全培养基：90mlRPMI-1640 + 10ml胎牛血清+1支PS，4℃保存步骤：1．罗口离心管加入含10%胎牛血清的完全培养基3ml.。
2．从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置37℃水浴1min至融化。
3．打开冻存管，吸取细胞悬液至离心管，轻轻混匀。
4．800rpm离心5min,弃上清。
5．细胞沉淀中加入4ml完全培养基，转入35cm培养瓶37℃常规培养，第二天观察细胞生长情况。
细胞传代与换液：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜试剂配制：100ml终止液：90mlRPMI-1640 + 10ml小牛血清+1支PS，4℃保存步骤：1．对数增长期汇合度80%-90%的细胞可以传代，4ml PBS清洗两次。
2．加入0.25%胰酶1ml,37℃孵育5min。
3．加入3ml终止液，吹打细胞使其脱落并单个化，再移至罗口离心管。
4．离心5min,800rpm，弃上清。
5．罗口离心管加入完全培养基，混匀后分瓶培养。
6．细胞隔日可以用PBS清洗后更换培养基。
细胞冻存：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、消毒的冻存管、水浴箱、计时器、离心机、过滤器、光学显微镜试剂的配制：10ml冻存液：7ml完全培养基+2ml胎牛血清+1ml DMSO,混匀后过滤，4℃保存步骤：1．去除培养瓶中旧的培养基，加入4ml PBS清洗两次。
2．混匀胰酶，每瓶加入1ml,37℃孵育5min。
细胞种板技术
1、用排枪加,不要太快,中速即可;
2、加的过程中,每加3排细胞时晃动一下装有细胞悬液的器皿,防止细胞在未
加到板子上时就沉底了重要;
3、加完细胞后不要做任何拍打96空板的操作,直接慢慢平移到培养箱内即可;
4、以后换液或加药时,枪头不要抵触到孔的底部,加到侧壁即可;
5、种细胞时横排接种,加药时纵向加药,这样可以有效的避免因接种细胞不均
匀造成的误差;
6、96孔板加完细胞后不能晃动,但是24孔板最好混匀一下
2、新方法：这种方法简直是太好了,种的很均匀;先用抢将吹打均匀的细
胞吸起来,让后将枪头紧
贴着孔的一侧壁注意枪头的尖不要接触孔底,然后将枪头中的细胞缓缓的打下去,种好之后千万
不要摇晃板子,直接放到显微镜下看就可以了,此方法可以说是100%的有效吧;
希望对大家有帮助;从6孔板到96空板要细胞分散均匀,先用培养基把细胞稀释好,再把培养板放在适当的位置,加入细胞时和加入细胞后不移动培养板；如果空中有的地方没有培养基可吹打,但不要移动培养板,加入细胞后静置20-30分钟再移入培养箱;这样细胞一般都能长的很均匀;当然,前提是细胞消化的很好;。
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细胞种板技术
Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】
1、用排枪加，不要太快，中速即可。
2、
3、2、加的过程中，每加3排细胞时晃动一下装有细胞悬液的器皿，防止细胞在未加到
板子上时就沉底了（重要）。
4、
5、3、加完细胞后不要做任何拍打96空板的操作，直接慢慢平移到培养箱内即可。
6、
7、4、以后换液或加药时，枪头不要抵触到孔的底部，加到侧壁即可。
8、
9、5、种细胞时横排接种，加药时纵向加药，这样可以有效的避免因接种细胞不均匀造
成的误差。
6、96孔板加完细胞后不能晃动，但是24孔板最好混匀一下
2、新方法：这种方法简直是太好了，种的很均匀。
先用抢将吹打均匀的细胞吸起来，让
后将枪头紧
贴着孔的一侧壁（注意枪头的尖不要接触孔底），然后将枪头中的细胞缓缓的打下去，种好之后千万
不要摇晃板子，直接放到显微镜下看就可以了，此方法可以说是100%的有效吧。
希望对大家有帮助。
从6孔板到96空板要细胞分散均匀，先用培养基把细胞稀释好，再把培养板放在适当的位置，加入细胞时和加入细胞后不移动培养板；如果空中有的地方没有培养基可吹打，但不要移动培养板，加入细胞后静置20-30分钟再移入培养箱。
这样细胞一般都能长的很均匀。
当然，前提是细胞消化的很好。